17 MONOGRAFÍAS DR, ANTONIO ESTEVE · 17 monografÍas dr, antonio esteve farmacologÍa de los canales iÓnicos a.g. garda fundaciÓn •lie dr antonio ¡esteve

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MONOGRAFÍAS DR, ANTONIO ESTEVE

FARMACOLOGÍADE LOS CANALES

IÓNICOSA.G. Garda

FUNDACIÓN • l i e DR ANTONIO¡ESTEVE

© 1995, Fundación Dr. Antonio EsteveISBN 84-605-2808-1Depósito lega!; B-21671-95Coordinación y producción:Ediciones Doyma, S.A.Travesera de Grada, 17-21/08021 BarcelonaImpreso en España por Gráficas AlmogávaresPrinted in Spain

La Fundación Dr. Antonio Estevecontempla como objetivo prioritarioel estímulo del progreso de la terapéuticapor medio de la comunicacióny la discusión científica.La Fundación quiere promoverla cooperación internacional en lainvestigación farmacoterapéutica y, a talfin, organiza reuniones internacionalesmultidiscipíinarias donde gruposreducidos de investigadores discutenlos resultados de sus trabajos.Estas discusiones son recogidasen las publicaciones de los «EsteveFoundation Symposia».Otras actividades de la FundaciónDr. Antonio Esteve incluyenla organización de reuniones dedicadasa la discusión de problemas de alcancemás local, así como las conferenciasperiódicas «Dr. Antonio Esteve» y otrasformas de apoyo a las ciencias médicas,farmacéuticas y biológicas.

Farmacología de los canales iónicos

A.G. GARCÍA

Introducción

M. CRIADO, M. GARCIA-GUZMÁN, F. SALA,

S. SALA y A. CAMPOS-CARO

El receptor nicotínico de acetllcolina:estudios sobre el reconocimientoy ensamblaje de subunidades

Canales activados por glutamato

Canales de K+

del calcioen la señal celular

11J. LERMA, A.V. PATERNAIN, N. SALVADOR,

F. SOMOHANO, M. MORALES y M. CASADO

17F. BARROS, D. DEL CAMINO, L.A. PARDO

y P. DE LA PEÑA

27B. SORIA

Canales de potasio sensibles a ATP.Sulfonilureas y activadores de canalesde potasio 37

J. LÓPEZ BARNEO

Canales de potasio regulados por oxígeno 43

J. TAMARGO

Canales de sodio sensibles a voltaje:implicaciones farmacoterapéuticas 53

C. GONZÁLEZ-GARCÍA, R. GRANJA,

J.M. FERNÁNDEZ, V. IzAGUiRREy V. CEÑA

Posibilidades de manipulación farmacológicade los canales de potasio 63

L. GANDÍA, A. ALBILLOS, M.G. LÓPEZ y B. LARA

Diversidad de canales de calciovoltajedependientes 69

J. GARCÍA-SANCHO

Canales de calcio sensibles a segundosmensajeros 79

C, SUNKEL, M. FAU DE CASA-JUANA, L. SANTOS,

M.M. GÓMEZ, J. PRIEGO, M.P. ORTEGA

y A. GARCÍA

Relación estructura química-actividadfarmacológica de los moduladoresde los canales de calcio 87

A.G. GARCÍA, A. ALBILLOS, L. GANDÍA, B. LARA,

M.G. LÓPEZ y M. VILLARROYA

La señal celular del calcio: implicacionesfisiológicas y farmacoterápicas 95

Relación de participantes A. ALBULOSDepartamento de Farmacologíay TerapéuticaFacultad de MedicinaUniversidad AutónomaArzobispo Morcillo, s/n28029 Madrid

F. BARROSDepartamento de Biología FuncionalÁrea de Bioquímica y Biología MolecularFacultad de MedicinaUniversidad de OviedoJulián Clavería, s/n33006 Oviedo

J. BlGORRADepartamento de Investigacióny DesarrolloQuímica Farmacéutica Bayer, S.A.Calabria, 26808029 Barcelona

W. BUÑOInstituto CajalConsejo Superior de Investigaciones CientíficasAvda.Dr. Arce, 3728002 Madrid

V. CEÑADepartamento de Farmacologíay TerapéuticaUniversidad de AlicanteCampus de San JuanApdo. 37403080 Alicante

M. CRIADODepartamento de NeuroquímicaUniversidad de AlicanteCampus de San JuanApdo. 37403080 Alicante

E. DEL POZODepartamento de Farmacologíay TerapéuticaFacultad de MedicinaUniversidad de GranadaAvda, de Madrid, s/n18012 Granada

S. ERILLFundación Dr. Antonio EsteveLlobet i Vall-Llosera, 208032 Barcelona

J.E. ESQUERDADepartamento de Ciencias BásicasMédicasUniversidad de LéridaAvda. Alcalde Rovira Roure,4425196 Lérida

L. GANDÍADepartamento de Farmacologíay TerapéuticaFacultad de MedicinaUniversidad Autónoma de MadridArzobispo Morcillo, s/n28029 Madrid

A.G. GARCÍADepartamento de Farmacologíay TerapéuticaFacultad de MedicinaUniversidad AutónomaArzobispo Morcillo, s/n28029 Madrid

M. GARCÍA-LÓPEZDepartamento de Farmacologíay TerapéuticaFacultad de MedicinaUniversidad AutónomaArzobispo Morcillo, s/n28029 Madrid

J. GARCÍA-SANCHODepartamento de Bioquímicay Biología Molecular y FisiologíaFacultad de MedicinaUniversidad de Valladolid47005 Valladolid

R. GlLABERTLaboratorio de NeurofisiologíaFacultad de MedicinaAvda. Diagonal, 64308028 Barcelona

C. GONZÁLEZDepartamento de Bioquímicay Biología Molecular y FisiologíaFacultad de MedicinaUniversidad de Valladolid47005 Valladolid

A. GUALLaboratorio de NeurofisiologíaFacultad de MedicinaAvda. Diagonal, 64308028 Barcelona

X. GUITARTDepartamento de FarmacologíaSistema Nervioso CentralLaboratorios Dr. Esteve, S.A.Avda. Virgen deMontserrat, 22108041 Barcelona

M. HURLÉDepartamento de Farmacologíay FisiologíaFacultad de MedicinaUniversidad de CantabriaCardenal Herrera Oria, s/n39011 Santander

J. LERMADepartamento de PlasticidadNeuronalInstituto CajalConsejo Superior deInvestigaciones CientíficasAvda. Dr. Arce, 3728002 Madrid

J. LÓPEZ BARNEODepartamento de Fisiología:Fisiología Médica y BiofísicaFacultad de MedicinaUniversidad de SevillaAvda. Sánchez Pizjuán, 441009 Sevilla

J. MARSALDepartamento de BiologíaCelulary Anatomía PatológicaFacultad de MedicinaUniversidad de BarcelonaCasanova, 14308036 Barcelona

C. MONTIELDepartamento de Farmacologíay TerapéuticaFacultad de MedicinaUniversidad AutónomaArzobispo Morcillo, s/n28029 Madrid

F. SALADepartamento de Farmacologíay TerapéuticaUniversidad de AlicanteCampus de San JuanApdo.37403080 Alicante

P. SÁNCHEZ-GARCÍADepartamento de Farmacologíay TerapéuticaFacultad de MedicinaUniversidad AutónomaArzobispo Morcillo, s/n28029 Madrid

B. SORIADepartamento de FisiologíaFacultad de MedicinaUniversidad de AlicanteCampus de San JuanApdo. 37403080 Alicante

C. SUNKELDepartamento de InvestigaciónLaboratorios AlterMateo lnurria,3028016 Madrid

J. TAMARGOInstituto de Farmacologíay ToxicologíaConsejo Superior deInvestigaciones CientíficasUniversidad Complutense deMadridFacultad de Medicina28040 Madrid

M. VALDEOLMILLOSDepartamento de FisiologíaInstituto de NeurocienciasUniversidad de AlicanteCampus de San JuanApdo.37403080 Alicante

C. VALENZUELADepartamento de FarmacologíaInstituto de Farmacologíay ToxicologíaConsejo Superior deInvestigaciones CientíficasUniversidad Complutense28040 Madrid

Introducción

En el otoño de 1993, el Prof. Sergio Erill, di-rector de la Fundación Dr. Antonio Esteve, mesugirió la idea de organizar una reunión de tra-bajo sobre la «Farmacología de los canales ióni-cos». La reunión vio la luz en la primavera bar-celonesa de 1994. Fruto de las 11 ponenciasy de las discusiones que siguieron a cada unade este nuevo libro de la ya amplia colecciónMonografías Dr. Antonio Esteve.

La temática de canales iónicos es amplísima.Esta explosión de conocimientos se debe al de-sarrollo de dos poderosas herramientas meto-dológicas, las técnicas de patch-clamp y las degenética molecular. La diversidad de canalesiónicos, además, ha podido enriquecerse conla aportación de herramientas farmacológicas,fundamentalmente en forma de toxinas proce-dentes de caracoles marinos, arañas, abejas,alacranes, serpientes y plantas, capaces de re-conocer selectivamente canales de sodio (tetro-dotoxina), de calcio (co-conotoxina GVIA), o depotasio calcio-dependientes (apamina, charib-dotoxina). Y, lo que es aún más importante, es-tas poderosas herramientas farmacológicas soncapaces de identificar subtipos de canales parauna misma especie iónica. Por ejemplo, en elcaso de los canales de calcio neuronales, la u-conotoxina IVA para los P, y la w-conotoxinaMIIVC para los Q.

Esta diversidad de canales iónicos constitu-ye la base de la comunicación entre células demuy diversa estirpe, que se valen para ello deun lenguaje basado en la alternancia de señaleseléctricas (potenciales de acción) y químicas(neurotransmisores, hormonas). Las posibilida-des que existen para modificar farmacológica-mente esta comunicación son, pues, enormes.Por ejemplo, los bloqueadores de calcio del sub-tipo L (nifedipino, verapamilo, diltiazem) ya tie-nen un puesto bien ganado en la farmacotera-pia de la hipertensión o en la isquemia

coronaría. Por otra parte, los inhibidores de ca-nales de sodio (lidocaína, quinidlna, lamotrigi-na) o del potasio (amiodarona) se utilizan comoantiarrítmicos o antiepilépticos y los inhibidoresde canales del potasio sensibles a ATP (gliben-clamida) se explotan para tratar la diabetes. Sinembargo, existen todavía una pléyade de inter-venciones farmacológicas por investigar, porejemplo en cuanto a los subtipos de los cana-les de calcio o de potasio neuronales, cardía-cos o vasculares, incluyendo activadores y blo-queadores de dichos canales.

La ¡dea de la reunión de trabajo tenía por ob-jetivo último perfilar esas posibilidades terapéu-ticas. Por ello, invitamos como ponentes a cien-tíficos implicados en química médica y en eldesarrollo de nuevos fármacos (Carlos Sunkel),a biólogos moleculares (Manuel Criado), a bio-químicos (Javier García Sancho), fisiólogos (JuanLerma y José López Barneo), oiofísicos (Fran-cisco Barros y Bernat Soria) y farmacólogos(Juan Tamargo, Valentín Ceña y Luis Gandía).También Invitamos, hasta completar una largatreintena, a otros destacados especialistas bio-químicos, biólogos moleculares, fisióíogos, neu-robiólogos, farmacólogos y farmacólogos clínicosa fin de que aportaran sus ideas y experienciasen los vivos y amplios debates que siguieron acada ponencia. Estos debates fueron tan impor-tantes e interesantes como las ponencias y porello los hemos recogido aquí lo más escrupulo-sa y fidedignamente posible.

No están recogidos aquí ni todos los canalesiónicos ni todos los científicos que en Españatrabajan este tema y que gozan de reconoci-miento internacional. Teníamos que movernosdentro del generoso marco que nos ofreció laFundación Dr. Antonio Esteve y no dio para más.La riqueza del tema y del número de investiga-dores españoles que lo estudian quizá permitaplantear otras reuniones de trabajo en el futuro.

FARMACOLOGÍA DE LOS CANALES IÓNICOS

Esta monografía es el resultado de la colabo-ración de muchos. A ponentes y participantesquiero enviarles desde aquí mis más expresivasgracias por su generosa colaboración. Deseodestacar también la cuidadosa labor editorial deJuan Bigorra, especialmente en lo que se refie-re a la transcripción de los debates, que tantoenriquecen nuestra actividad científica. Y, porúltimo, pero no por ello menos imoortante, agra-dezco el sentido y orientación rigurosamentecientíficos que Sergio Erill, desde la FundaciónDr, Antonio Esteve, ha sabido dar a esta activi-

dad tan importante para la comunicación entrelos distintos especialistas que en España nos de-dicamos al estudio de los canales iónicos, desu farmacología y de sus posibles perspectivasterapéuticas para la prevención, alivio o cura-ción de las enfermedades del hombre.

A.G. GarcíaDepartamento de Farmacología

y Terapéutica.Facultad de Medicina.

Universidad Autónoma de Madrid.

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El receptor nicotínico de acetilcolina:estudios sobre el reconocimiento y ensamblaje

de subunidadesM. Criado3, M. García-Guzmán3, F. Salab, S. Salac y A. Campos-Caro3

Departamento de 'Neurocuímica, ''Farmacología y 'Fisiología.Instituto de Neurociencias. Universidad de Alicante.

Introducción

Los receptores asociados a canales iónicosconstituyen una clase de proteínas de membra-na esenciales en la transducción rápida deseñales1. La propiedad que mejor define a estetipo de receptores es que el neurotransmisorcontrola la apertura del canal al unirse a un si-tio del receptor. La estructura que caracterizalos receptores asociados a canales iónicos es lade un oligómero que forma un poro a travésde la membrana (fig. 1). Existen diversos tiposde receptores, según el neurotransmisor que losactiva: acetilcolina (tipo nicotínico), ácido 7-aminobutíríco (GABA*), glicocola, serctonina(5-HT3) y glutamato (tipos NMDA y noNMDA23).

Gran parte de la información estructural y fun-cional que se posee sobre estos receptores seha obtenido a partir del receptor nicotínico deacetilcolina (AChR) presente en la unión neuro-muscular y en el órgano eléctrico de algunospeces .̂ El AChR de! músculo esquelético estáconstituido por 5 subunidades que atraviesanla membrana, denominadas a, ¡3, y 5 en una es-tequiometría a2¡3yS. El AChR de tipo neuronales también un pentámero pero formado de otrassubunidades (subunidades con sitio de uniónde agonistas a2-ae y subunidades estructurales(32-|S4)

E. En cada subunidad se han detectadohasta 4 fragmentos hidrofóbicos que, plegadosen forma de a-hélice, podrían atravesar la mem-brana (fig. 1). Aunque existen, al menos, 15 sub-unidades distintas, todas ellas poseen una es-tructura primaria homologa y una organizaciónestructural similar: un dominio extracelular quecomprende la zona aminoterminal de cada sub-unidad, tres fragmentos transmembranales, unazona citoplásmica y un cuarto fragmento trans-membranal con un corto segmento carboxilo-terminal (fig. 1). Dentro de cada una de las áreasseñaladas existen otros elementos a destacar:

Sitios deglicosilación

Ladoextracelular

V///ALadocitoplásmico

Parte del \sitio de \unión vde agonistas\

ro\iónico

W//ASitios defosforilación

Fig. 1. Representación esquemática de la estructurade un receptor ionotrópico. En la parte superior dela figura puede observarse la organización estructu-ral de un monómero de receptor formado por 5 sub-unidades. Todas las subunidades contribuyen de for-ma equivalente a la formación del monómero. Se creeque la sección más angosta del canal está formadapor los fragmentos transmembranales de cada sub-unidad, que en la ilustración se indican como cilin-dros estrechos incluidos dentro de cilindros más an-chos, que representan cada subunidad. En la parteinferior se resumen las principales características es-tructurales de cada subunidad, haciendo especial re-ferencia a la subunidad a, que es la que contiene e¡sitio de unión de agonistas y a los fragmentos trans-membranables M:-M4.

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Ven el dominio extracelular un par de cisteí-nas separadas por 15 residuos, que forman unpuente disulfuro, y que se consideran un signoestructural típico de los receptores ionotrópicos.También se ha localizado en la zona extracelu-lar el sitio de unión de agonistas; 2) dentro delos segmentos transmembranales, el segundode ellos, que es el más polar, parece estar di-rectamente implicado en la formación del poroiónico. A la entrada del mismo hay aminoácidoscargados negativamente, y 3) en la zona cito-plásmica, la más variable entre las distintas sub-unidades, existen sitios de fosforilación especí-ficos para diversas cinasas6.

Dado el gran número de subunidades que sehan caracterizado hasta el momento, las posi-bles combinaciones que pueden obtenerse sonmuy numerosas. Averiguar cuáles son las com-binaciones que producen receptores ¡n vivo yqué mecanismos determinan la formación dedeterminadas combinaciones, su función y sulocalización son retos que la investigación sobrereceptores ionotrópicos tiene planteados en laactualidad.

Modelo experimental

Las subunidades del receptor nicotínico neu-ronal denominadas a3 y a7 se expresan en lacélula cromafín de la médula adrenal, forman-do parte, cada una de ellas, de un diferente sub-tipo de receptor. Esto implica que cada subuni-dad debe poseer dominios de reconocimientoespecífico que determinen qué subtipo de re-ceptor han de formar. De hecho, estas subuni-dades, que han sido clonadas y secuenciadasen nuestro laboratorio78, tienen distintos reque-rimientos de ensamblaje al ser expresadas ensistemas heterólogos, como es el oocito de Xe-nopus. Así pues, mientras que la subunidad c¿3necesita ensamblarse con subunidades estruc-turales para producir un receptor funcional, lasubunidad a7 es capaz, por sí sola, de produ-cir receptores homoméricos. Hemos aprovecha-do este comportamiento diferente, que puedeser el reflejo de la existencia de esos dominiosde reconocimiento que anteriormente se men-cionaban, para diseñar un sistema modelo quepermita abordar el estudio de los mismos. Di-cho sistema consistió en la construcción de sub-unidades quiméricas a3/a7 y su posterior ex-presión en oocitos, examinando su capacidadde generar receptores homoméricos. El ensam-blaje de homómeros funcionales se siguió mi-diendo la fijación de a-bungarotoxina (a-Bgt) ala membrana externa de los oocitos y las corrien-

tes producidas al activar los receptores con ni-cotina. De esta forma, sería posible detectar re-ceptores adecuadamente ensamblados que hanseguido un proceso de maduración correctodesde el retículo endoplásmico a la membranaplasmática. Por el contrario, las subunidadesmal ensambladas serían retenidas intracelular-mente y degradadas9.

Para la construcción de las quimeras a3/a7 seseleccionaron varios dominios estructurales (véa-se esquema de la subunidad a7 en la fig. 2)que se describen a continuación. El primer do-minio (dominio 0) estaba constituido por el pép-tido señal de la subunidad a7 y una pequeñazona de la región 5' no codificante de la mismasubunidad. Todas las quimeras contienen dichodominio, de forma que un posible efecto en laexpresión debido al mismo sería idéntico paratodas ellas y no afectaría el resultado final. Estaprecaución fue tomada debido a que en otroscasos se ha observado que la región 5' no codi-ficante y/o el péptido señal pueden influir en losniveles de expresión. El dominio 1 comprendíalos primeros 126 aminoácidos de cada subuni-dad, llegando justo hasta un puente disulfuro,sin incluirlo, que está presente en todas las sub-unidades de todos los receptores ionotrópicoscaracterizados hasta el momento. El dominio 2se extendía desde este puente disulfuro hastael aminoácido 205, justo antes del primer seg-mento transmembranal Mj. El dominio 3 com-prendía el segmento Mi y la pequeña zona ni-el rofílica que lo conecta al segmento M2. Porúltimo, la región del carboxilo terminal, incluyen-do la zona citoplasmatica variable y el fragmentohidrofóbico M4, constituyó el dominio 4 (fig. 2).

Resultados

Previamente otros grupos han demostradoque la región N-terminal hidrofílica de los recep-tores ionotrópicos es responsable del reconoci-miento entre subunidades10'" y de la formaciónde homómeros12. Por tanto, comenzamosnuestro análisis con una quimera que era total-mente a3, excepto por el dominio 0 de a7, yposteriormente incluimos gradualmente en lamisma los dominios correspondientes a la sub-unidad a7. Como era de esperar, la subunidada3 por sí sola era incapaz de producir recepto-res homoméricos (fig. 2, construcción Cl), mien-tras que la subunidad c¿7 sí que producía re-ceptores capaces de unir a-Bgt y activarse alañadirles nicotina. Como puede observarse enla figura 2, los valores obtenidos con la subuni-dad a7 son considerados como referencia para

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EL RECEPTOR NICOTÍNICO DE ACETILCOUNA: ESTUDIOS SOBRE EL RECONOCIMIENTO Y ENSAMBLAJE DE SUBUNIDADES

todos los demás. La inclusión del dominio 1 nosupuso una mejora en la expresión (fig. 2, cons-trucción C2). Hay que indicar que el sitio de fi-jación de a-Bgt se ha localizado en el dominio2 de la subunidad a7, y al tener las quimerasCl y C2 el dominio correspondiente de la sub-unidad o¿3, que no tiene capacidad de unir latoxina, se esperaba que estas quimeras, inclu-so formando un receptor funcional, fueran in-capaces de presentar fijación de a-Bgt, comoasí sucedió. Sin embargo, en caso de expresarun receptor funcional deberían producir corrien-tes, y esto tampoco ocurrió. Al extender al do-minio 2 la secuencia de la subunidad a7 (fig. 2,construcción C3) se pudieron detectar recepto-res, tanto de fijación de a-Bgt como de corrien-tes activadas por ligandos colinérgicos. No obs-tante, el nivel de expresión de receptoresfuncionales era bajo, lo que indica que hacíanfalta otros dominios para obtener un ensamblajeóptimo. Dado que la zona correspondiente a losfragmentos transmembranales está bastanteconservada entre las distintas subunidades, seconsideró la posibilidad de que los dominios ne-cesarios podrían estar en la zona del carboxiloterminal, que como ya se ha indicado, es la másvariable entre subunidades. Sin embargo, al in-cluir en la correspondiente quimera el dominio4 de la subunidad a7 (fig. 2, construcción C4)no se obtuvo mayor nivel de expresión. Este re-sultado nos indujo a analizar la zona correspon-diente a los segmentos transmembranales, y co-menzamos añadiendo el primer segmento M,(dominio 3, fig 2, construcción C5). La expre-sión de receptores se incrementó espectacular-mente, por encima incluso de la obtenida conla subunidad a7. Esta subunidad quimérica re-sultó muy interesante, ya que si bien era capazde generar receptores que unían a-Bgt, estosno producían corrientes al activar con nicotina.El hecho de que esta quimera posea el fragmen-to IVh de la subunidad a7 y el M2, consideradoformador del poro, de la subunidad a3, puedeser que provoque de alguna forma la interrup-ción de la necesaria comunicación entre el si-tio de fijación de agonistas y el mecanismo deapertura del canal. Por tanto, podía concluirseque el segmento hidrofóbico Mi era indispen-sable para el ensamblaje de homómeros. Sinembargo, y dada la estrategia de selección delas quimeras que se utilizó, quedaba por con-testar la siguiente pregunta: ¿ya que se ha com-probado que los dominios 1 y 2 no son suficien-tes para producir la homooligomerización, sonestos, al menos, necesarios para la misma? o,en otras palabras, ¿es suficiente el fragmento

Quimera

a7

Cl

C2

C3

C4

C5

C6

C7

Estructura

j 0

4

r~y 6ILHVSLQISDAEHRI6Q o . x péptido

(T^>__—121IPGIFKSISCKIDVI132C J _ , $ac¡j vpuenteU j l l H / disulfuro

f ^> /200IPTVSIRIRLPLFYI213Q ¿ - NarlJ L M ,

G^> 297IVHYRTPIDGGKMPI306

rr\ /237IGEKISL CISVLL 1250

'3é i> M2C i^-121IPAIFKSI SCYIDV 1132O J J X ^ SaclJ -̂puenteA J p H r disulfuro

(TO- ^2021 YSLYtR t RRTLYY 1211Q o s . x , NarlJ L M,

Fijacióndea-Bgt

(%)

100±10

1,2\

0,2

2,7±

0,6

13,4-i-

\1

11,0

0*8

200+17

3,2+

0,8

2,3±

0,3

Corriente(%)

100+17

0

0

5,1+1,6

3,3+1,1

0

0

88,3±

15,1

Fig. 2. Estructuras de las quimeras a3/a7 construidasy resultados obtenidos con las mismas. En cada línease indica el nombre de la correspondiente quimera,la estructura de la misma y los datos de fijación dea-Bgt y de corrientes iónicas obtenidos cuando elARNcorrespondiente a cada subunidad se inyectó en ooci-tos de Xenopus. La primera construcción es la sub-unidad a7, que incluye los dominios estructurales(numerados 0 a 4) seleccionados para construir lasdiferentes quimeras y dos sitios de restricción (Sacly Narl) utilizados en dicha construcción. En cada qui-mera se indican sombreados los dominios correspon-dientes a la subunidad a7, mientras que en blancoestán los correspondientes a la subunidad a3. Tam-bién se indica a la derecha del esquema de cada cons-trucción la secuencia de aminoácidos de la zona co-rrespondiente a la unión a3/a7 de cada quimera, asicomo algunas características de la misma, que pue-den ser de utilidad para facilitar su localización. Tam-bién en este caso los aminoácidos sombreados per-tenecen a la subunidad a7 y los señalados en blancoa la a3. La construcción de las quimeras se llevó acabo aprovechando los sitios de restricción señaladosque eran comunes a las dos subunidades (Sacl) o seintrodujeron por mutagénesis (Narl), y también pormétodos publicados14.

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M I para dirigir la formación de receptores ho-moméricos? Para ello construimos las quimerasC6 y C7, partiendo de la subunidad a7, y sus-tituyendo dominios 1 y 2 por los correspondien-tes de la subunidad a3. Al sustituir el domino1 de la subunldad a7 por el correspondientede la subunldad a3 (fig. 2, construcción C6) seobservó que no había ensamblaje de recepto-res funcionales y, por tanto, este dominio era Im-prescindible. Por el contrario, el dominio 2 noparecía tan Importante, porque al sustituirlo enla subunldad a, por su equivalente de la sub-unidad a3 (fig. 2, construcción C7), se seguíanexpresando altos niveles de receptores funcio-nales, que se activaban por agonistas. Como seha Indicado anteriormente, sólo el dominio 2 dela subunidad a7 contiene el sitio de unión dea-Bgt, y esta quimera poseía el correspondien-te de la subunldad a3, por lo que era de espe-rar que no fuera capaz de unir la toxina, comosucedió.

Conclusión

La expresión en una célula Individual de dife-rentes subtipos de neurorreceptores formadospor subunidades diferentes pero homologas exi-ge la existencia de mecanismos capaces de con-trolar la identificación y la interacción específi-cas de las subunidades que conformarán lasdistintas especies moleculares. Como abordajeinicial hacia la determinación de la contribuciónde los dominios específicos de reconocimientoentre subunidades hemos estudiado el compor-tamiento de proteínas quiméricas compuestasde subunidades que se caracterizan por reque-rimientos de ensamblaje diferentes. Nuestros re-sultados Indican que existen dos dominios Im-portantes en el reconocimiento de subunidades.El primero es la zona amlnotermlnal, cuya Im-portancia ya había sido destacada por otrosinvestigadores1012. El otro dominio es el primerfragmento transmembranal, que hemos recono-cido por primera vez como imprescindible. ¿Esposible postular una Interacción alostérlca en-tre estos dos dominios? El plegamiento de la ca-dena peptídica comienza en cuanto el dominioamlnoterminal emerge de la bicapa lípídica unavez atravesada la membrana del retículo endo-plásmico. El plegamiento inicial del1 dominio 1podría conducir al plegamiento cooperativo deldominio 3, estableciéndose así un mecanismode ensamblaje adecuado para producir la aso-ciación homomérica. Este sistema de recono-cimiento podría ser más general y trascendermás allá de los receptores ¡onotróplcos. Recien-

temente se ha demostrado que el primer frag-mento transmembranal de los canales de pota-sio dependientes de voltaje es esencial enprocesos de ensamblaje de canales funciona-les en asociación alostérica con un dominio aml-notermlnal13.

Agradecimiento

Este trabajo ha sido posible gracias al apoyodel Ministerio de Educación y Ciencia (DGICYT,proyectos PM89-0020 y PB92-0346) y de la Co-misión de la Comunidad Económica Europea(proyecto SCI*CT91-0666). M. García-Guzmánfue becario predoctoral del Ministerio de Edu-cación y Ciencia.

BIBLIOGRAFÍA

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EL RECEPTOR N1COTÍNICG DE ACETILCOUNA: ESTUDIOS SOBRE EL RECONOCIMIENTO Y ENSAMBLAJE DE SUBUNIDADES

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14. Herlltze S, Koenen M. A general and rapld muta-genesis method uslng polymerase chain reaction.Gene 1990; 91: 143-147.

DISCUSIÓN

C. GONZÁLEZ: Querría preguntarle si en los culti-vos de células cromafines bovinas ha obser-vado alguna modificación en la densidad o enel número total de receptores y específicamen-te de los que ligan alfabungarotoxina, en tiem-pos sucesivos o en tiempos crecientes.

M. CRIADO: Esto no lo hemos estudiado, peroexisten datos referidos a receptores neuro-nales que demuestran que si las células secultivan en presencia de ligandos, ya seanagonistas o antagonistas, se produce unaregulación que se da en unas tres vecesmás de sitios de unión de alfabungarotoxi-na.

P. SÁNCHEZ-GARCÍA: Clásicamente los farmacólo-gos hemos distinguido los receptores nicotí-nicos ganglionares, los receptores nicotínicosneuromusculares y los receptores nicotíni-cos en el sistema nervioso central. ¿Los nico-tínicos ganglionares son idénticos a los re-ceptores ubicados en el sistema nerviosocentral?

M. CRIADO: Actualmente se está comprobandoque los distintos receptores nicotínicos difie-ren en sus subunidades componentes. Porejemplo, en el sistema nervioso central, lacomposición más común es a4-/32, es decir,las unidades aA con las unidades @2 formanun pentámero, son receptores presinápticos.En los receptores ganglionares del sistemanervioso periférico, por ejemplo de la célulacromafín, la composición de subunidades di-fiere. Estamos estudiando la célula cromafín,y hemos encontrado que no contiene unida-des a2 ni a4 sino que es a3 la subunidad queune agonistas y también hemos detectado lasubunidad /34. Hay otra subunidad que esla subunidad ab, que no sabemos si tambiénforma parte o no de estos receptores. Ello ex-plica las diferencias de los receptores en cuan-to a las propiedades electrofisiológicas, y tam-bién en cuanto a sensibilidad de agonistas.

C. MONTIEL: ¿Existen diferencias funcionales en-tre los receptores que fijan alfabungarotoxinay los que no la fijan?

M. CRIADO: Sí, existen también diferencias fun-cionales, por ejemplo, la capacidad de desen-sibilízación es distinta. Los receptores a7, porejemplo, se desensibilizan rápidamente y ade-más al estudiar las secuencias desde el pun-to de vista evolutivo se observa que se desa-rrollaron divergencias bastante pronto durantela evolución.

J. MARSAL: Quisiera añadir alguna informacióncomplementaria a lo expuesto por el Dr. Cria-do. Usted se ha referido al hecho de inyectarmensajeros en el oocito y seguidamente com-probar su expresión en la membrana del mis-mo. También es posible inyectar membranasoriginales de, por ejemplo, un órgano eléctri-co, y estas membranas se incorporan a lamembrana del oocito, y lo hacen de manerafuncional, es decir, que añadiendo acetilcoli-na dan unas corrientes que pueden llegar a3 o 4 /¿A.

M. CRIADO: ES una información metodológica in-teresante.

A.G. GARCÍA: Querría hacer un comentario final,al hilo del título de esta mesa redonda, la far-macología de los canales iónicos. Aunque elreceptor nicotínico del sistema nervioso cen-tral carece de una farmacología, de una far-macoterapia, se está trabajando activamenteen ello. El problema de la adicción a la nicoti-na está despertando un interés inusitado, ycreo que pronto podremos pensar en fárma-cos con aplicación terapéutica que actúen se-lectivamente en los receptores nicotínicos delsistema nervioso central, lo que probablemen-te se deba a estas estrategias de biología mo-lecular que están identificando diferencias su-tiles entre los receptores de la placa motora,del ganglio simpático y parasimpático y de laneurona.

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Canales activados por glutamatoJ. Lerma, A.V. Paternain, N. Salvador,

F. Somohano, M. Morales y M. CasadoDepartamento de Plasticidad Neural. Instituto Cajal.

Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Madrid.

Introducción

En el sistema nervioso central (SNC), la granmayoría de las sinapsis excitadoras usan ami-noácidos como sustancias neurotransmisoras.Los receptores que los aminoácidos excitadoresreconocen en la célula postsináptlca no sólo me-dian la transmisión normal de la información aeste nivel, sino que también participan en la ma-duración de las conexiones sinápticas y en elcrecimiento y la estructuración celular12, ac-tuando estos aminoácidos en este punto comoauténticos factores tróficos. Además, la activa-ción de los receptores glutamatérglcos puedeconllevar la generación de fenómenos plásticoslargamente duraderos como ocurre con la va-riación por el uso de la eficacia sináptica, indu-cible prácticamente de por vida. Este fenóme-no está considerado la base celular de losprocesos de aprendizaje3. No obstante, la so-breexcitación de ciertos receptores puede tam-bién mediar la degeneración neuronal y provo-car la muerte celular. Esto significa que losmismos mecanismos fisiológicos, activados in-apropiadamente, son suficientes para desenca-denar la muerte de elementos neuronales, pa-reciendo existir una frontera sutil entre la funciónnormal y la patología.

En los últimos años ha tenido lugar un avanceconsiderable en el entendimiento de las propie-dades de los receptores que posibilitan la trans-ducción de la información en esas vías excita-doras. En este sentido, parecen existir, al menos,dos grandes familias de receptores con propie-dades farmacológicas y funcionales diferentes.Una de ellas comprende los receptores que for-man un canal iónico (receptores ionotrópicos),definidos por la acción depolarizante de agonis-tas selectivos: N-metil-D-aspartato (NMDA) y a-amino-3-hydroxi-5-metilisoxazol-4-propionato(AMPA), aunque el receptor de AMPA tambiénpuede ser activado por kainato*. Se ha podidodeterminar que ambos receptores pueden coe-xistir en la misma sinapsis4'5. Un nuevo tipo dereceptor ionotrópico para el ácido glutámico esun receptor ionotrópico insensible a AMPA, que

presenta desensibilización cuando se activa porkainato, quiscualato y glutamato. Este receptorha sido descrito muy recientemente habiéndo-se denominado receptor «kainato-selectivo». Laotra gran familia comprende receptores acopla-dos a proteína G, cuya activación provoca, enunos casos, la hidrólisis de fosfoinosítidos a IP3y diacilglicerol7 y, en otros, la modulación delos valores de cAMP8'9. Son los receptores dequiscualato tipo B o de ACPD (receptores me-tabotrópicos). Esta familia incluye lo que pare-ce ser un autorreceptor de efecto inhibidorpresináptico10, el receptor de AP4, del que sedispone de limitada información. En un tema encontinua evolución, esta clasificación puede ver-se alterada a medida que el conocimiento so-bre los receptores nativos progrese, teniendo encuenta las nociones aportadas en los últimosaños por el estudio de los diferentes tipos de re-ceptores recombinantes expresados en sistemasde expresión exógena.

Caracterización de los receptoresglutamatérgicos

El subtipo NMDA de receptor glutamatérgicoes un canal catiónico operado por ligando quepermite la permeación de Na+, K+ y Ca2+ yque posee diversos lugares susceptibles de mo-dulación tanto por agentes endógenos como

* Debido a la falta de especificidad farmacológicade los antagonistas disponibles hasta la fecha y a queestos receptores son también activados por kainato,los receptores de AMPA son comúnmente referidoscomo receptores de AMPA/kainato. La evidencia deque existen receptores de glutamato que, siendo ac-tivados por kainato de forma peculiar, no reconocenAMPA (véase posteriormente) obliga a hacer una dis-tinción entre receptores de AMPA y receptores de kai-nato todavía no suficientemente universal. Por ello, enel presente artículo denominaremos receptores deAMPA a aquellos receptores que son activadospor AMPA, aunque también lo sean por kainato6.

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exógenos. Estos lugares se corresponden conel sitio que reconoce al ligando endógeno, glu-tamato; un lugar de alta afinidad para glicina11,que actúa posibilitando la apertura del canal in-ducida por el agonista12'13 y que es diferentedel receptor inhibidor de glicina, sensible a es-tricnina; un sitio o sitios dentro de la luz del ca-nal, donde el Mg21 y las fenciclidinas (PCP, ke-tamina, MK-801) se unen para producir elbloqueo del canal una vez abierto, fenómeno de-pendiente del potencial de membrana1117. Unsitio adicional lo representa el lugar donde elZn21 actúa para inhibir alostéricamente la res-puesta a NMDA1819. Igualmente, se ha descri-to la sensibilidad del receptor de NMDA a la con-centración extracelular de H i 2 a ? l , así como alestado redox celular22. Más recientemente, seha descrito la existencia de un lugar donde laspoliaminas endógenas espermina y espermidi-na se unirían para potenciar la respuesta aNMDA2Í. Experimentos realizados en nuestrolaboratorio han demostrado que esta potencia-ción se debe a un decremento del grado de de-sensibilización del receptor de NMDA y que laspoliaminas reconocen un lugar situado en lacara extracelular del receptor24.

Los experimentos llevados a cabo durante losúltimos años con técnicas de biología molecu-lar han conducido a la clonación de las subuni-dades que deben conformar in vivo los recep-tores para glutamato. Ello ha puesto demanifiesto la existencia de varias subfamiliasde subunidades. Las múltiples combinacio-nes de estas subunidades en dosis todavía noconocidas darían lugar a la gran diversidad fun-cional que los receptores de glutamato presen-tan. En este sentido, es posible obtener recep-tores funcionales de NMDA con propiedadessimilares a las descritas con respuestas nativaspor ensamblaje heteromérico de dos tipos desubunidades, la NR125 y cada una de las 4 sub-unidades NR2 (NR2A-D)26. La subunidad NRlaparece en siete formas diferentes generadaspor procesamiento diferencial de los ARN2/,otorgando cada una de ellas al heterómero pro-piedades farmacológicas peculiares. La sub-unidad NRl es ubicua en el SNC mientras quelas NR2 poseen un carácter modulador, dadoque los receptores recombinantes de NMDA ad-quieren características funcionales diferentes deacuerdo a la subunidad NR2 que se ensamblecon NRl26'28. Además, las subunidades NR2presentan perfiles diferentes de expresión espa-cial y temporal en el desarrollo, generando di-versidad funcional en las distintas poblacionesneuronales del SNC28.

En términos de papel funcional, está amplia-mente reconocido que los receptores de AMPAmedian la mayor parte de la transmisión sináp-tica excitadora de tipo rápido29. La familia delos receptores AMPA comprende 4 subunidadesaltamente homologas (GluRl-4)30. Estudios far-macológicos y electrofisiológicos con receptoresrecombinantes de AMPA expresados en líneascelulares o en oocitos de Xenopus han demos-trado que este receptor posee una alta afinidadpor AMPA y que este análogo de glutamato de-sencadena respuestas similares a las registra-das en células pertenecientes al SNC31. Igual-mente, han demostrado que este receptor, y elcanal iónico que forma, es activado por kainatogenerando respuestas no desensibilizantes. Lafalta de agonistas específicos hace dificultosa ladistinción funcional con otros receptores, lo queha llevado a cuestionar la existencia, por ejem-plo, de receptores de kainato específicos y deAMPA específicos en el SNC.

Igualmente, se ha propuesto que las familiascompuestas por KAl y KA2 y por GluR5, GluR6y GluR7 representan las subunidades de los re-ceptores de kainato de alta afinidad3234 y que¡n vivo los distintos receptores podrían estarcompuestos por estas subunidades asociadasde forma heteromérica. Sin embargo, y a pesarde algunas evidencias autorradiográficas y datosde unión de radioligandos35, la demostraciónde la existencia de este tipo de receptores enforma funcional en membranas nativas ha sidoardua. No obstante, muy recientemente, nuestrolaboratorio ha podido demostrar, utilizando técni-cas de patch-clamp y perfusión rápida, que unalto porcentaje de neuronas hipocámpicas encultivo expresan receptores de glutamato queson selectivos para kainato5. Estos receptoressufren una profunda y rápida desensibilizacióny, aunque son activados por glutamato, quiscua-lato y domoato, no son sensibles a AMPA. Estosresultados han provisto la primera evidenciaacerca de la existencia en células nerviosas dereceptores funcionales de este tipo, dando lugara la pregunta de cuál es su función en el SNC.

Canales iónicos activados por glutamato

Quizás uno de los resultados más sorprenden-tes que la expresión y la caracterización de lasdistintas subunidades han proporcionado es laconstatación de que el receptor de AMPA, endeterminadas configuraciones, muestra una lla-mativa permeabilidad a Ca24»37. Era universal-mente aceptado que el incremento citoplasmá-

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CANALES AC~VAK)S POR GLUTAMÍTO

H,l\ -

GluR-A

GluR-3

GluR-C

GluRO

Gli.R-5

GILR-5

<A-1t\A-2

\IR-1

ME

ME

ME

ME

NN

NN

MQ

\¿QDA

FGIFMSLWFSLGAFVS

FGIFIXSLWFSLGAFVl

FGIFIV3LWFSLGAFV1

FGIFIV3LWFSLGAFM

FTLLNSFWFGVGALM

FTLLNSFWFGVGALM

V'SLGN3LWFDVGGFM

YTLGNSLWF^VGGFM

LTLSSAMWFSWGVLL

QR

Q

Q

Q/R

Q/"R

Q

QN

3GC

QGC

QGC

QGC

QGS

QGS

QGS

QGS

SGI

DISPRSL

DISPRSL

DISPRSL

DISPRSL

ELMPKAL

EUi/PKAL

TIAPRA.

EIMPRA^

GEGAPRS

:ooh

Fig. 1. Topología pro-puesta para ¡as distin-tas subunidaaes de losreceptores de glutama-to. Parece que tanto eiextreme amino corr,o elcarboxiterminal se en-cuentran localizadosextcaceiuíarmertie. Losrectángulos numera-dos 1-iV reoresentdn lossegmentos rransmembrana, postulados apartir de estilólos dehidrcfobicidad. En laDarte inferior se mues-tran alineadas ,'as se-cuencias aminoacíd;-cas correspondientesal segundo segmentotransmembrana (zonasombreada) de variassubunidades. Se pos-tula que este segmento forma parte de la pared del canal iónico. En algunas subunidades, como GluR-B, GluR-5y GluR-6, el «sitio Q/R» presente en el segundo segmento transmembrana (sombreado claro) puede estar ocupa-do por glutamina (Q) o arginina (R) debido a fenómenos de edítate del ARNm. En cerebro de rata se ha compro-bado que mientras que prácticamente el 100% del ARNm que codifica para GluR-B se encuentra editado (poseeun codón para R), sóio el 30% del ARNm para GiuR-5 presenta un codón editado, porcentaje que es aproxima-damente del 75% en el caso de GluR-6*. En las subunidades del receptor de NMDA (NR-1, NR-2A, -2B, -2Cy -2D) la posición homologa al sitio Q/R está ocupada por una asparragina (N). Este sitio es crítico en todas lassubunidades y determina en gran medida la permeabilidad iónica del canal.

tico de Ca2< en respuesta a glutamato se debía3 la apertura de receptores de NMDA, o a la ac-tivación de canales de Ca?- dependientes devoltaje en respuesta a la despolarización que elglutamato provoca. Los estudios de biología mo-lecular han demostrado que se pueden obtenerdiversos tipos de receptores funcionales deAMPA por combinaciones de las subunidadesGluR-A, -B, -C y -D (también denominadasGluRl-4)3038 (fig. 1). La expresión de estas sub-unidades ha puesto de manifiesto que el Ca2h

puede permear aquellas formaciones homomé-ricas o heteroméricas que carecen en su com-posición de la subunidad GluR-B3537. Otro he-cho llamativo es que en ausencia de GíuR-B, lascorrientes mediadas por los receptores de AMPApresentan una marcada rectificación en direc-ción entrante. Por el contrario, receptores queposeen la subunidad GluR-B en su composicióncarecen de rectificación entrante y no presen-tan permeabilidad al Ca2 '35. Estos resultadosindican que la presencia de GluR-B determinatanto el comportamiento voltaje-dependiente delheterómero como la permeabilidad al Ca2+ delcanal funcional. Experimentos de mutagénesisdirigida han demostrado que el responsable de

este comportamiento es un único aminoácidosituado en el segundo segmento transmembra-na y que se origina por editaje del ARNm38-*0.En la subunidad GluR-B, este residuo es argi-nina (R), mientras que en los GluR-A, -C y -D,este puesto está ocupado por glutamina (Q)(fig. 1). Este sitio, denominado «Q/R», es críti-co en el funcionamiento de todos los canalesoperados por glutamato ya que en todas lassubunidades de los receptores de NMDA elaminoácioo presente en el lugar homólogo,una asparragina, controla igualmente la per-meabilidad del canal al Ca2+ y el bloqueo porel Mg2l-4:.

Dada la importancia que la existencia o no deesta vía de entrada del Ca2+ a través de los re-ceptores de AMPA puede tener en la funciónneuronal y lo que de ello se pudiera derivar entérminos de participación en fenómenos plásti-cos y/o excitotóxicos, decidimos examinar la for-ma de las relaciones corriente-voltaje (I/V) y eva-luar la permeabilidad al Ca2t de los receptoresde AMPA expresados por las células hipocám-picas en cultivo (fig. 2). Estos resultados se ex-tendieron a neuronas hipocémpicas, disociadasagudamente a partir de individuos jóvenes, que

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A

Na'

KA 100 L I M

Ca2-

KAiOO LIM

Na1 Ca2+

KA__O0LIM K A I O O L I M

^ Na' Ca2'KA 100 LIM KAiQOuM

165 nM Na-

20010 mM Ca2'

-100 -50"-200

-400 165 mM Na4

'-600-1.000-1.400

-901500

500_ms p/\

1.600- PA

8C0-

10 mM Ca2-

Fig. 2. Propiedades delas corrientes activadaspor kainato actuandoen los receptores deAMPA en neuronas hi-pocámpicas manteni-das en cultivo. En laparte superior de la fi-gura (de A a C) semuestran las respues-tas provocadas porperfusión rápida dekainato (KA) a variospotenciales de mem-brana cuando la solu-ción extracelular con-tuvo Na' (registrosrotulados Na*) o cuan-do, en ausencia deNa*, el Ca* fue el úni-co ion responsable dela corriente entrante(registros rotulados

Car-}. El protocolo seguido fue el siguiente: el potencial de membrana se varió desde -90 hasta + 90 mV en pa-sos de 20 mV. El potencial de reposo entre pulsos fue de -60 mV. Se aplicó Kainato a concentración constantedurante 0,6 s (barra horizontal) en cada valor de potencial. En ¡a parte inferior de cada caso se muestra la rela-ción I/V, calculada tras la sustracción de la corriente de pérdida correspondiente. Las líneas son polinomios desegundo (A y C) o cuarto (B) orden ajustados a los valores de amplitud. Las respuestas inducidas por kainato,actuando sobre los receptores de AMPA, pueaen ser clasificadas en rectificadoras en sentido saliente y no per-meables a Ca2* (A), rectificadores en sentido entrante y permeables a Ca2* (ES) y aproximadamente lineales, conbaja, aunque no despreciable, permeabilidad a Ca2*. La razón de permeabilidad Pcf* / PCs calculadas segúnla ecuación de campo constante, está indicada en cada célula. Tomada de Lerma et al42.

P(:,,2*/P&,= 1 :57

165 mM Na< -1.600

al conservar la polaridad estructural nos permi-tieron estudiar la distribución topológica de losreceptores en el eje somatodendrítico. Los re-ceptores de AMPA se activaron con kainato,puesto que este agonista no desensibiliza dichosreceptores, permitiendo estudiar las corrientesen condiciones estacionarias. Con este estu-dio42 se demostró que, aunque la mayoría(52,2%) de las células en cultivo expresan recep-tores de AMPA que carecen de permeabilidada Ca2t (fig. 2A), existe un número significativode neuronas en las que la activación de estosreceptores puede conllevar una entrada ceCa2+ muy sustancial. De este último grupohay que distinguir un pequeño porcentaje(6,6%) que presentan respuestas a kainato conuna clara permeab i l idad al Ca 2 ' (PCa2 + /PCs+ = 0,9) (fig. 2B). No obstante, no se encon-traron permeabilidades al Ca2+ tan altas comolas descritas para receptores de AMPA recom-binantes y, en todo caso, fueron menores quelas estimadas en las mismas condiciones paralos receptores de NMDA (PCa2i/PCs+=5,8). Lascélulas que mostraron mayor permeabilidad al

Ca2t presentaron una relación I/V con rectifica-ción entrante, aunque no completa. El 4 1 % delas células estudiadas presentaron una curva I/Vaproximadamente lineal y una permeabilidad alCa2+ baja, aunque no despreciable (PCa2,/PCs+=0,18) (fig. 2C). En todo caso, se pudocomprobar la existencia de una correlación en-tre el grado de rectificación entrante y el gradode permeabilidad al Ca2 ' .

Esto lleva a la conclusión de que las célulashipocámpicas deben expresar los dos tipos dereceptor de AMPA con propiedades de rectifi-cación opuestas y, por consiguiente, con bajay alta permeabilidad al Ca2+. Ello haría posiblela existencia de rectificación incompleta en lascurvas I/V, así como una permeabilidad al Ca2-graduada a nivel celular a través de los recep-tores de AMPA.

Aunque la existencia de subunidades de re-ceptores de AMPA aún desconocidas no se pue-de descartar, esta última conclusión es especial-mente atractiva puesto que impl ica quereceptores de AMPA permeables y no permea-bles a Ca2+ (es decir, que contienen y que ca-

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CANALES ACTIVADOS POR G'JUIAMATO

° Entrante

• Saliente

B

mV

-100

500

300

100

-50 //*

^ -500

-700

pA•

- /

50

PCa2+/PC5+=0,051/0 = 0,15

cmV100

y

-50

/-1

-1

500

-500

.000

.500

pA

*-•50

Pca2+/PCs-. = 1,57

1/0 = 2,90

ó

rmea

r = 0,85

F/g. 3. Modelado de las relaciones I/V de ios receptores de AMPA. A: relaciones t/V en 2 células prototípicasque muestran rectificación entrante (círculos) o saliente (triángulos). Los puntos representan los valores normali-zados de corriente inducidos por kainato a cada valor de potencial de membrana. Las líneas representan un poli-nomio de cuarto grado (rectificación entrante) o de segundo grado (rectificación saliente) ajustado a los valoresobtenidos en esas células. Estos polinomios fueron:Entrante=8,795xl0-9x4 +1,073 x ÍO^6 x3 - 7,157xlO5 x2+9,306 x 10-4 xSaliente=4,867 x 10-5x2 + l,512 x 10-? xLos valores de corriente, obtenidos experimentalmente en 41 células que mostraban características mixtas, seajustaron en cada caso con la función resultante de la suma de los polinomios indicados:KEntrante)+O(Sal¡ente) + offsetdonde I y O representan las amplitudes de cada función polinómica, y fueron los únicos parámetros (más el off-set,) que dejaron fluctuar libremente durante el proceso de ajuste. ByC muestran resultados representativos deajustes en 2 células de características muy distintas. Los puntos son datos experimentales; las líneas representanel resultado del ajuste. La razón de permeabilidad Ca2* /Cs*, así como la razón de las amplitudes de cada poli-nomio (1/0), están indicadas en cada caso. D: correlación entre la razón de los componentes de entrada y salidaestimados por ajuste y el grado de permeabilidad a Ca2*, medido para cada una de las células (n=41). Se re-presentan tanto la línea de regresión como el intervalo de confianza al 90% (líneas discontinuas), r es el coeficien-te de correlación, que fue significativo al 99%. Tomado de Lerma et aF.

recen de GluR-B editada) coexisten en la mis-ma célula en mayor o menor proporción. Paracomprobar esta hipótesis se modeló la voltaje-dependencia de los receptores de AMPA per-meables al Ca2+ mediante un polinomio decuarto grado, que ajustó y representó perfecta-mente la curva I/V de las respuestas mediadaspor los receptores de AMPA en una célula quepresentó una fuerte rectificación entrante. Esta

función, así calculada, se tomó como prototípi-ca de los canales de AMPA permeables alCa2+. Un polinomio de segundo grado, ajusta-do a una relación I/V con cierta rectificación sa-liente, sirvió para representar adecuadamentela curvatura de la relación I/V que típicamentepresentan los receptores no permeables alCa2h (fig. 3A). Si ambos tipos de receptor co-existen en la misma célula y si para cada valor

21


de Vm su activación contribuye igualmente a lacorriente total, la relación I/V para esa cé ula po-dría ser calculada por la suma ponderada delas funciones que explican el comportamientode cada tipo de receptor. Las figuras 3B y 3Cexponen el resultado de ajustar la suma de los2 polinomios, calculados previamente, a los pun-tos obtenidos expehmentalmente en 2 casos ex-tremos. Los únicos parámetros libres en el ajustefueron las amplitudes de cada función polinc-mica. Como puede verse, con este modelo esposible explicar relaciones I/V muy dispares,considerando únicamente la presencia 'dativade cada componente. Esta fue cuantificadacomo la razón entre las amplitudes estimadasque definieron el componente rectificador de en-trada y el de salida. Una comprobación ulteriorde este modelo podría venir dada por la exis-tencia de correlación entre el grado de permea-bilidad al Ca2 ' , medido previamerte en cadauna de las células analizadas, con la razón delas amplitudes estimadas para cada componen-te siguiendo el modelo. Efectivamente, la razónde amplitudes de los respectivos polinomios es-tuvo bien correlacionada con el grado de oer-meabilidad al Ca? l, medido como la razón depermeabilidades Ca2-/Cs' (fig. 3D). Este mo-delo tan simple demuestra que la rectificacióngraduada de las corrientes mediadas por acti-vación de los receptores de AMPA es posible sireceptores de uno y otro tipo son expresados porla misma célula. Igualmente, la existencia de po-blaciones celulares que, teniendo una relaciónI/V lineal muestran una entrada sustanciadeCa2 ' cuando se activan los receptores deAMPA, es posible. En este sentido, se han des-crito acumulaciones relevantes de Ca?+ tras laactivación de receptores de AMPA en célulasque presentaron una relación I/V prácticamen-te lineal43"5. De acuerdo a estas consideracio-nes, podemos afirmar que una permeabilidadcelular relativamente baja al Ca2+ cuando seactivan los receptores de AMPA no significa laexistencia de receptores de AMPA parcialmen-te permeables al Ca2+, sino que sólo unos po-cos receptores de AMPA de los expresados poresa célula son permeables al Ca2 ' .

La entrada de Ca2' a través de los recepto-res de AMPA puede tener un gran significadofuncional, particularmente allí donde los recep-tores de NMDA estén pobremente representa-dos. Se ha demostrado recientemente que si-napsis carentes de receptores de NMDApresentan receptores de AMPA capaces de pa-sar corriente sólo en dirección entrante (rectifi-cadores)4*. Estos receptores, como se acaba

de argumentar, deben ser permeables al Ca2+.Aunque el ARNm para la subunidad GluR-B secolocaliza con ARNm codificantes para otrassubunidades en la mayoría de las célulashipocámpicas47, la coexistencia de receptoresde AMPA permeables y no permeables a Ca2t

puede ser un fenómeno ampliamente extendi-do. Por ejemplo, las células de Purkinje mues-tran una entrada de Ca21 sustancial por activa-ción de los receptores de AMPA, a pesar de queexpresan grandes cantidades de ARNm paraGluR-B48. Aunque todavía no suficientementevalorado, las neuronas que expresen receptoresde AMPA permeables al Ca?+ deben ser parti-cularmente vulnerables a glutamato. Como la ex-presión de las diferentes subunidades que cons-tituyen los receptores varía con el tiempo49-0, elgrado de susceptibilidad excitotóxica para dife-rentes pob aciones neuronales puede igualmen-te variar, ccasionando que ciertas áreas cere-brales sean más o menos susceptibles a losfenómenos excitotóxicos durante fases particu-lares del desarrollo.

Conclusiones

En resumen, los receptores para los aminoáci-dos excitadores, principalmente glutamato, nosólo median la transmisión sináptica normal,sino que también participan en diversos fenóme-nos fisiológicos e igualmente son los responsa-bles de numerosos procesos neurodegenerati-vos. Por ello, el estudio de los receptores paralos aminoácidos excitadores y el desarrollo deantagonistas que pudieran prevenir el daño exci-totóxico es, en la actualidad, una de las áreasmás activas de la neurobiología tanto básicacomo clínica. El conocimiento de la farmacolo-gía, la biofísica y los sitios de modulación de losreceptores de glutamato es esencial para el de-sarrcllo de fármacos específicamente dirigidos ainfluenciar y controlar su actividad, en la esperan-za de que disminuyendo la estimulación excesivay prolongada de los receptores de glutamato seatenuará la neurodegeneración que conllevan.

Agradecimiento

Los autores agradecen la ayuda de D. Guineaen la realización de estos trabajos, que han sidofinanciados por la Dirección General de Investi-gación Científica y Técnica (PB89-0061) y el Fon-do de Investigaciones Sanitarias de la Seguri-dad Social (92/0266). F. Somohano disfrutó deuna beca posdoctoral de la CEE y A.V. Paternaindisfruta ce una beca Glaxo-CSIC.

22

CANALES ACTIVADOS POR GLUTAMATO

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DISCUSIÓN

W. BUÑO: Usted ha realizado experimentos to-mando tan sólo el calcio o el sodio como ¡onpermeable. Quisiera preguntarle si existe al-guna interacción cuando se colocan sodio ycalcio juntos como iones permeables. Si exis-te interacción el modelo no va a "'uncionar, ob-viamente, ya que es un modelo lineal de sumade ajustes.

J. LERMA: Existe, efectivamente, interacción yaque se ha descrito que el calcio oloquea el re-ceptor, o el canal de AMPA —y nosotros lo he-mos comprobado también con el canal dekainato— lo que es extensible ta-nb¡én al ca-ral de NMDA. A la vez que perrrea, el ca cióboqjea la corriente de sodio. En nuestro mo-dele no henos utilizado 2 iones a la vez a lahora de determinar el graco ce permeabilidad

a calcio o la razón de permeabilidades cal-cio/cesio, porque es absolutamente necesa-rio asumir condiciones biómeas para poder de-terminar el grado de permeabilidad del calciocon fiabilidad. La presencia de 2 iones per-meantes crea confusión y complica tremen-damente las estimaciones.

B. SORIA: ¿Sabe si el magnesio citosólico ce-sempeña algún papel en los procesos de rec-tificación que ha observado?

J. LERMA: LOS registros se realizan en presenciade magnesio interno pero en su ausencia apa-rece tamb'ér rectificación entrante. Aparen-temente hay dos proessos de rectificación,uno de rectificación saliente y e o se debe auna voltaiedependencia de la desensibiliza-cicn exclusivamente. Si se suprime la desen-

CANALES ACTIVADOS POR GLUTAMATO

sibilización con ciclotiacida no hay rectificaciónsaliente. Pero la rectificación entrante sí quepuede tener un origen iónico aun cuando nosea el magnesio. Este es un hecho que estásiendo objeto de debate.

B. SORIA: En una de las diapositivas mostrabaque el diazóxido afecta al sistema. Es una sus-tancia que abre canales de potasio. ¿El efec-to que está mostrando es un efecto directo so-bre el receptor o es un efecto a través decambios del potencial de membrana?

J. LERMA: En nuestro grupo no hemos trabaja-do con diazóxido. Fue la segunda sustanciadespués del aniracetam que se probó y sirviópara demostrar que el receptor de AMPA te-nía un lugar de modulación alostérica. Traba-jamos con ciclotiacida, que tiene los mismosefectos ya que es un diurético y su estructuraes muy parecida, son benzotíadiacinas. No séa qué concentraciones actúa sobre los cana-les de potasio, sobre los canales de AMPA ac-túa a concentraciones muy bajas del orden mi-cromolar.

J. LÓPEZ BARNEO: Querría volver a la interrela-ción sodio-calcio. En todas las curvas I/V queha mostrado antes utilizaba soluciones con so-dio (libres de calcio), o bien de calcio (libresde sodio). ¿Existen diferencias entre las cur-vas I/V de los receptores AMPA permeablesy no permeables al calcio, si se utilizan con-centraciones fisiológicas de estos iones? Porejemplo, 140 mM de sodio y 2,5 mM decalcio.

J. LERMA: NO, a nivel macroscópico de célulacompleta. Es posible que exista a nivel micros-cópico, me refiero en términos de curva I/Vde canal único.

J. LÓPEZ BARNEO: Quisiera referirme a sus traba-jos y a los de otros autores, que muestran queel receptor AMPA es permeable a calcio, ¿po-dría hacer un comentario sobre su posible lo-calización dentro de una neurona?, ¿está dis-tribuido uniformemente o cree que hay unadistribución no uniforme en el soma, dendri-tas primarias y árbol dendrítico?

J. LERMA: Esta cuestión nos la planteamos al ob-servar estos resultados, y realizamos registrosen células de hipocampo disociadas aguda-mente de animales posnatales, es decir, quemantienen la polaridad en el sentido que elsoma es soma y la dendrita apical es la den-drita apical. Mediante perfusión localizada dela membrana neuronal a nivel del soma o anivel de la dendrita proximal, o de la dendritaapical pudimos comprobar que en el somahay menos rectificación que en la dendrita

proximal, y en la dendrita proximal más queen el soma y en la dendrita apical, por lo que apartir de la correlación, grado de permeabili-dad-grado de rectificación, se puede inferirque en la dendrita proximal existen más re-ceptores permeables a calcio que en el soma,o que en la dendrita apical. Por tanto, sí quehay una localización, una topología a lo largodel eje somatodendrítico.

J.E. ESQUERDA: En este contexto yo quisiera pre-guntar si alguien ha hecho la correlación en-tre la presencia de receptores AMPA permea-bles a calcio y la capacidad del AMPA paraproducir fenómenos de excitotoxicidad.

J. LERMA: Las células de Purkinje que no expre-san NMDA muestran una gran sensibilidad ex-citotóxíca a AMPA. En presencia de glutámicola célula de Purkinje muere y esa muerte es in-ducida a través de receptores de AMPA. Antesde conocer que el receptor de AMPA era per-meable a calcio se creía que la toxicidad sedebía a fenómenos osmóticos o a la activaciónde canales de calcio voltajedependientes, peroobviamente se trata de un efecto calciodepen-diente, y es antagonizado por antagonistas delos receptores de AMPA.

M. CRIADO: Usted ha presentado unas célulasque en un determinado porcentaje tienenunos receptores con unas características. ¿Esposible que durante el tiempo de cultivo delas células estos porcentajes se modifiquen?

J. LERMA: ES una buena pregunta. Al realizarcultivos se están seleccionando unas célulasque crecen bien y no se tiene en cuenta lascélulas que crecen mal. Sin embargo, el por-centaje de células permeables a calcio o conrectificación de entrada en cultivos neurona-les realizados a partir de embriones fue muyparecido al porcentaje de células con rectifi-cación de entrada encontradas en células pos-natales disociadas agudamente.

J. TAMARGO: Mi pregunta está relacionada conla que antes formuló el Dr. Soria; usted estáobservando el efecto de diazóxido que dismi-nuye conductancia potasio y está observan-do el efecto de ciclotiacida, que al menos enlas preparaciones que manejo también mo-difica en el mismo sentido la polaridad celu-lar porque inhibe la conductancia calcio a tra-vés de canales L y T. Mi pregunta es: ¿tienealguna forma de decirme qué conductanciamodifican en esa preparación?

J. LERMA: NO vemos el efecto de estos fármacossobre otros canales que no sean los canalesde AMPA ya que trabajamos en condicionesde fijación de voltaje. Por tanto, no hay acti-

25

FARMACOLOGÍA DE LOS CANALES ION eos

vación de canales voltajedependientes, apar-te de los que estén activos en el potencial demembrana en reposo; además, si hubiera ca-nales de potasio activos al potencial de mem-branas en reposo, los tendríamos bloqueadosmediante el cesio añadido dentro de la célu-la. Únicamente observamos corriente deAMPA al poner AMPA. Por todo ello, no hayninguna contaminación en lo que se refiere ala acción de ciclotiacida por activación o des-activación de otros canales.

V. CEÑA: Cuando se cultivan neuronas u otrotipo de células se producen muchos fenóme-nos de desensibilización que pueden modifi-car la distribución de receptores. En el casodel hipocampo una posibilidad de prevenireste efecto es realizar experimentos en roda-jas, la pregunta es: ¿han hecho experimen-tos en rodajas de hipocampo? y, si la respues-

ta es afirmativa, ¿obtienen los mismos resul-tados?

J. LERMA: Nosotros no, pero otros grupos hanllevado a cabo experimentos tratando de co-rrelacionar las curvas I/V con la permeabili-dad calcio. El resultado que han obtenido hasido absolutamente negativo, no han encon-trado permeabilidad del calcio ni rectificaciónentrante en parches tomados del soma. Sinemoargo, ya he señalado que en el soma haymenos receptores permeables al calcio queen la dendrita, lo que podría ser la causa.

B. SORIA: En relación con la pregunta anterior,si estas sustancias actúan directamente sobreel receptor, ¿ha revisado si hay trozos de se-cuencias homologas entre este receptor y loque se sabe de canales de potasio?

J. LERMA: NO, es un aspecto muy reciente.

26

Canales de K+ en la señal celular del calcioF. Barros, D. del Camino, L.A. Pardo y R de la Peña

Departamento de Biología Funcional. Área de Bioquímica. Unlversldac de Oviedo.

Introducción

Desde los trabajos pioneros de Hodkin y Hux-ley a principios de la década de los cincuen-ta1'2, se ha hecho evidente que los canales deK+ son responsables de la repolarización de lospotenciales de acción mediados por Na-,Ca2+, Na* y Ca2- o Cl•- en células eléctrica-mente excitables. Sin embargo, los canales deK+ aparecen ampliamente distribuidos tanto encélulas eléctricamente excitables como en lasno excitables, y en los últimos años está cadavez más claro que además de su ubicuidad, po-seen un importante papel en la producción y/oel control de una gran variedad de respuestasen prácticamente todos los tipos celulares. Así,aparte de su capacidad para modular el patrónde disparo neuronal y de su papel en la codifi-cación e integración de las señales neuronales,los canales de K+ son componentes esencialesde los sistemas que controlan en todo tipo decélulas la homeostasis del Ca2+ celular, los pro-cesos contráctiles y secretores o el volumen ce-lular.

Desde hace más de 2 décadas se ha recono-cido también un importante papel del Ca2+ in-tracelular como mediador en el denominado«proceso de acoplamiento estímulo-secre-ción»3. Tanto en tejidos eléctricamente excita-bles clásicos (nervio y músculo) como en célu-las neuroendocrinas o exocrinas, el Ca2* esampliamente utilizado como mediador intrace-lular. Esto ha conllevado la aparición de una granvariedad de procesos celulares dedicados alcontrol eficiente de la homeostasls del Ca21.Entre ellos se incluyen sistemas de entrada deCa2* extracelular (p. ej., canales de Ca24 ope-rados por receptor o por voltaje), sistemas desalida del Ca2+ citoplásmico al medio externo(p. ej., Ca2+-ATPasas e intercambiadores Na*-Ca2h) y mecanismos de almacenamiento deCa2' (p. ej., orgánulos como el retículo sarco-plásmico, el retículo endopiásmico o las mito-condrias). Sin embargo, junto a estos sistemasde control directo de la concentración de Ca2+

citoplásmico, existen otros, como los canales de

K1 que, aunque de modo indirecto, modulande forma esencial la homeostasis del Ca?~ ce-lular. Así, estos canales aportan una vía de re-polanzación para las células despolarizadasmanteniendo, pues, el potencial de membranabasal. La hiperpolarización celular debida a laapertura de canales de K-, tiende a eliminar elflujo de Ca2+ a través de canales dependientesoe voltaje, y estimula la salida de Ca21 a tra-vés de los intercambiadores Na+-Ca2* electro-génicos. Inversamente, el bloqueo de los cana-les de K1 con la subsiguiente despolarizacióndel potencial de membrana celular promuevela apertura de canales de Ca2+ y aumenta laexcitabilidad celular. No obstante, es importan-te constatar que en células no excitables eléc-tricamente (p. ej., linfocitos, células endotelia-les45) dicha despolarización puede causar unareducción del flujo de Ca2+ desde el medio ex-terno a través de canales independientes de vol-taje, debido a la disminución del gradiente elec-troquímico de Ca2+. En células como las de losepitelios especializados en procesos de trans-porte de fluidos y electrólitos, las variaciones enlas concentraciones intracelulares de Ca2+ sonun parámetro importante de control del proce-so secretor. En este caso, además de su posi-ble papel en el mantenimiento de la homeosta-sis de Ca2-, los canales de K- son esencialespara funciones como: 1) el reciclado del K+ co-transportado con los iones secretados a travésde! epitelio6; 2) la repolarización de la membra-na celular, necesaria para el mantenimiento delos gradientes electroquímicos requeridos parala energización de los flujos pasivos de iones7

o del transporte acoplado de iones y solutos8,y 3) la prevención de los grandes cambios devolumen celular causados por las rápidas varia-ciones en las tasas de transporte trans-celular''8.

La aparición de la técnica de patch-clamp ensus distintas configuraciones a comienzos de losaños ochenta9 hizo posible la caracterizaciónde los canales Iónicos presentes en una enor-me variedad de células, así como el conocimien-

27

FÁRMACO! OG A DE LOS CANALES IÓNICOS

Na

Na*

K*

\

+

ACh

+

iK * '

_—

¿WT>F

ATP

i

Na*

^Ca*+J L

Cl

y ^ AMPC/ Ca**

Secreción

Absorción

Na* - *

*• K+ ^ v

r—<

J

T]+n+

n

3 + x

F/g. 1. Modelo esquemático de los componentes ce-lulares clave en el control de movimientos iónicos du-rante los procesos absortivo-secretores en células epi-teliales. Nótese la participación en el proceso secretorde canales de Ct regulados por segundos mensaje-ros (Ca2*, AMPc) y situados en el polo luminal de lacélula. Así mismo, se destaca la importancia de ca-nales de K' en la membrana basolatera! operadospor Ca2' y/o voltaje. Para más explicaciones, véaseel texto; Gt: glucosa; ota: aminoácidos; ACh: acetíl-colina; Vm: potencial de membrana.

to de la contribución de cada uno a las corrien-tes celulares totales. Estos conocimientos hansido complementados a partir de alrededor de1985 mediante el uso de dicha técnica para ob-tener información acerca de los mecanismos degeneración de señales por medio del CaL?* ci-toplasmático. La comprobación de los efectosde la activación de distintos receptores, la intro-ducción en el interior celular de distintos men-sajeros o sus análogos, la combinación de losregistros de patch-damp con el uso de coloran-tes fluorescentes y, más recientemente quizá,la imbricación de la citada técnica con podero-sas herramientas como la biología molecular, hanpermitido un acelerado avance en el campo dela transducción de señales incluidas, por su-puesto, las mediadas por Ca2+. A continuaciónse resumen algunos de los resultados y conclu-siones obtenidos en nuestro laboratorio en losúltimos años, centrados en las características yel posible papel de algunos canales de K+ enlas señales celulares mediadas fundamental-

mente por Ca2+ en células adenohipofisarias,así como por Ca2t y/o AMPc en epitelios secre-tores.

Canales de K' en epitelios secretoresde fluidos y electrólitos

A pesar de la existencia de excepciones a estaregla, podría afirmarse que mientras la mayo-ría de las células endocrinas poseen la capaci-dad de generar potenciales de acción, las célu-las epiteliales carecen de dicha capacidad6. Sinembargo, los epitelios absortivo-secretores demuchos tejidos (glándula salival, intestino, glán-dula sudorípara, páncreas exocrino, mucosagástrica, córnea, glándula lacrimal y epitelio tra-queal, entre otros), están sometidos a un estrictocontrol nervioso y/o hormonal. En la mayor partede estos tejidos, la activación hormonal o ner-viosa de la secreción desencadena un incremen-to en la conductancia de la membrana luminalal Cl . El esquema simplificado de la figura 1muestra, dejando aparte las evidentes variacio-nes particulares existentes entre distintos epi-telios, un modelo general de los componentesclaves en el control del transporte de electróli-tos durante los procesos absortivo-secretorestransepiteliales. Aunque incompleto, el modelodestaca la necesidad de un aporte de Ch através de la membrana basolateral durante lasecreción que compense el flujo del anión pro-movido por los mensajeros intracelulares (Ca2-,AMPc) a través de la membrana luminal, y queasegure el mantenimiento de la tasa secretoradurante un período de tiempo adecuado. Esteaporte de Ch es realizado en muchos casosmediante la operación de un sistema de cotrans-porte Na+ -K+ -Ch, dependiente del gradientede Na+ y, por ello, de la operación de la Na +

-K+ -ATPasa selectivamente localizada en lamembrana basolateral. El funcionamiento ade-cuado del sistema necesita, sin embargo, de uncomponente adicional, es decir, un canal deK* situado en la membrana basolateral quepermita: a) el drenaje del posible exceso intra-celular de K+ aportado por el cotransportadorNa* -K+ -Cl- y la !\la+ -K+ -ATPasa; b) el apor-te de K+ al espacio extracelular que asegure laoperación correcta del sistema de cotransporteNa* -K* -Ch, y c) el mantenimiento del poten-cial de membrana celular negativo en el inte-rior, que compense el flujo de cargas negativasproducido por la salida de los iones Cl y quemantenga así el gradiente electroquímico delanión asegurando el flujo continuado de este através de la membrana luminal.

28

CANALES DE K* EN LA SEÑAL CELULAR DEL CALCIO

Dependiendo del tipo de epitelio considera-do y del tipo de secretagogo implicado en la se-creción, un control primario del proceso secre-tor es ejercido mediante la regulación de laapertura de los canales de Ch luminales porvariaciones en las concentraciones cltoplasmá-ticas de Ca2+ y/o AMPc. Sin embargo, la exis-tencia en un gran número de epitelios de un ca-nal basolateral de K+ dependiente de Ca2+ yvoltaje (frecuentemente del tipo max¡-K) asegu-ra, asimismo, la coordinación del funcionamien-to polarizado luminal-basolateral del epitelio.Bajo condiciones iónicas normales, pues el se-cretagogo tenderá a producir una corriente deCl a través de la membrana lumlnal y una co-rriente de salida de K+ a través de la basolate-ral, complementadas con un flujo paracelulardeNa+ hacia el lumen eléctricamente negativo ya través de las uniones intercelulares permea-bles, así como un flujo transepitelial de agua pro-movido por el gradiente osmótico generado.

La aplicación al epitelio ciliar ocular de un es-quema como el descrito es complicada por laparticular organización anatómica de aquél. Esteepitelio, especializado en la producción del hu-mor acuoso, está formado por 2 capas celula-res, ia pigmentada y la no pigmentada, enfren-tadas por sus membranas apicales y conectadaspor desmosomas y uniones gap. Esta compli-cada estructura ha dificultado enormemente lainvestigación de los mecanismos molecuiaresimplicados en la formación del humor acuoso.También resulta evidente que la orientación deambas capas supone el funcionamiento de lacapa no pigmentada como un epitelio típica-mente secretor, y el de la pigmentada como unepitelio absortivo.

Los estudios Iniciales en preparaciones de iris-cuerpo ciliar revelaron la existencia de conduc-tancias a K+ dependientes de Ca2- y bloquea-bles por Ba2*, así como el importante papelsecretor de la capa no pigmentada. La existen-cia de conductancias a K+ bloqueables porBa2- fue posteriormente demostrada en célu-las pigmentadas. Sin embargo, la realización deestudios similares en células no pigmentadas hasido limitada por la escasa tasa de proliferaciónde dichas células en cultivo, especialmente delas células de origen humano. En nuestro labo-ratorio hemos utilizado una línea celular de epi-telio ciliar humano que retiene la mayoría de laspropiedades eléctricas del epitelio Intacto y delas células no pigmentadas en cultivo primario,obtenida por transformación viral en el labora-torio del Dr. Coca-Prados10. Nuestrosresultados11 nos han permitido obtener una evi-

dencia directa de la presencia de canales deK+ de gran conductancia (203 + 20 pS [n = 6]con concentraciones simétricas de K+ a amboslados de la membrana) activados por Ca2+ yvoltaje. Las características de dichos canales, losdetectados más frecuentemente en parches demembrana de las células utilizadas, los colocanen la familia de los max¡-K. Del estudio de suoperación ¡n situ hemos podido deducir tambiénque las células cultivadas mantienen un poten-cial de membrana basal de-36+ 9 mV(n = 10).Las propiedades de activación por Ca2+ y blo-queo por Ba2+ dependiente de voltaje son co-herentes con la hipótesis de que estos canalestienen un importante papel en los procesos se-cretores que participan en la formación del hu-mor acuoso. No obstante, puesto que no ha sidoposible demostrar si las células cultivadas man-tienen su polarización anatómica, la localizaclónprecisa de los canales estudiados no ha podi-do ser determinada, Así mismo, hemos podidodetectar otros canales de K+ dependientes deCa2t de menor conductancia y también blo-queables por Ba2+n. Es, pues, evidente quetras la detección de estas entidades molecula-res, el conocimiento de la importancia relativade los distintos canales de K+ en la secre-ción de fluidos y electrólitos por el epitelio ciliarrequeriría una investigación mucho más deta-llada. Algo parecido podría decirse de los me-canismos por los que distintos efectores fisioló-gicos regulan el funcionamiento de los canalesiónicos en las células del epitelio, controlandocon ello la secreción del humor acuoso.

La actividad eléctrica en la señal del Ca2+

y en la función secretora de célulasendocrinas

Un gran número de células endocrinas alma-cenan sus productos de secreción principalmen-te en granulos o vesículas secretoras. Existen ac-tualmente amplias evidencias tanto bioquímicascomo morfológicas de que, aunque estas célu-las son estimuladas por distintos factores exter-nos y secretan distintos productos, los secretanpor la vía de un proceso común, la exocitosls.En la mayoría de las células endocrinas, la exo-citosis requiere iones Ca2+ y la elevación de lasconcentraciones del catión en el citoplasma dis-para o contribuye al proceso secretor. La altera-ción de la concentración de Ca2+ ¡ntracelularse produce esencialmente mediante tres meca-nismos: a) Incremento de la entrada de Ca2+

extracelular por aumento de la permeabilidadde la membrana plasmática al Ca2t; b) movill-

29

lARVACOLOGIA DE LOS CANALES CNICOS

zac¡ón de Ca21 contenido en depósitos intrace-lulares, y c) disminución de la salida del Ca24

intracelular por el intercambio Na1 -Ca2' o porla Ca2' -ATPasa de la membrana plasmática.Los tres mecanismos han sido identificados encélulas endocrinas o neuroendocrinas. La con-tribución de cada uno al proceso secretor va-ría dependiendo del tipo de célula o de est'-mulo considerado. Sin embargo, en célulasproductoras de potenciales de acción con uncomponente de Ca21, el control de la frecuen-cia y/o duración de dichos potenciales parecedesempeñar un importante papel en el acopla-miento estímulo-secreción. Así, si bien la situa-ción resulta más variada y compleja en las cé-lulas endocrinas, la entrada de Ca2' unida alos potenciales de acción puede resultar cru-cial para el control de la elevación de Ca?- in-tracelular ligada a la exocitosls, de forma simi-lar a la descr i ta para la l iberac ión deneurotransmlsores en las terminales nerviosas.Finalmente, junto a un papel directo en la se-creción de la entrada de Ca21 debida a un in-cremente en actividad eléctrica, dicha entradapuede resultar en un aporte de Ca21 citoplas-mático que 1) amplifique la magnitud, la cura-ción y la distribución espacial de las señales deCa2' originadas por la liberación del catión dedepósitos intracelulares, y 2) constituya en ce-lulas excitables un mecanismo ce recarga delos depósitos intracelulares, vaciados tras la in-teracción con la célula de determinados ago-nistas que generen mensajeros que movilicenCa''1 de los citados depósitos.

Regulación hormonal de la respuestasecretora en células GH3 de hipófisisanterior

La hormona liberadora de tirotropina (TRH)tiene un importante papel neuroendocrino enla hipófisis anterior, estimulando la llbei-aciónoe TSH en células tirotrafas de todas las espe-cies de mamífero estudiadas, así como la sín-tesis y secreción de prolactina en célulaslactotrofas-"1'. Debido a la complejidad de!análisis de los datos derivados de hipófisis nor-males, una parte sustancial de lo que se cono-ce sobre los mecanismos de acción de factoreshipotalámicos como la TRH se ha obtenido es-tudiando líneas celulares transformadas, de lascuales la línea lactotrofa/somatotrofa GH:i estáentre las más utilizadas. La unión de la TRH asu receptor específico desencadena en las cé-lulas GH;: una serie de acontecimientos que in-cluyen la interacción del complejo hormona-

receptor con una proteína del tipo GQ;111E>16, se-

guida de una activación de la fosfolipasa C. Estaactivación da lugar a la producción de dos se-gundos mensajeros, inositol (1,4,5) trisfosfato(IP3)y 1,2-diacilglicerol (DAG). Estos efectos seacompañan con una clara modificación bifási-ca de las concentraciones intracelulares deCa2:, de la actividad eléctrica celular y de lasecreción de pro lact ina y hormona delcrecimiento1719. Así, la adición de TRH produ-ce ¡nicialmente una rápida elevación de las con-centraciones de Ca2 i, debida a la liberacióndel ion de depósitos intracelulares, que causauna rápida y transitoria estimulación de la se-creción, así como una fase inicial de hiperpola-rizaciún transitoria debida a la activación de ca-nales de K' dependientes de Ca 2 ' . Estaprimera fase es seguida de otra en la que a con-ductancia basa! de la membrana se reduce porinhibición de canales de K1 y en la que tantola frecuencia de producción como la duraciónde los potenciales de acción es Incrementada.Dado que los potenciales de acción de las cé-lulas GH:í son de Ca2 ' , esta segunda fase deactividad eléctrica incrementada causa una ele-vación sostenida de las concentraciones intra-celulares del catión divalente, fundamentalmen-te por entrada desde el medio extracelular,acompañada de una secreción hormonal man-tenida.

La modulación por TRH de ciertos canalesde Ca2* o K+ no es la causa primariadel incremento de la actividad eléctrica

Los mecanismos implicados en la producciónincrementada de potenciales de acción por laTRH y las conductancias concretas causantesde este efecto no eran conocidos. El carácterdual de ¡a cascada basada en la activación dela fosfolipasa C, junto con experimentos funda-mentalmente bioquímicos, ha llevado a sugerirque la activación de la proteincinasa C (PKC)está Implicada en los efectos mantenidos de laTRH, incluyendo la modulación de la actividadde los canales de K' que determinan latasa de disparo. Sin embargo, aún no ha podi-do demostrarse ningún efecto de la PKC en unaconductancia a K' concreta en células GH3.Mediante experimentos de clamp de voltaje uti-lizando la configuración de «célula entera» dela técnica de patch-damp, se ha descrito la ate-nuación de corrientes de K' dependientes devoltaje (del tipo denominado IKJ en célulasGH;

2C. Así mismo, tanto en nuestro laboratoriocomo en otros, se ha comprobado mediante ex-

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CANALES DE K' EN LA SEÑAL CELULAR DE. CALCIO

perimentos en condiciones de «parche perfora-do» la reducción por TRH de corrientes de K+

activadas por Ca2' y voltaje2122, así como de laactividad de los canales de Caz+ tipo L222"1. Noobstante, es improbable que la reducción decualquiera de estas corrientes sea la causa pri-maria de la segunda fase de hiperexcitabilidadporque:

1. El descenso de las corrientes activadas pordespolarización y la dependencia de voltaje delas mismas difícilmente podrían explicar les rá-pidos cambios en el potencial y la resistenciabasal que causan la leve despolarización queconlleva el incremento en la frecuencia de lospotenciales de acción.

2. La disminución de la corriente lKv no hasido detectada de forma consistente ni aun encondiciones de «clamp de célula entera», en lascuales, por otro lado, es difícilmente observa-ble el incremento en la frecuencia de produc-ción de potenciales de acción21. Además, dichadisminución no es detectable en condiciones de«parche perforado», en las que la respuesta hor-monal es preservada en su totalidad2122.

3. La reducción de las corrientes ae Ca2 ' ,que a su vez origina la disminución de las co-rrientes de K+ dependientes de Ca2+, es aúndifícil de reconciliar con la tasa incrementadade producción de potenciales de acción deCa2' y con los valores elevados del catión pro-ducidos durante la segunda fase de acción dela TRH.

Se ha sugerido que la inhibición de las co-rrientes de Ca2t podría dar lugar indirectamen-te a una reducción en la activación de canalesde K1 dependientes de Ca2 ' y, con ello, elaumento en la excitabilidad celular2223. Si bienes posible que la reducción de estas corrientessea un importante determinante de la disminu-ción de las tasas de despolarización y/o repola-rización, y con ello en el aumento de la duraciónde las espigas, probablemente no constituya unfactor crucial en la regulación de los intervalosentre espigas, es decir, de su frecuencia de pro-ducción. Así: a) los canales de K' dependien-tes de Ca2t de alta conductancia parecen de-sempeñar un papel f undamen ta l en larepolarización de las espigas, pero no en ia re-gulación de los intervalos entre espigas2526; b)tras el tratamiento de las células GH3 con áci-do okadaico (OKA, un inhibidor de proteinfos-fatasas de los tipos 1 y 2A), no ha podido de-tectarse incremento en la reducción porTRH deningún componente de corriente de K depen-diente de Ca2+ ni de los canales de Ca2+ tipo L.

Sin embargo, el efecto de la TRH sobre la acti-vidad eléctrica síes manifiestamente potencia-do por el tratamiento con OKA27'28, y c) la re-ducción de las corrientes de Ca2t tipo L no esafectada por el tratamiento de las células GH3

con toxina del cólera (CT). Sin embargo, de nue-vo el efecto de la TRH sobre la actividad eléc-trica se incrementa y su reversibilidad se anta-goniza por dicho tratamiento24.

Papel crucial de la corriente de K+

rectificadora anómala en el controlde la excitabilidad celular de las célulasGH3 y mecanismos implicados en sumodulación por TRH

Contrariamente a lo que ocurre con la reduc-ción de las corrientes de Ca2' tipo L {e indirec-tamente, pues, con la de las corrientes de K-dependientes de Ca2t), existe una correlacióndirecta entre los efectos de la hormona sobrela corriente de K1 «rectificadora anómala» y laalteración de las tasas de disparo. Dicha corrien-te y su reducción por TRH fueron originalmen-te descritas por Bauer et al2'3. Sin embargo, lainterpretación de sus resultados, obtenidos encondiciones de «clamp de célula entera» con-vencional es complicada por la rápida pérdidade los efectos de la TRH sobre la actividad eléc-trica y sobre las corrientes iónicas bajo estascondiciones experimentales. De hecho, la reduc-ción de esta corriente porTRH resulta irreversi-ble en esta situación técnica, probablemente porla pérdida de factores citoplásmicos necesariospara restaurar el estado normal de los canales.Mediante el uso de la variante de «parche per-forado», en nuestro laboratorio hemos obteni-do resultados que indican que la reducción dela corriente rectificadora anómala constituye elpunto más importante de control por TRH dela excitabilidad celular. Así mismo, la introduc-ción de distintos compuestos y enzimas en elinterior celular en condiciones de «clamp decélula entera» nos ha permitido concluir que laregulación de la corriente por la hormona esejercida mediante un mecanismo de fos-forilación/desfosforilación. Si bien la naturalezade la proteincinasa implicada no es conocidaaún, hemos podido demostrar que la proteín-fosfatasa 2A es la enzima encargada de revertirlos efectos de la hormona sobre la citada co-rriente. Estas conclusiones están basadas en lossiguientes datos:

1. Las características cinéticas de la corrien-te de K+ rectificadora anómala la convierten en

31


Fíg. 2. Modelo esquemático de los componentes mo-leculares implicados en el acoplamiento estímulo-secreción a la TRH en células adenohipofisarias GH3.La unión^ de la hormona a su receptor provoca: a) laactivación de una fosfolipasa C por vía de una proteí-na G con la subsiguiente producción de inositol (1, 4.5) trisfosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG) a partir delfosfatidilinositol (4,5) bisíosfato (PAP2). La interaccióndel IP3 con un receptor situado en la membrana dedepósitos intracelulares de Ca2t causa la liberacióndel catión al citoplasma, que a su vez origina una pri-mera fase de secreción transitoria de prolactina (PRL)acompañada de una hiperpolarízación de la membra-na plasmática por apertura de canales de K* depen-dientes de Ca2\, y b) la activación de una proteinci-nasa (PK[?I) de identidad aún desconocida que,mediante la inhibición por fosforilación de canales deK* del tipo rectificador anómalo, origina la produc-ción incrementada de potenciales de acción, con lasubsiguiente entrada de Ca2* extracelular al citoplas-ma y la generación de una segunda fase de secre-ción mantenida. Nótese la existencia de un mecanis-mo de recontrol de la operación de los canales de K*mediante la operación de la proteinfosfatasa 2A

un candidato óptimo para actuar como un re-gulador de potencial a valores cercanos al po-tencial de membrana celular basal2729.

2. Las reducciones en la corriente se extien-den durante períodos de tiempo coincidentescon aquellos en los que se produce el incremen-to en la actividad eléctrica21'242728.

3. El aumento del bloqueo de la corriente pro-ducido por la TRH tras la incubación con OKAse correlaciona con un incremento en el efectode la hormona sobre la actividad eléctrica2725.

4. Un aumento similar al que se acaba de in-dicar tanto en la inhibición de la corriente comoen los incrementos en actividad eléctrica se pro-duce tras el tratamiento de las células conrjp¿.3c.

5. Únicamente la reducción de la corrienterectificadora anómala por TRH, pero no las re-ducciones de corrientes de Ca21 o de K+ de-pendientes de Ca2+ es potenciada por el trata-miento de las células con OKA o con CT24'27.

6. La adición de TRH produce un desplaza-miento del voltaje de inactivación de la corrien-te rectificadora anómala hacia potenciales me-nos negativos2729.

7. La incubación de las células GH3 con CTproduce una reducción de la tasa de oscilaciónde las concentraciones de Ca2H ¡ntracelularasociada con la actividad eléctrica. Bajo estascondiciones, la dependencia de voltaje de inac-tivación de la corriente rectificadora anómala esdesplazada hacia potenciales más negativos24.

8. La potenciación de la inhibición de la co-rriente rectificadora anómala por OKA indica quelas reducciones en la misma causadas por laTRH son producidas mediante un mecanismode fosforilación. La presencia de tal mecanismoes confirmada por la práctica anulación del efec-to de la hormona al dializar el interior celular conun análogo de ATP incapaz de donar su fosfatogamma en reacciones de fosforilación30.

9. La inhibición irreversible de la corriente ob-servada en condiciones de «clamp de célula en-tera» convencional puede ser convertida en re-versible de modo específico al dializar el interiorcelular con medios conteniendo la subunidadcatalítica de la proteinfosfatasa 2A30.

A partir del estudio de los efectos causadospor el tratamiento con CT, y dado que los efec-tos de la toxina se producen por un mecanis-mo independiente de alteraciones en las con-centraciones de AMP-cíclico celular hemospodido deducir así mismo, que junto a la acti-vación de la fosfolipasa C por una proteína G in-sensible a modificación por CT y toxina pertúsi-ca (es decir, del tipo Gc;11

1617), la TRH causa lainhibición de la corriente rectificadora anómala(y con ello el incremento de la actividad eléctri-ca) mediante el acoplamiento de su receptor auna proteína modificable porCT (probablementedel tipo Gs)

2"'30.

Los conocimientos que hemos expuesto acer-ca de las células GH3, se recogen de forma es-quemática en el modelo mostrado en la figura 2.Es importante destacar que, si bien aplicable deforma estricta a la TRH y a estas células, es muy

32

CANALES DE K+ EN LA SEÑAL CELULAR DEL CALCIO

probable que muchos de los aspectos conside-rados hasta aquí sean aplicables a otros tiposcelulares. En cualquier caso, tras el estudio delos modelos celulares que hemos considerado,es evidente que la operación de los canales deK+ y su modificación por distintos factores neu-rohormonales pueden resultar cruciales en la ge-neración de señales de Ca24 y en la regulaciónde la actividad secretora de muy diversos tiposcelulares.

Agradecimiento

Los trabajos presentados han sido financia-dos con cargo a los Proyectos de InvestigaciónPB87-1046 y PB90-0789 de la CICYT, así comopor la concesión de una Beca de Investigacióny un Contrato de Reincorporación de la FICYTy el MEC a D. del Camino y L.A. Pardo, respec-tivamente.

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DISCUSIÓN

A.G. GARCÍA: Me pregunto si la movilización decalcio ¡ntracelular a priori porTRH no puedeestar activando estos canales de potasiocalcio-dependientes y ser motivo de esta h¡-perpolarización. Por otra parte, no acabo deentender todavía la vinculación con ese fenó-meno de hiperexcitabilidad que da lugar des-pués a la selección de canales de calcio y ala secreción. Algo parecido ocurre en la célu-la cromafín de gato donde los agonistas mus-carínicos producen una respuesta secretoray no se conoce bien cómo se produce eléctri-camente, lo que sí sabemos es que los ago-nistas muscarínicos generan una señal de cal-cio ¡ntracelular por movilización de calcio¡ntracelular y que activan una corriente de po-tasio de pequeña conductancia calcio-depen-diente. Lo que por el momento se desconocees si existe un canal de cloro involucrado quepueda producir una despolarización subsi-guiente por salida de cloro y eso generar po-tenciales de acción y reclutamiento de cana-les de calcio. Quisiera preguntarle: ¿existealguna analogía entre este sistema que des-cribo en la célula cromafín con el receptormuscarínico y la TRH en la hipófisis anterior?

F. BARROS: No existe una correlación entre ladenominada fase 1 producida por la liberaciónde calcio en depósitos y la fase 2, y pareceque los dos mecanismos son independientes.Respecto a si puede haber en otros tipos cecélulas mecanismos parecidos, creo que encada tipo de célula la hiperexcitabilidad se po-drá dar de forma distinta.

W. BUÑO: En el experimento que mostró de cu-rrent clamp se observan potenciales de accióne inmediatamente después de la hiperpolarnzación las espigas son más pequeñas, lo queapoya un aumento de conductancia duranteeste tiempo. Sin embargo, propone que se es-tán cerrando canales de potasio, y que la des-polarización que ve y el aumento de la activi-dad es por un cierre de los canales de potasio.Creo que debe intervenir algún otro factor, porejemplo, activación de canales de calcio yaque de otro modo no se explica que las espi-gas sean más pequeñas de tamaño. Por otraparte, me gustaría que aclarara algunas cues-tiones relativas al rectificador anómalo. La pri-mera es cómo un bloqueo de un rectificadoranómalo logra aumentar la actividad y, la se-gunda, ¿cómo es que después de que termi-ne el curso hiperpolarizante con el que acti-va, el rectificador anómalo tiene una tremendacela de entrada?, y ¿qué es esa cola de en-trada?

F. BARRCS: Para la obtención de estos registrosse aplicó una considerable cantidad de filtra-do, a efectos de observar frecuencias de es-pigueo en períodos largos de tiempo porque,de lo contrario, sería absolutamente imposi-ble obtener 30 min de registro, debido a limi-taciones en la capacidad del ordenador, Porotra parte, ios potenciales de acción durantela fase 2 no son cinéticamente iguales a losque la célula tiene antes de añadir TRH, sinoque son bastante más anchos, tienen una des-polarización y una repolarización bastante más

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CANALES DE K4 EN W S E W CELULAR DEL CALCIO

lenta, de tal forma que aparte de que hayamás potenciales de acción se debe conside-rar también la posibilidad de que los propioscanales de calcio que en parte se encuentranbloqueados estén abiertos durante muchomás tiempo, y que la señal del calcio verda-deramente pueda ser bastante mayor.En cuanto a la cola de entrada, la explicaciónes muy sencilla; estas células tienen una co-rriente de potasio voltajedependiente, quecuando se mantiene un potencial de membra-na fijo de entre -20 y 0 mV está totalmenteinactivada, pero durante 500, 600 m s o l sde hiperpolarización que se utiliza para ver elrectificador anómalo esta corriente se reacti-va, y al volver a -10, o 0 o -20 mV, se ve lacola que se debe a la operación de los cana-es de potasio voltajedependientes que, por

cierto, no se modifica con TRH ni con otra se-rie de fármacos. Es un control interno que nospuede servir, y por eso hacemos el experimen-to y mantenemos esa cola ahí para saber siel efecto es realmente específico sobre el rec-tificador o existen problemas de resistencia enserie u otro tipo de problemas que modifiquenotras conductancias, y específicamente estecanal dependiente de voltaje.

J. GARCÍA-SANCHO.- Quisiera insistir en un puntoque usted ha mencionado al principio. Encélulas no excitables la apertura de canalesde potasio o de cloruro es importante paramantener el gradiente electroquímico paraque el calcio pueda entrar, es decir, si el cal-cio entra y esa entrada es electrogénica y secolapsa el gradiente, eso mismo detiene la en-trada.

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Canales de potasio sensibles a ATP. Sulfonilureasy activadores de canales de potasio

B. SoriaDepartamento de Fisiología. Facultad de Medicina. Universidad de Alicante.

Introducción

Tipos de canales de K*. Clasificaciónelectrofisiológica y funciona!

Los canales de K+ son proteínas integralesde membrana que permiten el paso selectivoa través del ion K*. Son ubicuos, diversos yexisten más de 20 tipos distintos. Su potencialfarmacológico y terapéutico está determinadopor sus especiales características biofísicas, fi-siológicas y distribución celular. Los canales deK+ pueden clasificarse a partir de su cinéticade apertura-cierre, propiedades de activacióne inactivación, modulación por lígandos o porvoltaje y por su sensibilidad característica a unagama amplia de agentes farmacológicos1, Latabla I expone una clasificación no exhaustivade los canales de K- (p. ej., no incluye cana-les regulados por volumen o activados porNa+).

El canal de K* regulado por ATP (KATP)

El adenosintrifosfato (ATP) se encuentra en lascélulas a concentraciones superiores a las re-

queridas para mantener la actividad de las bom-bas iónicas y procesos contráctiles, función ga-rantizada además por la existencia de otros de-pósitos intracelulares de fosfocreatina ycompuestos con enlaces de alto valor energéti-co. Por lo tanto, no parece que haya base paraconsiderar al cociente ATP/ADP como una se-ñal reguladora de las funciones celulares en con-diciones normales. En 1983, Norria describió unnuevo tipo de canal en membranas celularescardíacas2. Se trataba de un canal que se blo-queaba cuando el ATP aumentaba en la caracitosólica del mismo. En la actualidad existen su-ficientes evidencias de que el ATP intracelularregula un tipo de canales de K+ presentes enla célula beta pancreática, músculo cardíaco,músculo liso y ciertas neuronas3. Aparte defuncionar como un sensor de glucosa (véaseposteriormente) un canal con estas caracterís-ticas puede ser de utilidad como mecanismo deprotección frente a la isquemia celular en célu-las nerviosas o en el miocardio. La isquemiainduce una disminución en la concentración ¡n-tracelular de ATP, como consecuencia de elloel canal estará activado y la célula se hiperpo-

TABLA ICLASIFICACIÓN DE LOS CANALES DE

Regulados por voltajeRectificador retrasado

Transitorio HA)

Rectificador de entradaRegulados por ligandos

KCo MKKca LK

KATP

Acoplados a proteínas GKA a-,

Toxinas

Dendrotoxina,NoxiustoxlnaDendrotoxina

MCDP

CaribdotoxlnaApamina, Lq

VIII

Agente farmacológico

Sintéticos

TEA, 4-AP(débil)

9-AA, quinina

TEA

TEA, quinina

Quinina, 9AASulfonilureas

AP

Iones

Ba 2 + , Cs +

Cs +

Ba2 +

Ba 2 + , Cs +

37


larizará, lo que impide la apertura de canalesde Ca2+ y, por lo tanto, el aumento del (Ca2i)¡;

lo que en condiciones de bajo ATP es extrema-damente tóxico.

Caracterización bioquímica

En la actualidad se desconoce la estructuramolecular del canal KATP. La metodología quese está utilizando es la purificación y determi-nación de las características bioquímicas del re-ceptor de sulfonilureas sin que se conozca aciencia cierta si el receptor de sulfonilurea y elcanal KATP son una misma entidad molecular ose trata de proteínas asociadas. Mediante téc-nicas no desnaturalizantes y el análisis de inac-tivación por radiación se ha estimado un pesomolecular aproximado de 134-182 kD para elreceptor de sulfonilurea. La secuenciación deesta proteína permitirá conocer si hay secuen-cias homologas con otros canales de K\ en úl-timo caso si se trata del canal o de una proteí-na asociada.

Propiedades biofísicas y fisiológicas del KATP

Permeabilidad iónica y conductancia

El canal KATP es muy selectivo para potasio yla permeabilidad al Na+ es prácticamente des-preciable. El Rb+ puede sustituir al K+ conidéntica permeabilidad y ha sido utilizado comotrazador del flujo a través del canal. Se trata deun canal independiente de tiempo y voltaje yaque las distribuciones de canal abierto y cerra-do no cambian sustancialmente con el poten-cial de membrana. En presencia de 5 mM deK+ el canal KflTP de la célula beta pancreáticaposee una conductancia para las corrientes desalida de aproximadamente 12 pS, mientras quepara las corrientes de entrada (140 mM de K*en la pipeta) es de unos 50 pS. La relacióncorriente-voltaje para el canal único muestra queel canal rectifica (en un medio simétrico las co-rrientes de salida son menores que las de en-trada). Parece claro que la principal causa dela rectificación es el bloqueo dependiente de vol-taje de las corrientes de salida por cationes ¡n~tracelulares, principalmente Na+ y Mg2+. Enparches escindidos se ha podido observar unsegundo canal sensible a ATP. Es de menor con-ductancia (5 pS para corrientes de salida en 140mM de K+ y aproximadamente de 4 pS encondiciones fisiológicas) y del que se descono-ce todavía su papel fisiológico. Por otra parte,

el canal KflTP descrito en la fibra muscular lisaposee una conductancia mucho mayor (130 pSpara 120 mM de K+ ¡ntracelular y 60 mM deK+ externo) que el KATP del músculo cardíaco yde la célula beta. Es decir, se trata de una fami-lia heterogénea de canales de K+3'4.

Modulación por nucleótidos

La principal propiedad de este canal es sumodulación por ATP intracelular. La modulaciónse realiza de dos formas: bloqueo al aumentarla concentración de ATP57 y mantenimiento dela actividad del canal para concentraciones másbajas89.

Bloqueo. Este es un efecto directo de la mo-lécula y no parece mediado por la fosforilacióndel canal, ya que los análogos no hidrolizablesde ATP son capaces de producir un bloqueo si-milar en parches encindidos. La secuencia deefectividad de los derivados de adenina es:ATP>ADP>AMP>adenosina. Más reciente-mente, la utilización de un protocolo que impi-de el «lavado» de los canales dependientes deATP ha permitido precisar el valor de la cons-tante aparente de disociación en 18 /¿M. Pare-ce difícil reconciliar la extraordinaria sensibilidadpara el ATP del canal KATP con las concentracio-nes intracelulares de dicho nucleótido (normal-mente en el intervalo nM). Existen varias líneasarguméntales para tratar de explicar este hecho:1) el canal está regulado por el cocienteATP/ADP. Se ha podido comprobar que ADPcompite con el ATP e inhibe la inhibición; 2) estecanal está también regulado por pH y porMg2+, y 3) es muy probable que la membranaplasmática esté siendo regulada por una reser-va distinta que el resto de actividades citoplás-mlcas y que cerca de la membrana el ATP va-ríe de forma mucho más rápida que el ATPglobal. En el músculo cardíaco se demostró quelos sustratos glicolíticos eran más eficaces abas-teciendo el ATP necesario para bloquear el ca-nal que los sustratos mitocondriales.

Modulación. La acción de los nucleótidos so-bre este canal es compleja. Así, el ATP, que sepensó inicialmente que sólo bloqueaba el ca-nal KATP, también reactiva los canales tras el«lavado»89. Este efecto, al contrario de lo queocurre con el bloqueo, parece depender delMg2+. Es decir, el ATP, que se comporta comoun bloqueador a concentraciones más altas, esal mismo tiempo necesario para que el canalmantenga una probabilidad alta de apertura.

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CANALES DE POTASIO SENSIBLES A ATP. SULFONILUREAS Y ACTIVADORES DE CANALES DE POTASIO

Para poderlo registrar en el modo de célulaentera el interior de la pipeta debe contener0,3 mM de ATP, lo que permite estudiar duran-te un largo período la conductancia del canalde potasio dependiente de ATP. Todo parece in-dicar que se trata de un canal con una modula-ción en la que participan segundos mensajeros,el potencial redox intracelular (NADPH/NADP),proteínas G, etc. En estudios realizados en laconfiguración de «célula abierta» en los que semantiene la integridad del citosqueleto y de cier-tas estructuras se ha comprobado que el pro-ceso de lavado es mucho más lento y que el ATP,incluso a concentraciones de 5 mM, no llega abloquear completamente el canal.

Papel del canal KATP en la actividad eléctricadel músculo cardíaco y en músculo lisovascular

En 1978, Carmeliet ya indicó que el efectomás notable de la hipoxia cardíaca es el acor-tamiento del potencial de acción. Dicho efectohabía sido descrito 20 años antes por Trautwein,Corabeouf y otros autores. En 1983, Noma des-cribió la presencia de canales selectivos a po-tasio que eran inhibidos por ATP ¡ntracelular(KATp), postulando que dichos canales seríanlos responsables del acortamiento del potencialde acción2. La activación del KATP produce unacortamiento del potencial de acción y la hiper-polarización del músculo liso vascular.

Papel del canal KATP en la actividad eléctricade la célula beta pancreática

En la célula beta en reposo la permeabilidaddominante es la debida al canal de potasio de-pendiente de ATP (KATp)9. Se trata de un canalque se inhibe por ATP aplicado por la cara in-terna de la membrana. Ashcroft et al35 lo lla-maron canal G porque su actividad disminuyecuando se aplica glucosa a células intactas. Estecanal disminuye también su probabilidad deapertura en presencia de otros nutrientes comomañosa, leucina, gliceraldehído y alfacetoisoca-proato. Este grupo de sustancias poseen la ca-racterística común de metabolizarse y producirun aumento del ATP intracelular y todos ellospertenecen a la categoría de iniciadores de lasecreción de insulina. Lactato y arginina, que ac-túan como potenciadores de la secreción indu-cida por un iniciador, no afectan a este canal(aunque sí disminuyen la apertura del ca-nal KCa). Se trata de un canal regulado metabó-licamente cuyas propiedades lo convierten en

firme candidato al «sensor de glucosa» en lascélulas beta pancreáticas y posiblemente enotras células como las hipotalámicas responsa-bles de la sensación de hambre y de saciedad.Utilizando la configuración de cell-attached seha podido comprobar que este canal se bloqueapara concentraciones bastante bajas de gluco-sa (5 mM), por lo que se puede pensar que estecanal contribuye sólo a una despolarización ini-cial de aproximadamente 5-10 mV y que no par-ticiparía en la respuesta oscilatoria. Para la gé-nesis de ondas lentas se necesitaría de laparticipación de otro canal, posiblemente el ca-nal por Ca+2 y voltaje (KCa) que funciona en elintervalo de concentraciones citosólicas deCa+210" y de potenciales de membrana que sedarían en la respuesta oscilatoria, aunque laconducta oscilatoria puede también explicarsepor la inactivación de un canal de K+.

Farmacología del canal KATP

Los canales iónicos como receptoresfarmacológicos

Los canales iónicos pueden considerarsecomo un tipo especial de efectores celulares. Es-tán acoplados a una gran variedad de inputs in-formacionales y sirven para permear de formaeficiente y selectiva determinados iones (Na+,K+, Ca2+ y Ch). El criterio de selectividad far-macológica es la base de sus aplicaciones te-rapéuticas y hace posible hablar de los canalesiónicos como receptores farmacológicos. El ca-nal KATP es bloqueado con baja especificidadpor gran parte de los bloqueadores de canalesde K+, como tetraetilamonio, quinina y quinidi-na pero, sin embargo, posee la capacidad mu-cho más específica de ser bloqueado por sulfo-nilureas.

Bloqueo por sulfonilureas

Se sabe desde los trabajos de Loubatieres quelas sulfonilureas (tolbutamida, glibenclamida)son eficaces en el tratamiento de la diabetes me-llitus no insulinodependiente (tipo II). Más re-cientemente, se pudo comprobar que las sulfo-nilureas bloqueaban el KATP

12. El bloqueo dedicho canal induce de forma simultánea elaumento de [Ca2+]:1314. El canal de potasio de-pendiente de ATP, o un péptido asociado al mis-mo, se considera el sitio diana para el efecto delas sulfonilureas hipoglucemiantes. Tolbutamiday glibenclamida se unen a un receptor y «con-

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gelan» el canal en su configuración cerrada. Estapropiedad permite utilizar dichos fármacoscomo marcadores del canal KATP (o de una pro-teína asociada al mismo) y representar un pa-pel similar al de la TTX para el canal de Na+,la w-conotoxlna y las dihldropirlnas para deter-minadas subunidades de los canales de calcioy la apamina y la caribdotoxlna para ciertos ca-nales de potasio. En ausencia de glucosa las sul-fonilureas son capaces de despolarizar la célu-la beta e ¡nielar la descarga continua de espigasy, por lo tanto, el aumento del [Ca2+]¡. Es im-portante señalar que este canal posee una res-puesta alterada a sulfonilureas (gllbenclamida,tolbutamida) y quinina en ratones obesos e hi-perglucémicos. Estos ratones, por otra parte, sonsensibles a la apamina (un bloqueador del canalde K+ activado por Ca2+ de baja conductanciaque no afecta a los ratones normales). Esta pue-de ser una Indicación de «dónde» buscar al-teraciones en los trastornos en la secreciónde insulina en algunas formas de diabetes15.En humanos el canal KATP posee idénticaspropiedades en cuanto a conductancia, ciné-tica, sensibilidad al ATP e inhibición por sulfo-nilureas.

Efecto de los activadores de canales de Kf

Este grupo de sustancias incluye el nicoran-dilo, minoxidilo, pinacidilo, cromakalino (BRL34915) y RP 49356. La química y selectividadtisular ha sido revisada recientemente por Ro-berston y Steinberg16. La identificación del ca-nal KAjp en el músculo liso vascular ha abiertola posibilidad de explorar dichos compuestos enel control de la presión arterial. El pinacidilo fuedesarrollado a mediados de los setenta por LeoPahrmaceuticals a partir de una serie de tioal-kilureas apreciándose su papel de vasodilata-dor potente, aunque no fue hasta 1987 cuandose le reconoció como un activador de canalesde K'. Cromakalina y RP 49356 son muy dis-tintos desde el punto de vista químico, sin em-bargo, su efecto farmacológico es indistinguibleen músculo cardíaco y músculo liso vascular.

Los activadores del canal de K+ son com-puestos de baja especificidad. La cromakalinapuede bloquear una corriente de K+ basal enel músculo cardíaco. Más importante, cromaka-lina puede actuar sobre un canal de potasio ac-tivado por calcio en músculo liso vascular incor-porado en bicapas lipídicas, pero cambiando ladependencia de voltaje del canal. Se descono-ce el verdadero papel que in vivo desempeñaesta inhibición.

TABLA IIAPLICACIONES TERAPÉUTICAS

DE LOS MODULADORES DEL CANAL KATP

SulfonilureasIsquemia cardíaca y cerebralSecreción de insulina (diabetes tipo II)Arritmias de origen isquémico

ActivadoresAnginaAntiarrítmicosAsmaSNC

AntiepilépticosAntineurotoxinas

Crecimiento capilarHipertensiónSíndrome de la vejiga irritableSíndrome del colon irritableIsquemiaFatiga muscular

AntiarrítmicosArritmia cardíaca

El mecanismo ha sido explorado en el mús-culo cardíaco. Existen suficientes evidencias ex-perimentales que sugieren que esos agentes dis-minuyen la sensibilidad del canal por el ATP.Actúan desplazando la curva dosis-respuestapara la inhibición hacia la derecha, sin ningunamodificación en el coeficiente n de Hill de di-cha curva. Esta demostración podría sugerir quelos 2 agentes actúan sobre un sitio común. Laevolución temporal de los procesos de apertu-ra y cierre del KATP están alterados en presen-cia de activadores del canal de K+.

Aplicaciones terapéuticasde los moduladores del canal KATP

Existen pocas dudas acerca de la potenciali-dad terapéutica de la intervención farmacológi-ca de los canales de KATP. La tabla II recoge unresumen de las aplicaciones terapéuticas de losagentes farmacológicos que modulan el canalKATP. Como puede comprobarse, abarcan des-de la diabetes tipo II a la isquemia cerebral yla cardíaca, la hipertensión y la arritmia cardía-ca. Existen otros campos en los que puede in-teresar su potencial terapéutico: la reacción en-tre el crecimiento capilar y los activadores delcanal aún no se ha definido con exactitud. Lasáreas adicionales de investigación que puedenresultar de importancia considerable incluyen alsistema inmune ya que la activación del canal

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CANALES DE POTASIO SENSIBLES A ATP SULFOIMILUREAS Y ACTIVADORES DE CANALES DE POTASIO

de K+ es un componente integral de la activa-ción de los linfocitos B y T.

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DISCUSIÓN

J, LÓPEZ BARNEO: En relación con este canal re-gulado por ATP que, como usted ha comen-tado, es bastante ubicuo ¿hay alguna carac-terística del que se expresa en célula beta quele haga distinto de otros canales regulados porATP, como el del corazón o del músculo liso?

B. SORIA-. En principio, las propiedades de con-ductancia y de rectificación del canal en cé-lula beta y en músculo cardíaco son bastanteparecidas. Recientemente se ha descrito unoen músculo liso que tiene una conductanciamucho mayor, es decir, la conductancia paraestos canales en músculo liso y en célula betapancreática está entre 50 y 60 pS para 140mmol potasio en la pipeta, si vamos a concen-traciones fisiológicas posiblemente esté alre-dedor de 25 pS, pero en el músculo liso sehan descrito canales de hasta 130 pS. Por otraparte, la rectificación o el bloqueo del canalpor ATP en el caso de la célula beta es Mg2-ATP, y no ATP libre, mientras que en músculo

cardíaco parece que tanto el Mg2-ATP comoel ATP libre son capaces de bloquearlo.

A.G. GARCÍA: Clínicamente, la limitación que po-seen muchos de estos fármacos es su escasaselectividad. De hecho, lo primero que se ex-ploró de los activadores de canales de pota-sio es su efecto antiarrítmico, aunque su usoen esta indicación se ha desechado debido ala toxicidad y a su efecto arritmógeno. Sin em-bargo, al igual que ocurre con los canales decalcio, los canales de potasio muestran dife-rencias en los distintos tejidos.

C. GONZÁLEZ: ¿Podría haber alguna relación en-tre la regulación del flujo coronario y los ca-nales de potasio sensibles a ATP?

B. SORIA: Sí, esa es una de las opciones que sehan postulado. Hay quien opina que podría serprecisamente la caída de ATP y el aumento delADP, AMP o adenosina, lo que podría regulareste canal desde la cara intracelular. La regu-lación de este canal es bastante compleja y,

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por otra parte, presenta paradojas en el sentidode que la concentración de ATP dentro de lascélulas es de 5 o 6 mmol mientras que la K,del canal es 20, 50, 70 mmol, con lo cual loprimero que hay que explicar es a qué se debeesta diferencia tan notable. Existen varias lí-neas de explicación y una de ellas es el cocien-te ATP/ADP; el ADP se comporta más comoactivador del canal, y posiblemente las varia-ciones del cociente ATP/ADP tienen gradientes.El ATP se consume sobre todo en la zona de lamembrana porque las bombas necesitan ATP, yallí donde se consume el ATP se está generan-do ADP. En la vecindad de la cara interna delcanal, que es de lo que estamos hablando seproduce una disminución de ATP y un aumentode ADP, lo que contribuye a la regulación.

C. GONZÁLEZ: Pero eso sería a la inversa en la cé-lula beta en la que necesitamos que se gene-re el ATR

B. SORIA: El mecanismo es básicamente el mis-mo. Lo que ocurre en la célula beta es que estáen condiciones de ATP más básales, y el ATPsí que aumenta cuando se aportan nutrientes.Posiblemente la explicación del gradiente o delcociente ATP-ADP no sea suficiente; se ha ha-blado de un activador interno que nunca seha caracterizado bien, de una sensibilidad dis-tinta cuando uno separa el parche escindidode cuando está unido a todo el citosqueletoo que puede haber regulación por cofactoresreducidos. En realidad, la pregunta de cómose regula el canal continúa abierta.

M. HURLÉ: Querría saber si estos canales pue-den ser modulados directamente a través deproteínas G y qué sistemas de neurotransmi-sión podrían estar implicados.

B. SORIA: Hay al menos 4 o 5 sustancias, no meatrevo a decir neurotransmisores, somatosta-tina, galanina o posiblemente el CGRP, que pa-rece ser que abren el canal a través de un me-canismo de proteína G, es decir que, apartede la acción directa del ATP a nivel interno almenos para galanina y somatostatina existenbastantes evidencias que el mecanismo deacoplamiento es una proteína G.

M. HURLÉ: ¿Por qué muchas veces nos encon-tramos con discrepancias entre los estudioselectrofisiológicos, donde quizá no se puedenmanipular con sulfonilureas las acciones de undeterminado fármaco o neurotransmisor cuan-do, por el contrario, algunos estudios funcio-nales ponen de manifiesto con facilidad este

tipo de interacciones? ¿Hasta qué punto cuan-do en un estudio funcional observamos unainteracción de este tipo podemos deducir queun determinado canal está modulado por unfármaco o sistema de neurotransmisión con-cretos?

B. SORIA: En el preparado ¡n vitro, y cuando sólose estudia el canal, de alguna forma es fácilinterpretar los resultados. En el animal enteroesto no es así ya que cuando un canal estáen múltiples localizaclones el problema es pre-cisar en qué condiciones se encuentra cadaterritorio diana para ese fármaco.

C. MONTIEL ¿Las células beta disparan ante elestímulo de glucosa de forma sincrónica, o haycélulas que son refractarias a la glucosa en unmomento dado?

B. SORIA: En realidad algunas de las imágenesque he mostrado son del islote entero, no sonde célula única, y hay por lo menos un par detrabajos que exploran específicamente la sin-cronía. Hasta donde sabemos es un fenóme-no bastante sincrónico en todo el Islote y estasincronía de alguna forma está reflejando quetodas las células están contestando y pensa-mos que el hecho de que las células beta es-tén organizadas en islote y no dispersas aisla-damente tiene que ver precisamente con estaselección por parte de las células más activaspara secretar de las que están menos acti-vas para secretar. Entonces, el islote se con-vierte en un mecanismo de alta eficacia parala secreción de insulina.

J. TAMARGO: Quisiera referirme a los activadoresdel canal de potasio. Estoy absolutamente deacuerdo con lo que ha dicho el Dr. Soria conrespecto a miocardio y con respecto a célulabeta; sin embargo, esto es un ejemplo decómo algo que tiene un gran interés acadé-mico carece de aplicación desde el punto devista clínico. Nadie ha comercializado ningu-no de estos productos, ni creo que los comer-cialice en los próximos años, por dos motivos;primero, porque un aumento marcado de laconductancia del potasio acorta mucho la du-ración del potencial de acción y produce arrit-mias; y segundo, porque la reducción de lapresión arterial se obtiene a costa de un efec-to muy rápido y muy brusco que activa el sis-tema renina-angiotensina-aldosterona y el tonosimpático, lo cual obliga a añadir un bloquea-dor beta, además de que producen retenciónhidrosalina.

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Canales de potasio regulados por oxígenoJ. López Barneo

Departamento de Fisiología Médica y Biofísica. Universidad de Sevilla.

Introducción

El oxígeno, uno de los elementos más abun-dantes de la biosfera, es de importancia crucialpara el mantenimiento de la mayoría de las for-mas de vida sobre la Tierra. Este elemento esel aceptar final de los electrones en la cadena'espiratoria y, por lo tanto, permite la síntesis deATP mediante la fosforilación oxldativa. A pesarde su importancia fundamental, se dispone deun conocimiento muy limitado sobre la formaen que los organismos son capaces de detec-tar la disponibilidad de 02 y de adaptar la cap-tación del gas a las diversas situaciones fisioló-gicas y condiciones ambientales. En animalesmuy evolucionados como los mamíferos, con unmetabolismo energético alto, el suministro de02 a las células se asegura mediante los siste-mas respiratorio y circulatorio. El O2 se difundeen la sangre en los pulmones, se concentra porla unión a la hemoglobina y, junto a esta, setransporta a los tejidos. La captación de O2 porel sistema respiratorio se regula, entre otros fac-tores, por la disponibilidad de O2. En condicio-nes de hipoxia (como, por ejemplo, durante laexposición aguda a grandes alturas), la frecuen-cia respiratoria se incrementa en respuesta a ladisminución de la tensión de O2 en la sangre(PO2). En los últimos años se ha demostradoque en este sistema de regulación fisiológica,los cambios en la PO2 arterial se detectan porun tipo especial de canal de K+ que se expre-sa en las células quimioceptoras del cuerpo ca-rotídeo (células glómicas) y cuya actividad se re-gula por los cambios en la concentración de O2en el medio extracelular. Experimentos recien-tes sugieren que los canales de KT sensibles aO2 no se encuentran restringidos al cuerpo ca-rotídeo sino que se expresan en otros tejidosdonde están involucrados en las respuestas fi-siológicas y fisiopatológicas a la hipoxia. En esteartículo se describen las características gene-rales de los canales de K+ sensibles a O2 y deios mecanismos que podrían participar en la in-teracción entre el 02 y la estructura oligomérl-ca del canal iónico. Se discute además de for-ma breve ei significado funcional de la regu-

lación de canales iónicos por los cambios dePO,.

Caracterización de los canales sensiblesa oxígeno en los quimioceptores arteriales

Aunque la función quimioceptora del cuerpocarotídeo se conoce desde hace casi unsiglo12, los mecanismos implicados en la de-tección de los cambios de PO2 se han mante-nido oscuros. En las últimas décadas ha existi-do un acuerdo general en que las célulasglómicas, o de tipo I, las más abundantes enel órgano, son los elementos fundamentalesen el proceso de transducción sensorial. Estascélulas segregan varios transmisores en respues-ta a la hipoxia que estimulan las fibras nervio-sas aferentes del nervio del seno, que a su vezson las que envían la Información sensorial alsistema nervioso central35. Una Investigacióndesarrollada recientemente en varios laborato-rios ha demostrado que las células glómicascontienen canales Iónicos dependientes de po-tencial para Na*, Ca2+ y K+ y que, como otrascélulas excitables, pueden generar potencialesde acción de forma repetitiva68. La caracte-rística electrofislológica más Importante de lascélulas glómicas es que la corriente de K+ seinhibe reversiblemente en respuesta a la dismi-nución de la PO2

79;2. Este fenómeno se ilustraen la figura 1 con registros de corriente macros-cópica de K- tras el bloqueo del resto de loscanales dependientes de potencial. La corrien-te de potasio tiene un umbral de activación aaproximadamente 40 mV y se inactiva casi com-pletamente en 300 ms8'12. En promedio, la ex-posición a P02 entre 10 y 30mmHg produceuna Inhibición de la corriente del 30-40%. Lamodulación de la corriente de K+ por los cam-bios de la P02 es selectiva (las corrientes deNa+ y Ca2+ permanecen inalteradas) y se pue-de observar sin atenuación varias veces en unamisma célula712.

Como en otras células excitables, la corrien-te macroscópica de K+ de las células glómicasse debe a la actividad de varias subpoblacio-

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FARMACOLOGÍA DE LOS CANALES ÚNICOS

O mV

-80

Control

Baja PG2

Recuperación

0,5 NA

bC ms

Fig. 1. Corriente de potasio regulada por O2 en cé-lulas glómicas. Las corrientes se registraron duranteun pulso de potencial desde -80 hasta 0 mV con laconfiguración de «célula completa» de la técnica depatch clamp. La composición de las soluciones fuela siguiente. Externa: 140 CINa, 2,7 CIK, 2,5 Cl2 Ca,2 CIMg, 10 Hepes, 5 glucosa, 1 mhfi tetrodotoxina,pH:~7,3; interna: 30 CIK 80glutamato-K, 20 FK, 10Hepes, 10 EGTA, 2,5 CI2Mg, pH: 7,2. La solución ex-terna se equilibró bien con aire (control y recupera-ción, P0-.=145 mmHg) o con N2 (baja P0< = 10-20 mmHg). Temperatura=22-25 °C. Modificada deBenot AR et al19.

nes de canales dependientes de potencial. Encélulas glómicas de conejo adulto se expresanal menos tres tipos distintos de canales de KH

que difieren en su dependencia de Ca2+ y vol-taje, conductancia unitaria y sensibilidad a loscambios de P02

13. Existen los típicos canalesde K+ activados por Ca2+ (canales KCa de granconductancia (aproximadamente 200 pS enconcentraciones simétricas de 130-140 mM deK+) similares a los que se observan en casi to-das las células excitables, Jurto a estos, tam-bién se pueder registrar canales de conductan-cia muy pequeña (unos 16pS) que, aunque noestudiados con micho detalle, no pajeen se'dependientes de Ca2+. Además de estos dos ti-

+20 mV-80 mV

Pulso de potencia

Corriente macroscópica

0,5 nA

Corriente unitaria

Corriente promedio

2 DA

2 pA

bO ms

Fig. 2. Curso temporal de la corriente macroscópicade K' y de la corriente unitaria a través de los cana-les de K* sensibles a 02. A: corriente macroscópicadurante una despolarización de -80 hasta +20 mV;B: corrientes unitarias en un parche con 3 canalesen la configuración outside-out utilizando el mismo pul-so de potencia!; C: promedio de 23 barridos conse-cutivos similares a los que muestran en B. La com-posición de las soluciones es similar a la figura 1.Modificada de Benot AR et al'9.

pos de canales, insensibles a los cambios deP02, existe un tercer tipo de conductancia in-termedia (unos 40 pS) y cuya probabilidad deapertura se incrementa con la despolarizacióny se inhibe con la disminución de la P02. Es-tos canales regulados por cambios en la P02(de forma abreviada canales K02) se expresanen un número de aproximadamente 900 por cé-lula y son los mayores responsables de las pro-piedades de la corriente macroscópica deK+I315.

La relación entre los canales KO? y la co-rriente macroscópica de K+ se ilustra en la fi-gu-a 2. En el panel Ase muestra un "egistro decorriente de K* durarte un pulso de potencialque despolariza la membrana desde el poten-cial mantenido de -80 hasta +20mV. Tras laescisión de un parche de membrana que con-

44

CANALES DE POTASIO REGULADOS POR OXÍGENO

+20 mVr-80 mV-1

Control

iHipoxia Recuperación

fíg. 3. Modulación delos canales KO2 por latensión de 02. A: barrí-dos representativos ob-tenidos por despolari-zaciones desde -80hasta +20 mV en unparche escindido en ¡aconfiguración outside-out que contenía comomáximo un solo canalabierto. Los registros serealizaron en una solu-ción externa control(P02 = 145 mmHg) ydurante el paso de laP02 desde 145 a80 mmHg (hipoxia).Los pulsos se aplicaroncada 5 s; B: corrientespromedio de 15 a 30barridos consecutivos

de corriente unitaria en las diferentes condiciones experimentales. Las soluciones utilizadas son las mismas queen la figura 1. Modificada de Benot AR et al19.

Comente promedio

Abierto. Cerrado

2pA

50 ms

tenía 3 canales, la aplicación de un pulso de lasmismas características produce la apertura ycierre de los canales en el parche (panel B).Cuando cada uno de los canales se abre con-tribuyen con pulsos de corriente de unos 1,8 pAde amplitud. Los canales se abren preferente-mente al inicio del pulso y posteriormente en-tran en un estado inactivado. En el panel C semuestra el promedio de 37 registros de activi-dad unitaria donde se aprecia claramente lainactivación de los canales con un curso tem-poral muy similar al de la corriente macroscó-pica. El efecto más aparente de la hipoxia so-bre los canales K02 es una disminuciónreversible de la probabilidad de apertura1314.Este hecho se ilustra en la figura 3A con 3 gru-pos de registros obtenidos de un parche escin-dido (donde se aprecia como máximo un solocanal abierto) sometido a despolarizaciones su-cesivas desde -80 a +20 mV. El parche demembrana fue expuesto a soluciones equilibra-das con aire (control y recuperación) o con unamezcla de aire y N2 (hipoxia). Los promediosde 15 a 30 barridos consecutivos registrados enlas diferentes condiciones experimentales semuestran en la figura 3B. La probabilidad deapertura del canal (po=O,61) decreció de for-ma marcada tras la exposición a una P02 baja(po=0,28) con vuelta a los valores controles(po=O,74) tras ia restauración de la PO2 nor-mal. En el rango entre 0 y +30 mV la exposi-ción a hipcxla (aproximadamente 10 mmHg)conduce a un incremento de 1,5-2 veces en la

probabilidad de apertura. Los registros de la fi-gura 3A también demuestran que los cambiosen la P02 no afectan a la amplitud de la co-rriente unitaria.

Interacción entre el oxígenoy los canales de K+

El estudio detallado de la interacción del 02con los canales de K̂ indica que la disminu-ción de la probabilidad de apertura en condi-ciones de hipoxia se debe a modificaciones depropiedades cinéticas bien definidas15, lo quesugiere que la tensión de O? influencia la con-formación de dominios específicos de la molé-cula. Cambios en la PO2 podrían regular el es-tado redox de grupos tiol, localizados bien enla molécula del canal K02 o en un sensor aso-ciado formando parte de la misma estructuraoligomérlca (véase posteriormente), que deter-minan sus propiedades cinéticas. Algunos an-tecedentes que sustentan esta hipótesis son laregulación de la inactivación en algunos cana-les de K+ recombinantes dependiendo del es-tado redox de residuos cisteína existentes en eldominio aminoterminal de la molécula16'17, o laexistencia de un sitio de regulación recfox en elcomplejo receptor NMDA-canal18. Para contras-tar estas ¡deas se ha estudiado el efecto de an-tioxidantes sobre los canales KO2. En la figura4 se comparan el efecto de la hipoxia y de unagente reductor como el glutatión reducido(GSH) en un mismo parche de membrana es-

45

FARMACÓLOGO DE LOS CANALES IÓNICOS

• J U T J L - J T ™

Corrientes promedio

Glutatión

Corrientes promedio

100 ms

fig. 4. Exposición de un mismo macroparche de mem-brana con un número máximo de 6 canales simultá-neamente abiertos a hipoxia (PO2=10-20 mmHg) ya glutatión reducido (GSH, 1 mM). Los pulsos se apli-caron en todos los casos desde -80 hasta +20 mVy con intervalo de 20-30 s. Las corrientes promediosse obtuvieron con 10-20 barridos individuales. Se hanutilizado las mismas soluciones que en la figura 1. Mo-dificada de Benot AR et al'9.

cindido (en la configuración inside-out) que mos-traba la actividad como máximo de 6 canalessimultáneamente abiertos. En condiciones denormoxia, los canales se abren e inactivan du-rante el pulso con un curso temporal que, comose ilustra en el promedio de la figura, es pareci-do al de la corriente macroscópica de Kf regu-lada por 02. Tras la exposición a hipoxia se pro-duce una disminución marcada de la actividadde los canales y, en consecuencia, una atenua-ción drástica de la corriente promedio. Despuésde la recuperación de la actividad de los cana-les en la solución normóxica, la aplicación deGSH a la cara interna de la membrana (a con-centraciones entre 1 y 5 mM) da lugar a una re-

Interacción entre e! 02 y los caraies de K+

Normoxia Hipoxia

0 Canal y sensor

"-Mediador

Canal Sensor asociado(¿subunidad del canal?)

Fig. 5. Representación esquemática de los diferentesmecanismos propuestos para explicar la modulaciónde los canales de K* por los cambios en la P02. Mo-dificada de López Barneo J2'.

ducción de la probabilidad de apertura sin mo-dificar la conductancia unitaria. Al igual que elGSH, otros agentes reductores como el ditiotrei-tol (DTT) también inhiben la actividad de los ca-nales regulados por oxígeno. Estos datos sugie-ren que el efecto último de la hipoxia podría serla reducción de grupos tiol de la estructura oli-gomérica del canal KO2

19.La regulación de los canales de KT por O2

ocurre en células a las que se aplicó la técnicade patch-clamp, lo que conlleva la diálisis de loscomponentes solubles del citosol, así como enparches de membrana escindidos. Por lo tan-to, es muy probable que la interacción entre ei0 2 y los canales de K+ ocurra a través de unsensor intrínseco de la membrana plasmáticaque, o bien forma parte de la estructura oligo-mérica de los canales, o bien es una moléculaque está estrechamente asociada a estos. Losdiferentes mecanismos propuestos para expli-car cómo la P02 influye en la función de los ca-nales iónicos se resumen en la figura 52021.Desde el punto de vista biofísico, los canales deK' regulados por 02 pertenecen a la familia de

46

CANALES DE POTASIO REGULADOS POR OXÍGENO

canales de rectificación retardada y, por lo tan-to, es posible (panel 5A) que el oxígeno interac-cione con una región especial de las 4 subuni-dades a que forman su estructura básica. ElO2 podría ligarse reversiblemente a complejosde coordinación formados por metales unidosa la proteína como ocurre en otras moléculas22.Esta idea es lógicamente especulativa aunquepodrá verificarse una vez que se conozca la se-cuencia de aminoácidos y otras propiedades delcanal KO2. Una posibilidad alternativa es queel O2 sea detectado por un sensor localizadoen la membrana cerca del canal iónico. Este sen-sor podría ser independiente (fig. 5B) o asocia-do a la molécula del canal (fig. 5C). Este últimocaso, en el que la interacción sensor-canal esdirecta u ocurre en la fase de la membrana, esel más probable porque los posibles mediado-res hidrosolubles (que se lavan en parches demembrana escindidos) o proteínas G parecenno estar implicados en la modulación de los ca-nales de K+ por oxígeno1314. Se ha postuladoque el sensor de O2 podría ser una hemopro-teína ya que se sabe que desde bacterias has-ta células de mamíferos existen muchos ejem-plos de enzimas sensibles al O2 que contienenun grupo prostético hemo23M. Aunque las evi-dencias son fragmentarias, algunos autores hanpropuesto que tanto en el cuerpo carotídeo25

como en los quimioceptores de las víasaéreas26 el sensor de O2 es un citocromo b aso-ciado a la enzima NADPH-oxidasa. Indepen-dientemente de su naturaleza molecular, la ideade un sensor asociado al canal es atractiva por-que permite imaginarse los canales sensibles aO2 como una familia amplia de moléculas ca-paces de coexpresarse con una subunidad sen-sora de O2, de forma similar a como se expre-san Iassubunidadesj3y7con lassubunidadesfundamentales a. de los canales de sodio ycalcio21. Recientemente, se han descrito variassubunidades (5 asociadas a canales de K* que,en algún caso, regulan el curso temporal de lainactivación dependiendo de su estado deoxidación-reducción27. Por lo tanto, el tipo mo-lecular y biofísico de canal de K+ regulado poroxígeno podría variar en células distintas, o enlas mismas células en diferentes etapas deldesarrollo21.

Implicaciones funcionales y distribuciónde ios canales sensibles a oxígeno

En las células glómicas los canales KO2 tie-nen un significado funcional directo ya que con-fieren a estas sus propiedades quimioceptoras.

La inhibición de los canales de K+ en respues-ta a la hipoxia da lugar a un aumento de la ex-citabilidad de las células glómicas con el consi-guiente aumento en la frecuencia de disparo depotenciales de acción. Ya que durante cada po-tencial de acción se produce entrada de Ca2+

a través de canales de calclodependientes depotencial8, el efecto neto de una bajada de laPO2 es el incremento de Ca2+ citosólico, lo quedispara la secreción de los transmisores que ac-tivan a las fibras nerviosas aferentes del cuerpocarotídeo2028. Estos principios generales se ilus-tran en el esquema de la figura 6, donde se re-sumen los procesos celulares básicos involucra-dos en la transducción sensorial en el cuerpocarotídeo. El flujo de información dentro del ór-gano completo en condiciones fisiológicas, aun-que quizá determinado por la secuencia de epi-sodios que se describen en el esquema de lafigura, es casi seguro que sufre ajustes y modi-ficaciones debido a interacciones autocrinas yparacrinas20.

Aunque en los experimentos iniciales sobrela corriente de K+ regulada por oxígeno se de-mostró su especificidad tisular, ya que no se en-contró en otras células estudiadas (neuronas delganglio petroso y de los núcleos del septo, cé-lulas SIF de los ganglios simpáticos y células tipoII del cuerpo carotídeo)10'12, recientes observa-ciones indican que los canales de K+ sensiblesa O2 se expresan en otros tejidos, Al menos2 grupos de investigadores han descrito que lacorriente de K+ macroscópica de miocitos ais-lados de la arteria pulmonar se inhibe en res-puesta a la disminución de la PO2

2930. Esta res-puesta cont r ibuye a la vasoconstr icc iónpulmonar inducida por la hipoxia que, ademásde favorecer un balance adecuado entre la ven-tilación y la perfusión pulmonar, es la mayor cau-sa de hipertensión pulmonar en pacientes confalta de adaptación a grandes alturas («mal agu-do de montaña») o con enfermedades cardía-cas de origen pulmonar. Se ha observado tam-bién una corriente de K+ regulada por O2 encélulas de los cuerpos neuroepitellales del pul-món las cuales son excitables y tienen propie-dades electrofisiologicas muy parecidas a las delas células glómicas26. Los cuerpos neuroepite-liaies (órganos de pequeño tamaño inervadosy distribuidos por toda la mucosa de las víasaéreas) posiblemente complementan los qulmio-ceptores arteriales convencionales, tales comoel cuerpo carotídeo, en la homeostasis de la res-piración durante la transición de la vida fetala la neonatal25. Estos datos indican que la sig-nificación funcional de los canales regulados

47

FARMACOLOGÍA DE LOS CANALES tiNICCS

Vasosanguíneo

1. Detección de cambiosen la tensión de 02

2. Potenciales de acción de Na+

y Ca2* (entrada de calcio)

3. Aumento de [Ca2+] citosólico

4. Liberación de transmisor

5. Aumento del dispare de lasfibras nerviosas aferentes

aISNC

Fig. 6. Etapas funda-mentales en el procesode transducción de ¡oscambios de tensión de02 en el cuerpo carotí-deo. Modificada deLópez Barneo J et aP°.

por O¿ es más amplia que la supuesta inicial-mente.

Conclusiones

Al igual que en otras modalidades sensoria-les, los canales iónicos también participan enla transducción de los cambios de O?_. Los ca-nales de K+ sensibles a O2 se expresan en di-ferentes tejidos donde la detección de las mo-dificaciones en la tensión de 0 2 tiene unarelevancia funcional directa. Dado que los dife-rentes tipos de canales iónicos son ubicuos yla obvia ventaja biológica que supone mantenerlos valores de O2 bajo un control estricto, es deesperar que en un futuro cercano se demues-tre que los canales regulados por 02 están am-pliamente distribuidos en órganos y tejidos y queparticipan en numerosas funciones celulares de-pendientes de O2, en condiciones normales yen circunstancias patológicas.

Agradecimiento

Este trabajo se ha llevado a cabo en colabo-ración con varios colegas a los que deseo ex-presar mi gratitud por su continuo estímulo yapoyo. Los experimentos se realizaron con finan-ciación de la Dirección General de InvestigaciónCientífica y Técnica. Junta de Andalucía y Co-munidad Europea.

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DISCUSIÓN

J. GARCÍA-SANCHO: ¿Podría especular sobre laestructura del sensor de oxígeno?, ¿cuáles sonlos efectos del cianuro, del monóxido de car-bono?, ¿puede el óxido nítrico interactuar conel canal?

J. LÓPEZ BARNEO: El efecto del cianuro sobre elcanal directamente en parche escindido biencaracterizado y bien aislado no se ha estudia-do. En cuanto al efecto del monóxido de car-bono, los Dres. C. González y J.R. López-López llevaron a cabo un experimento hacepoco tiempo en el que muestran que es muysimilar al oxígeno. El efecto del óxido nítricoha sido estudiado también por otros grupos

y los datos preliminares sugieren que el efec-to es parecido al del oxígeno. Esto me llevaa especular que este canal podría expresarseen el cerebro y actuar como receptor de COy de NO. Estos iones parece que actúan comotransmisores en el sistema nervioso central.

F. SALA: Me gustaría que comentara de una for-ma más detallada el esquema de estados ci-néticos que ha presentado, y que indicaradónde interviene ahí el oxígeno, si modificasensibilidad de voltaje, o qué es lo que real-mente hace.

J. LÓPEZ BARNEO: El canal regulado por oxígenono es un canal ligandodependiente, sino que

49

rARMACOLOGÍA DE LOS CANALES IÓNICOS

es un canal voltajedependiente clásico y típi-co. Para comprender cómo el oxígeno interac-ciona con el canal hicimos bastantes experi-mentos, enormemente costosos en tiempo,intentando determinar si haciendo un mode-lo simple de canal voltajedependiente el cam-bio de la P02 produce una variación inespe-cífica, altera todas las constantes cinéticas, osu efecto podría explicarse por modificacionesde constantes cinéticas específicas; esto es im-portante a la hora oe comprender, no sólo anivel biofísico, sino también a nivel fisiológicocómo funciona el canal. Hemos visto que lafalta de oxígeno hace mucho más rápidala inactivación, y aumenta la primera latenciade la apertura del canal, pero el estado abiertoy todas las transiciones cercanas al estadoabierto no se ven afectadas por la hipoxia, ylo mismo hace el glutatión. El glutatión redu-cido produce dos alteraciones fundamentales,hace que el canal se abra más lentamente (losque se abren) y que se ¡nactiven más rápida-mente aquellos que se abren. Y, por último,una tercera alteración importantísima es queel número de canales que se abren disminu-ye, porque pasan directamente de un estadocerrado a uno ¡nactivado sin pasar por el abier-to. Son las tres alteraciones fundamentales.

W. BUÑO: En cuanto a la cinética, parece serque pasa de cuatro compuertas a tres com-puertas, ¿sería eso la modificación de la ci-nética?

J. LÓPEZ BARNEO: Puede haber otra, pero nues-tro modelo cinético asume que ei canal estáen un estado cerrado, lejano del abierto. Almenos hay tres estados cerrados antes delabierto, y que lo que hace el oxígeno es lle-varlo a otro estado que llamamos todavía máscerrado, más lejano del abierto. Pero esa úl-tima transición no es voltajedependlente, sinoque depende exclusivamente del oxígeno.

W. BUÑO: Mi otra pregunta se refiere a que elglutatión actúa dentro y no fuera, así que esome hace pensar que el sensor está mirandohacia dentro en la membrana.

J. LÓPEZ BARNEO: En efecto, el glutatión hacemuchas cosas en esta célula, y además so-bre todos los canales, pero sobre los canalesde potasio regulados por oxígeno se pareceal efecto de la hipoxia solamente si se aplicapor dentro.

M. CRIADO: El efecto de glutatión es reversible,y me pregunto si han realizado experimentoscon un agente alquilante que irreversiblemen-te modifique estos sitios que quizá son cis-teínas.

J. LOPEZ BARNEO: NO hemos probado con agen-tes que son irreversibles, fundamentalmentepor nuestro prurito de que ya que la regula-ción de PO2 es muy reversible y regula muyfinamente este canal, hiciésemos lo mismocon agentes reductores. Hemos utilizado ade-más del glutatión, el ditiotreitol (DTT) con elmismo efecto. Uno de los experimentos queestamos haciendo es tratar la cara interna dela membrana con tripsina para destruir el su-puesto sensor si lo hay asociado a una sub-unidad beta o la supuesta cisteína que podríaformar parte de los dominios carboxilo o ami-no de! canal, y observar si se modifican suscaracterísticas cinéticas y si sigue regulado ono por oxígeno.

F. BARROS: Partiendo de la base de que ustedpostula la posibilidad de que una subunidadregule, podría tratarse de una subunidad deltipo beta que regulara otros canales de pota-sio y esto ser importante para el mantenimien-to del potencial basal y la tasa de espigueo.

J, LÓPEZ BARNEO: Hemos buscado en las célu-las tipo 1 del conejo adulto la posibilidad deque otros canales sean regulados por potasio,y no lo hemos visto. Eso no descarta que nohaya canales de tipo de rectificación como elque usted estudia, que regulen el potencial demembrana, y que también sean regulados porlos cambios de la P02. No hemos hecho unabúsqueda exhaustiva de canales que no seanvoltajedependientes pero en la que hemos he-cho no hemos visto ninguna regulación por loscambios de PO2, lo cual no quiere decir queno la haya, Por esa razón, creemos que la re-gulación de este canal por el oxígeno puedeexplicar la función quimiotraductora de estascélulas si imaginamos estas células en un con-texto fisiológico en donde con un potencial cer-cano a los 40-50 mV, que parece ser que tie-nen, están disparando de forma repetitiva yson osciladores intrínsecos. En esas circuns-tancias la sensibilidad de un canal voltajede-pendiente al oxígeno toma todo su valor, pues-to que va a regular finalmente la frecuenciade disparo. Eso es muy difícil demostrarlo por-que en células en cultivo no todas ellas sonosciladores intrínsecos. Al parecer algunas es-tán demasiado polarizadas y no disparan, locual hace que no sean sensibles a la hipoxiaen cultivo.

C. GONZÁLEZ: Mi pregunta era exactamenteesta; siempre que presentamos los resultadosde nuestro grupo la pregunta de los expertosen cuerpos carotídeos es cómo un canal conun umbral de activación macroscópico de

50

CANALES DE POTASIO REGULADOS POR OXIGENO

-40 mV es el triggerde la despolarización delas células.

J. LÓPEZ BARNEO: En mi opinión esta preguntaparte de un postulado que no se ha demos-trado. Parto de otra premisa, y es que aquíno hay potencial receptor, sino que lo que hayson células que por las características de suconductancia iónica a un potencial de 50 a40 mV van a ser osciladores intrínsecos y esoespero que algún día podamos demostrarlo,al menos en el conejo. MI argumentacióncuando se me formula esta pregunta es¿quién ha mostrado en el cuerpo carotídeo decualquier especie un canal que no sea volta-jedependiente y que sea regulado por oxíge-no de forma inequívoca? Que yo sepa, nadie.

C. GONZÁLEZ: En cualquier caso, este es untema que sigue siendo controvertido.

M. VALDEOLMILLOS: Un comentario farmacológi-co sobre el efecto del cianuro en esta pre-

paración. Creo que como fruto de un prejui-cio de cuál podría ser el efecto de una bajapresión de oxígeno sobre el acoplamiento es-tímulo-secreción en esta célula se pensó alprincipio que la baja presión de oxígeno po-dría tener un efecto sobre la mitocondria y,por lo tanto, el cianuro sería un buen modelopara estudiar el efecto de la hipoxia. Nosotroshicimos experimentos con cinauro y vimos queéste aumentaba la concentración intracelularde calcio como consecuencia de la liberacióndesde algún reservorio intracelular y por ex-tensión pensamos que este sería el mecanis-mo de acción de la hipoxia. Creo que ahorase demuestra claramente que este no es elmecanismo fisiológico, sino que el calcio en-tra desde el espacio extracelular, y su entra-da es consecuencia de la activación del sen-sor, que es el canal de potasio.

51

Canales de sodio sensibles a voltaje:implicaciones farmacoterapéuticas

J. TamargoInstituto de Farmacología y Toxlcología, Consejo Superior de Investigaciones Científicas.

Universidad Complutense. Madrid.

Introducción

En los músculos auricular y ventricular y enel sistema His-Purkinje, la rápida velocidad dedespolarización, responsable de la excitabilidady velocidad de conducción, es debida a la acti-vación de una corriente de entrada de Na a tra-vés de canales voltajedependientes (lNa)'. Porotro lado, el hallazgo de que la tetrodotoxina(TTX) acorta la duración del potencial de accióncardíaco (DPA), a concentraciones a las que nomodifica la velocidad máxima de despolariza-ción, sugiere que la lNa también es responsablede la fase 2 del potencial de acción cardíaco2.

Los fármacos antiarrítmicos previenen o su-primen las arritmias a concentraciones a las queno producen efectos adversos sobre el latido si-nusal normalmente propagado. Los canales ióni-cos que participan en la regulación del poten-cial de acción cardíaco constituyen la diana deestos fármacos, de tal forma que, según la cla-sificación de Vaughan Williams3, e! grupo I,bloqueadores de los canales de Na, está cons-tituido por fármacos muy heterogéneos que pre-sentan en común su capacidad para bloquearla lNa (tabla I).

Estructura de la subunidad a del canalde Na cardiaco

El ADNc de la subunidad a de los canales vol-tajedependientes de Na cardíacos humanos esuna proteína de 2.016 aminoácidos que mues-tra una identidad superior al 90% con el canalcardíaco de rata10. El canal contiene 4 domi-nios internos homólogos (I-IV), cada uno de loscuales exhibe 6 segmentos hidrofóbicos queatraviesan la membrana (S1-S6) y una región S5-S6 o H5 que controla la selectividad iónica8-'1.Experimentos de mutagénesis dirigida han de-mostrado que la región H5 es el poro del canal,mientras que la región S4, que contiene residuoscargados positivamente (X-X-[Arg o Lys])n encada tercera posición, actuaría como sensor devoltaje7'8. En e! miocardio existen diversas ¡so-formas de este canal, algunas con una cinéticamás lenta que aquellas responsables de larápida despolar ización del potencial deacción21213; estas isoformas son responsablesde la lNa que contribuye a mantener la fase2 del potencial de acción cardíaco2. En el co-razón de rata casi un 20% de los canales de Naexhiben una alta afinidad por la saxitoxina, lo

Canales de Na cardíacos

Los canales de Na cardíacos y neuronales pre-sentan muchas propiedades comunes45, perotambién importantes diferencias cinéticas yfarmacológicas46. Los canales de Na cardíacosson resistentes a la TTX (TTX-R. KA aproxima-damente 1 iM, mientras que en células nervio-sas es de 0,05-10 nM), saxltoxina (STX) yju-conotoxina, pero son 50-1.000 veces más sen-sibles a los anestésicos locales (FA del grupo I)79.En las células cardíacas, además, el bloqueo pro-ducido por la TTX se potencia al despolarizar lamembrana y tras estimulación repetitiva y mues-tran una mayor sensibilidad al bloqueo por ca-tiones divalentes del grupo II (Cd, Zn).

TABLACLASIFICACIÓN DE LOS FÁRMACOS

ANTIARRÍTMICOS QUE BLOQUEAN LOSCANALES DE Na CARDÍACOS (GRUPO II

Grupo IA

QuinidinaProcainamidaDisopiramidaAjmalinaCibenzolinaImipramina

Grupo IB

LicíocaínaMexiletinaAprindinaTocainidaPirmenolFenitoínaMorizicina

Grupo IC

PropafenonaFlecainidaLorcainidaEncainidaIndecainidaRecainam

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Fig. 1. Representación esquemática del potencial deacción cardiaco en ritmo sinusal y en presencia deuna taquiarritmia. Durante el potencial de acción elcanal de sodio adopta tres estados conformaciona-les: reposo-R, activo-A e inactivo-l. Durante la diásto-le los canales se encuentran en estado R, se activanbrevemente durante la despolarización y a continua-ción pasan al estado I, en el que permanecen hastaque la célula se repolariza. En ritmo sinusal el inter-valo diastólico es suficientemente largo para que loscanales en estado I se recuperen y pasen al estadoR antes de que llegue el siguiente potencial de ac-ción sinusal. Durante la taquicardia aumenta el tiem-po que el canal pasa en los estados Aelyel interva-lo diastólico se acorta, lo que disminuye el tiempo queel canal tiene para reactivarse.

que confirma la importancia de otras isoformasdistintas de la TTX-R predominante10.

Muy recientemente, ha sido clonado un ca-nal de Na cardíaco humano (nNav2.1 o hHl)14.La secuencia de 7,2 Kb es la primera de unanueva subfamilia de canales. El hHl codificauna proteína de 1.682 aminoácidos, que mues-tra una homología del 46% con los canales demiocardio de rata. El tamaño de esta moléculaes inferior al de otros canales de Na previamentedescritos (1.819-2.018 residuos, 8,5-9,0 kb), loque parece deberse a que la porción C-terminal

es más corta en el hHl. Otra importante dife-rencia es que en el hHl el número de residuoscon carga positiva en los segmentos S4 de losdominios I, III y IV es inferior y en el IVS4 dosHis han sido reemplazados por 2 Arg (residuos1.355 y 1.367).

Características del bloqueode los canales de Na

El bloqueo farmacológico de los canales deNa cardíacos es el mecanismo por el que losFA del grupo I suprimen las arritmias cardíacas.El bloqueo es un proceso voltaje y tiempode-pendiente y viene a su vez determinado por lascaracterísticas fisicoquímicas del FA, existiendoimportantes diferencias según el fármaco ana-lizado.

Durante el potencial de acción cardíaco el ca-nal de Na adopta tres estados conformaciona-les1516: uno conductor (abierto-O) y dos no con-ductores (cerrado-C, ¡nactivo-l) (fig. 1). En ladiástole, los canales se encuentran en reposoy predomina el estado C. Tras la aplicación deun pulso despolarizante o durante la fase 0 delpotencial de acción cardíaco los canales se ac-tivan (R->0), permitiendo durante 1-2 ms la en-trada de iones Na. La activación de los canalessigue un curso temporal sigmoidal, lo que indi-ca que se mueven a través de varios (4-6) esta-dos cerrados, no conductores, antes de que elcanal se abra (Cl ... Cn->0) y uno o dos esta-dos O. A continuación los canales se inactivan(O—>l) o se cierran (O-»C), impidiendo la en-trada de Na a su través, aun cuando la despo-larización se mantenga. Si el canal pasa al es-tado C es posible su reapertura. El estado Ipredomina (0->l, R-»l) a niveles despolarizadosde potencial de membrana (durante las fases2 y 3 del potencial de acción, tejidos isquémi-cos, hiperpotasemia)1518. Cuando se analiza lacorriente microscópica se puede observar quelos canales de Na se abren brevemente(<1 ms), mientras que en la corriente macros-cópica esta apertura dura varios ms. Ello impli-ca que durante el pulso despolarizante algunoscanales se abren-cierran antes y otros despuésdel pico de la lNa (C-»O); además, otros pasandirectamente al estado I (Cn->l) sin activarse.Estudios de canal único han demostrado queel proceso de inactivación presenta dos cons-tantes de tiempo19. La fase rápida permiteaperturas breves del canal (1-2 ms), pero no sureapertura; mientras que la fase lenta implicala reapertura prolongada del canal en forma desalvas4. Los canales que se encuentran en es-

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CAKALES DE SODIO SENSIBLE: A VOLTAJE: M=LCACIOI\ES FARMACOTERA-ÉUTKAS

TABLA IIAFINIDAD DE LOS FA DEL GRUPO I POR LOS ESTADOS ACTIVO E INACTIVO DEL CANAL

DE Na Y SOBRE LA CONSTANTE DE TIEMPO DE REACTIVACIÓN (T,J DEL MISMO

Fármaco Activo(¡iM)

InactivofpM)

QuinidinaProcainamidaDisopiramidaLidocaínaMexlletínaAmiodaronaPropaienoraFlecar daEncainida

10028

30050

200.000

11510

> 100.0001,0

> 100.0001,20,70,20,5

> 100.003> 100.000

4,72,32,22304701,48,515,520,3

sssmsmsss3

S

tado I, para volver a activarse, deben volver pre-viamente al estado R. Este paso (I->R), deno-minado recuperación de la inactivación o reac-tivación del canal de Na, es un proceso rápido(constante de tiempo o rre<30ms), por lo quecuando llega el siguiente latido sinusal y dadoque el intervalo diastóüco es superior a 600 ms,la mayoría de los canales de Na están en esta-do R y disponibles para reactivarse.

El bloqueo voltaje y tiempodepenciente dela lNa procucdo por los FA puede expicarseen base a la hipótesis del receptor modula-do15162025, que propone que los FA del grupo Ise unen a un receptor localizado en el canalde Na, estando moduladas su afinidad poreste receptor y la cinética de asociación-disociación por el estado (O, I, R) en que elcanal se encuentra. A concentraciones terapéu-ticas (rango ¡iM) los FA presentan mayor afini-dad por los estados 0 e I que por el estado Rdel canal y prolongan de forma característica laT.S (tabla II)1625. Los canales a los que se aso-cia el FA no permiten el paso de Na a su travésy su dependencia de voltaje es desplazada a va-leres más negativos de potencial de membra-na, lo que indica una mayor inhibición de la lNaa niveles despolarizados de potencial de mem-brana.

Bloqueo tónico y frecuenciadependientede la L

En presencia de FA podemos observar dos ti-pos de bloqueo de la lNa

16"25: D un bloqueo tó-nico, que representa el bloqueo que aparece du-rante la primera despolarización tras un largoperíodo de reposo a potenciales de membrananegativos. A concentraciones terapéuticas, losFA apenas si producen bloqueo tónico

(KRD -mM), lo que sugiere que a niveles ne-gativos de potencial de membrana se disociandel canal, y 2) si estimulamos de forma repeti-tiva la célula cardíaca la lNa disminuye de for-ma progresiva hasta que esta alcanza un valorestable. Este bloqueo frecuencia (uso)depen-diente de la ¡Na (BFD) se debe a que durantela taquicardia los canales persisten más tiem-po en los estados por los que los FA presentanafinidad (O e \) y a que los FA orolcngan la rre.Puesto que la taquicardia acorta el intervalodiastóüco, cuando llega el siguiente potencial deacción parte de los canales aún no se han reac-tivado (se encuentran como ID) y no permitenel paso de Na a su través; esta es la base dela búsqueda de FA selectivos, que inhiban lalNa durante la taquicardia, pero que apenasla modifiquen en ritmo sinusal.

Los FA son básicos (pKa = 8-9,5), por lo quea pH fisiológico (7,4) existen en dos formas:cargada-hidrofílica y no cargada-lipofílica. La for-ma cargada no bloquea cuando se administraa la superficie externa del canal, accediendo aeste a través de una vía liidrofílica desde la su-perficie interna del poso sólo cuando el canalse activa, por IO que presentan un marcadoBFD7. La forma lipofílica accede a su receptorpor una vía hidrofóbica e interactúa con el ca-nal independientemente del estado en que estese encuentre. La despolarización de la membra-na, la acidosis y la hiperpotasemia favorecen lainteracción de la forma cargada con su recep-tor y prolongan la Tre

161B, lo que explica por quélos FA que bloquean los canales de Na puedeninhibir más ía lNa en el miocardio isquémicoque en el miocardio sano. La alcalosis, por elcontrario, aumenta la forma no cargada y ace-lera la T,e: de hecho, la alcalinízación del mediointerno se ha utilizado para tratar los efectos car-

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- 4 0 mV- 1 6 0 mV

ControlJ

Lidocaína (20 |iM)

f.5 ms

4 Q w Control Quinidina (50 nM)

-160 mV-̂ * - J L_

di

+1 A4A**WMV^MWV-lvbMif<îAv

o" 5 ms

ñg. 2. Registros obtenidos en miocítos ventricularesde cobaya utilizando la configuración ¡nside-out de /atécnica del parche de membrana. El potencia! demembrana se fijó a -160 mV y se aplicó un pulsodespolarizante hasta -40 mV durante 50 ms. Los pa-neles de la izquierda representan la situación control,mientras que tos de la derecha muestran tos efectosde quinidina (50 //M, panel superior) y de la lidocaf-na(20flM).

díodepresores de los bloqueadores de la

En presencia de FA (lidocaína2627, quinidi-na23, mexiletina, tocainida22 y procainamida29,la reactivación del canal de Na representa la di-sociación del fármaco desde RD->R e ID->I-»R,acelerándose este proceso al hiperpolarizarla membrana. Despolarizaciones o repolariza-ciones repetitivas también pueden acelerar lareactivación. Este proceso, denominado desblo-queo por activación, impl ica los pasosID->RD->OD-Ô30 y puede ser un importantemecanismo de disociación de los FA que pre-sentan muy pobre desbloqueo en reposo. Du-rante la hiperpolarización los canales se despla-zan de ID a RD y la posterior despolarizaciónproduce la transición de estado 0D->0 si la(0D)> >(0). Estas características explican porqué los FA producen mayor inhibición de la lNa

a frecuencias rápidas y en tejidos despolari-zados.

Bloqueadores del estado activofrente a bloqueadores del estado inactivodel canal de Na

Existen importantes implicaciones clínicas de-pendiendo del estado del canal por el que losFA presentan mayor afinidad. En general, la ta-bla II muestra que los FA de los grupos IA e ICpresentan mayor afinidad por el estado A y losdel grupo IB la presentan por el estado I del ca-nal de Na16'21'2330, si bien algunos (propafeno-na, procainamida) presentan afinidad por am-bos estados.

FA que presentan una alta afinidadpor el estado activo

Son fármacos como propafenona, diprafeno-na, prajmalina, quinidina, disopiramida o pen-ticainida. En preparaciones multicelulares, es-tos FA bloquean la lNa durante la fase 0 delpotencial de acción cardíaco y no desplazan lacurva de inactivación de la corriente. Con algu-nos bloqueadores del estado O (disopiramida,penticainida) o reactivación del BFD puede re-trasarse al hiperpolarizar la membrana, lo quesugiere que el FA quedaría atrapado en elcanal tras el cierre de las compuertas deactivación31. Si la disociación del FA requiere laapertura del canal, la hiperpolarización dismi-nuirá la probabilidad de apertura retrasando ladisociación del FA del canal de Na. En miocitoscardíacos aislados el bloqueo es evidente trasaplicar pulsos despolarizantes de corta duración(1-2 ms), durante la apertura del canal, peroaumenta poco tras su cierre o al prolongar la du-ración del pulso, cuando aumenta el tiempo queel canal persiste en estado3233, En registros decanal único se denomina bloqueo del estado 0al que aparece al comienzo del pulso despola-rizante, si bien este incluye tanto el bloqueo delestado O como el de los que preceden a la aper-tura del canal. Sí el bloqueo aparece en una es-cala de tiempo similar a la de apertura del ca-nal podemos ver (panel superior en la fig. 2) queestos fármacos acortan el tiempo medio deapertura, prolongan el tiempo hasta la primeraapertura del canal y que el bloqueo se revierteai aumentar la [Na].34. Si la cinética del blo-queo es más rápida que el tiempo de aperturadel canal podemos observar una reducción dela amplitud de la corriente atribuible a la difi-cultad para separar el artefacto capacitativo de

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CANALES DE SODIO SENSIBLES A VOJAJE: IMPLICACIONES FARMACOTERAPÉUTICAS

la corriente iónica. Esta dificultad, unida al cor-to tiempo de apertura del canal (< 1 ms) ha li-mitado el análisis de los FA que se unen al es-tado O del canal, incluso tras reducir latemperatura (15-17 °C) y la [Na]0

32. Otra alter-nativa ha sido aislar la transición C-+O tras eli-minar (a-quimiotr¡psina, pronasa, DPI2O1-10635'36) o retrasar la inactivación de la lNa(batracotox¡n-BTX37). En estas condiciones elcanal presenta aperturas repetitivas, de larga du-ración, que son inhibidas por los bloqueadoresdel estado O de forma dosis y voltajedepen-diente.

Estos FA son más efectivos a frecuencias rá-pidas (taquicardias) y en tejidos hiperpolariza-dos, pero su efectividad disminuye en tejidosdespolarlzados-isquémicos en los que predomi-na el estado I. Dado que el tiempo que el ca-nal permanece abierto es similar en todos lostejidos cardíacos y que su acción es indepen-diente de la DPA, estos FA van a ser efectivostanto en arritmias supraventriculares comoventriculares16-24. Algunos FA (quinidina, diso-piramida, procainamida, imipramina, flecaini-da, encainida, propafenona) se unen muy len-tamente al estado O del canal, precisando másde 10 latidos para que el BFD de la lNa alcan-ce valores estables16182022. También se diso-cian del canal lentamente, aumentando la TWdesde 2-6s (quinidina, disopiramida, procai-namida, imipramina) hasta más de 8s (flecai-nida, encainida, propafenona)1622'3S41. La pro-longación de la r,e explica: a) su efectividadpara suprimir las extrasístoles tempranas y tar-días y las taquiarritmias lentas, y b) su inca-pacidad para discriminar entre ritmo sinusal(longitud del ciclo cardíaco <1 s) y taquicar-dia. En presencia de FA que prolongan de for-ma marcada la rre el siguiente potencial de ac-ción excitará la célula cuando un númeroimportante de canales se encuentre en estadoID no conductor, deprimiendo la velocidad deconducción intracardfaca y facilitando la apari-ción de arritmias por reentrada, incluso en pa-cientes en ritmo sinusal. Podemos, pues, con-cluir que el riesgo de producir efectosproarritmogénicos aumenta a medida que lohace la rre

ia2a23.

¿05 FA con mayor afinidad por el estadoinactivo

Son fármacos como lidocaína, mexiletina, to-cainida o aprindlna. En preparaciones multice-lulares y en células aisladas, utilizando la confi-guración de célula entera, producen un bloqueo

de la lNa que aumenta progresivamente duran-te la fase 2 del potencial de acción cardíaco ocon la duración del pulso despolarizante y des-plazan la curva de inactivación de la lNa en es-tado estable hacia valores más negativos, lo queindica que producen un mayor bloqueo a nive-les despolarizados del potencial de membrana,cuando predomina el estado1622. En estudiosde canal único puede verse (panel inferior enla fig. 2) que no modifican la latencia hasta laprimera apertura de los canales, ni el tiempo deapertura de los mismos y que el bloqueo no serevierte al aumentar la [Na]0. La inactivacióndel canal de Na cardíaco está controlada a ni-vel de la unión citoplasmática entre los domi-nios homólogos III y IV Hm^42, ya que la apli-cación de anticuerpos policionales contra estaregión'3 y la supresión o la inserción de diver-sos aminoácidos a este nivel4244 alteran la inac-tivación del canal. Tras suprimir la inactivaciónrápida con a-quimiotripsina o toxinas, o tras lamutación de 3 aminoácidos localizados en LNMV(IFM por QQQ), el bloqueo de la lNa producidopor la lidocaína desaparece.

El bloqueo de la lNa producida por estos FAaumenta1625: a) en tejidos despolarizados (is-quémicos, hiperpotasemia), ya que en estascondiciones al final de la diástole un porcenta-je de canales persisten en estado I. En fibras dePurkinje la concentración de lidocaína necesa-ria para inhibir la lNa en un 50% varía entre10 ¿¿(vi cuando el potencial de membrana es de-50 mV (inactivación completa de la corriente)y más de 0,3 mM cuando el potencial se fija a-120 mV27. En el miocardio isquémico aumen-ta la [K]o, disminuye el pH celular (acidosis) yel potencial de membrana se despolariza, porlo que un importante número de canales se des-plaza al estado M5. Sería, pues, de esperar, quelos fármacos con gran afinidad por el estado Ideprimieran más la lNa en el miocardio isqué-mico que en el sano, normalmente polarizado;sin embargo, esta posibilidad se ve contrarres-tada porque despolarización e isquemia prolon-gan la rre

17; b) a frecuencias rápidas (taquicar-dia), ya que entonces aumenta el tiempo queel canal permanece en estado inactivo, y c) entejidos que presentan una DPA más prolonga-da. El músculo ventricular y el sistema His-Purkinje presentan una DPA más prolongadaque el músculo auricular, por lo que estos FAson más efectivos para suprimir taquiarritmiasventriculares que taquicardias supraventricula-res; además, el bloqueo de la lNa se potencia sise asocian a FA que prolongan la DPA (p. ej.,amiodarona).

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TABLA IIIMETABOUTOS DE LOS FA DEL GRUPO I

Fármaco Metabolito PotenciaQuinidinaProcamamldaDisopiramidaLldocaínaAmiodaronaAprind'.naPropafenonaEncainida

3-hidroxiquinidinaN-acetilprocainamidaN-desisopropildlsopramidaGlicinaxilididaIV-desetilamíodaronaN-desetilaprincina5-hidrox propafenonaO-demitilencainida3-metoxi-O-demetilencahida

1> 10,50,1

í1

1,5> 1> 1

Potencia: se considera que el oloqueo producido por el fármaco origen es 1.

Estos FA se asocian-disocian muy rápido delcanal de Na (rre<0,5s; tabla II), por lo que elritmo sinusa! cuando llega el sigílente potenealde acción la mayoría de los canales están en es-tado R y disponibles para ser activados16*. Porello, en ritmo sinusal no alteran la velocidad deconducción .ntraca'c'iáca sí (a deprimen en pre-sencia cefrecuenc as cardíacas rápidas (taqui-a'ritmiasi o cuando la velocidad de conducciónse encuentra ya deprimica (squemia, hiperpo-tasemia). Debido a la rápida aparición del blo-queo este alcanza valores estables en menos de5 latidos, por lo que son muy efectivos para su-primir un aumento súbito de ía frecuencia car-díaca (extrasístoles tempranas, aparición de ta-quiarritmias), pero poco efectivos frente ataquiarritmias lentas o extrasístoles tardíos1625.

Combinaciones de FA

El control de las arritmias cardíacas refracta-rlas exige la combinación de 2 FA, que al unir-se al mismo receptor podrían competir entre símodificando su eficacia. La combinación de FAde cinética rápida (mexiletina, lidocaína, tocai-nida) con otros de cinética intermedia (qulnidi-na, disopiramida) o lenta {propafenona, flecai-nida) podría producir un mayor bloqueo de JalNa (sinergismo) y reducir la incidencia de reac-ciones adversas13'23^649. Por el contrario, lacombinación de FA de cinética lenta e interme-dia producirá una mayor depresión de la IN3 yde la velocidad de conducción aumentando elriesgo de efectos cardiodepresores y antiarrít-micos •8.2o.2i,23.3oi Cuando un FA de cinética len-ta o ntermed'a produce jn alte grade de blo-quee, la administración ce un FA de cinéticarápica podría ocuoa' el canal durante ,a des-polarización reduciendo, al menos a ciertas fre-cuencias de estimulación, la cantidad de ca-

nales ocupados por el FA de cinética lenta (com-binación antagonista). Ello ha sido utilizado pararevertir la cardiotoxicidad de los FA con una rremuy prolongada.

La mayoría de los bloqueadores de los cana-les de Na se biotransforman en metabolitos ac-tivos que presertar. una estructura química muysimilar a la del fármaco origen, per lo que am-bos pueden competir oor el mismo receptarenel canal de Na. A veces los rretabolitos puedenproducir un bloqueo óe la lNa similar o más po-tente que el producido por el FA origen (tablaIII). Si el bloqueo es más potente (p. ej., desi-pramina y 5-riidroxipropafenona), tos metaboli-tos son responsables tanto de la acción anti-arrítmica como de la depresión de la excitabili-dad y velocidad de conducción previa mente atri-buidas al fármaco origen50'51. En general, losmetabolitos con rre prolongada pueden ejercerinteracciones sinergistas, mientras que los quepresentan una rre corta pueden ejercer efectosantagonistas. A veces, el metabolito exhibe pro-piedades que no presenta en FA origen; laN-acetilprocainamida (NAPA), metabolito de laprocaínamída, no bloquea la íNa, pero prolongala DPA52-53, por lo que potenciaría las accionesde la procainamida, que presenta afinidad porel estado I.

Puesto que la activación precede la inactiva-ción del canal, sería de esperar que entre FAcon efec:o similar sobre la rrs los bloqueadoresdel estado 0 puedan prevenir la asociación deaquellos que presentan una alta afinidad por elestado20-'1'23-0. Esta asociación tiene lugar en-tre la lidocaína y su principal metabolito, la gli-cilxilid da, que presenta una alta afinidad por elestado Aycuanco se acumula en tratamientoscrónicos puede redjcir la efectivded clínica de,a lidocaína54. Esta es una posible estrategiapara revertir la excesiva cardiodepresión produ-

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CANALES DE SODIO SENSIBLES A VOLTAJE: IMPLICACIONES ÂRMACOTERAPÉUTICAS

cida por los FAcon alta afinidad por el estado I.Muchos bloqueadores de la lNa presentan un

punto de asimetría en su molécula y se comer-cializan como racematos, que contienen al me-nos dos enantiómeros, cuyas propiedades elec-trofisiológicas pueden ser similares o no a lasdel racemato, Aun cuando ambos enantióme-ros bloqueen la lNa, pueden presentar diferen-cias en la potencia y cinética con respecto al ra-cemato. (R)-tocainida y (R)-mexiletina son máspotentes que el enantiómero (S), siendo los res-ponsables del bloqueo de la l^18 '46 '47*56; por elcontrario, no parecen existir diferencias en el gra-do de bloque de la lNa observado con FA de ci-nética lenta. Otras veces un enantiómero pre-senta propiedades no relacionadas con elbloqueo de la lNa; así la (S)(+)-disopiramida in-hibe la corriente de salida de K rectificadora tar-día y prolonga la DPA57.

De todo lo anterior se deduce que el estudiode un bloqueador de la lNa debe incluir tam-bién la evaluación de sus metabolitos y racema-tos y las posibles interacciones entre los meta-bolitos y el FA del que proceden.

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DISCUSIÓN

M. HURLÉ: Tras su exposición, me parece quela clasificación de los antiarrítmicos del gru-po 1 según su cinética o su afinidad por losdistintos estados del canal pierde todo el sen-tido.

J. TAMARGO: Absolutamente, lo que sucede esque la comisión que se ha reunido para ha-cer la nueva clasificación ha realizado unmapa extraordinariamente complejo, porquelo que hemos intentado es tener en cuenta to-dos los los canales y son 11 de potasio, tresde calcio y uno de sodio, más las bombas, ylos receptores. La clasificación de VaughanWilliams era una clasificación de acciones. Eneste momento no puede ser aceptada, es muysimple, muy didáctica, muy fácil de recordar,pero absolutamente falsa.

J. MARSAL: ¿Podría extenderse un poco más enlo que ha dicho sobre la no utilidad de los ooci-tos para el estudio de la expresión de estoscanales?

J. TAMARGO: A lo que me refiero es que con losoocitos aparecen diversos problemas. Prefie-ro, si lo que se pretende es extrapolar al hom-bre una célula de mamífero, trabajar con cé-lulas cardíacas humanas, pero es obvio queesto presenta problemas éticos muy importan-tes. La alternativa sería obtener una línea celu-lar de mamíferos estable ya que el oocito tieneuna gran hidrofobicidad, y eso en compues-tos con un gran número de enlaces hidrofó-bicos puede hacer que no haya una fijacióny distribución del fármaco similar a la que ca-bría esperar en una célula cardíaca. Ya se haconseguido secuenciar e insertar en una cé-lula de mamífero un canal de potasio, pero noun canal de sodio ya que desgraciadamenteno se consigue mantener la línea estable. Esdecir, que en estos momentos el canal de so-dio está clonado, está secuenciado, se ha in-sertado, pero no se ha conseguido expresarde forma estable en una célula de mamífero.

A.G. GARCÍA: He observado que no incluye la di-fenilhidantoína en el perfil que ha presenta-do. ¿Podría comentar el motivo?

J. TAMARGO: En el caso de la difenilhidantoínano la he incluido por dos motivos; en primerlugar, porque los americanos por más que nosla vendieron al comienzo de los setenta handejado de utilizarla hace muchos años; la úni-ca indicación en la que la utilizaban era el tra-tamiento de las arritmias digitálicas, pero losresultados nunca fueron buenos, sino másbien regulares. La cinética de la difenilhidan-toína sería entre rápida e intermedia; es de-cir, estaría entre mexiletina y quinidina.

J. LERMA: Usted ha mostrado que cuando su-prime la inactivación del canal de sodio, la li-docaína deja de tener efecto, mi pregunta es¿la lídocaína se une entonces al péptido deinactivación?

J. TAMARGO: El mecanismo de acción de lidocaí-na varía en función de la dosis. A concentra-ciones que son dos o tres veces superiores alas terapéuticas ocurre lo que le he presenta-do, mientras que a dosis más altas se uniríaa un estado que sería el más cercano a laapertura-apertura. En otro trabajo que está enfase final de redacción lo que se ha hecho esmodificar el triplete IFM de la inactivación rá-pida, y cuando esto se cambia por tres Q, loque se observa es que el fármaco tambiénpierde parte de su efectividad.

W. BUÑO: Me gustaría saber por qué utilizadespolarizaciones tan pequeñas, de -40 o-30 mV. En estas condiciones cuando la ac-tivación y la inactivación son pequeñas, hayque tener cuidado especialmente con la co-rriente de sodio, ya que se puede entrar enla window y tener una inactivación parcial.

J. TAMARGO: La razón es que estos experimen-tos se realizaron para ver inactivación rápida-lenta empleando un rango en el cual puedenaparecer reaperturas.

61

Posibilidades de manipulación farmacológicade los canales de potasio

C. González-García, R. Granja, J.M. Fernández, V. Izaguirre y V. CeñaDepartamento de Farmacología y Terapéutica e Instituto de Neurociencias.

Universidad de Alicante,

Introducción

Durante estos últimos años hemos asistido auna explosión de conocimiento sobre la relaciónestructura y función de los canales de K\ Esteavance ha resultado de la utilización conjuntade técnicas de ADN recombinante con técnicaselectrofisológicas y farmacológicas1. Como re-sultado de este incremento en su número, seha producido una gran confusión en cuanto ala nomenclatura con la que nos referimos a losdiversos tipos de canales de K+. Esta pequeñarevisión va a estar dividida en 3 apartados: enprimer lugar, una clasificación somera y, por tan-to, no exhaustiva de los tipos de canales K* co-nocidos y de su función. En segundo lugar, seexpondrán las acciones de alguno de los fárma-cos que se utilizan para bloquear las corrientesde K* y se indagará en cuáles son los determi-nantes moleculares de este bloqueo y, finalmen-te, hablaremos sobre un grupo de fármacos quetienen un gran potencial terapéutico como sonlos fármacos capaces de abrir canales de K+.

Clasificación be los canales de K+

Una posible clasificación de canales de K+

viene expresada en la tabla I. A partir de dicha

clasificación podemos ampliar brevemente la in-formación sobre cada uno de los tipos de ca-nales de K+ presentes en la misma.

Rectificador retrasado (Delayed retifier)

Es el canal que contribuye mayoritariamentea la corriente de K+ dependiente de voltaje enla gran mayoría de las células2'3. Cuando se re-gistran las corrientes globales en una prepara-ción, sus características cinéticas incluyen unaactivación sigmoidal y un cierre exponencialcuando se termina el pulso despolarizante3,siendo su inactivación muy lenta durante la du-ración del pulso. Este canal puede ser bloquea-do mediante diversas manipulaciones farmaco-lógicas como la aplicación de tetraetil amonio(TEA) desde el lado interno de la membranaplasmática. Desde este lado citoplásmico, el ca-nal es también bloqueado por los iones Ca2+ yBa2+. No obstante, cuando los fármacos blo-queadores se aplican desde el exterior de lamembrana plasmática, la situación es algo di-ferente, ya que la aplicación de TEA o 4-aminopiridina (4-AP) sólo es capaz de producir blo-queo en ciertas preparaciones, mientras que enotras no io produce. Esta diversidad sugería la

TABLA ICLASIFICACIÓN DE LOS CANALES DE POTASIO

Tipo de canal Bloqueadores específicosRectificador retrasado

Corriente transitoria (A)

Rectificador anómalo

Activado por Ca2 +

Pequeña conductanciaGran conductancia

Regulados por neurotransmisoresy segundos mensajeros

Citoplásmico: Ca2+, Ba2+

Extracelular: TEA, 4-APCitoplásmico: TEA, Cs~Extracelular: 4-APCitoplásmico: TEAExtracelular: Cs + , Ba2'

ApaminaTEA, caribdotoxina

TEA

63

EARMACOLOGA DE LOS CANALES IÓNICOS

posibilidad de que nos encontráramos frente auna familia de canales dependientes de voltajeen vez de frente a un único canal4, aspectoeste sobre el que trataremos posteriormente. Unaspecto importante de las propiedades de uncanal iónico consiste en conocer la función fi-siológica que cumple en la célula. En el casode los rectificadores retrasados se han propuestodos funciones fundamentales para estos cana-les: repolarización durante la producción de unpotencial de acción y contribución a la duracióndel período refractario en tejidos excitables.

Corrientes ¡nactivantes (corrientes tipo A)

Una de las características de este tipo de co-rrientes consiste en que son de comienzo muyrápido y transitorias5. La inactivación del esta-do estacionario de esta corriente es completacuando se mide al potencial de membrana dereposo. Generalmente este tipo de corriente noes la única corriente de Kh presente en las cé-lulas, sino que está acompañada por otros ti-pos de corrientes de K+ como el rectificadorretrasado. La corriente iónica generada por laactivación de este grupo de canales de K+ esbloqueada por la aplicación, en el lado extra-celular de la membrana plasmática de 4-AP omediante la aplicación en el lado citoplásmicode Cs+ o TEA. Las funciones fisiológicas que seadscriben a este canal tienen que ver, sobretodo, con la repolarización del potencial de ac-ción y la regulación de la velocidad de disparode potenciales de acción.

En general, se considera, en sentido estricto,a estos 2 grupos de canales de K+ dentro delgrupo de los canales dependientes de voltaje.Cuando se intentaron aislar estos dos tipos decanales de K+, mediante técnicas de biologíamolecular, se observó que existía una familia degenes que codificaban diferentes canalesde K+ dependientes de voltaje4. Existen 6 gru-pos diferentes de genes, que codifican los di-versos tipos de canales de K+ dependientes devoltaje, denominados Kvl a Kv6, aunque den-tro de cada uno de estos grupos puede existirmás de un gen. Aunque el grado de homologíaentre los diversos genes es grande, las peque-ñas diferencias podrían condicionar la diferen-te sensibilidad a los fármacos bloqueadores.

Rectificadores anómalos (Inward rectifier)

En estos canales de KT, la conductancia seincrementa mediante la hiperpolarización, per-mitiendo la entrada de K* en la célula67. La ca-

racterística biofísica más importante de este ca-na, es la rectificación de la corriente que aparecea potenciales próximos al potencial de equilibriopara el K-. Esta corriente de K+ es bloqueadapor TEA (aplicado en el interior de la célula),Cs+ y Ba2-. Las funciones fisiológicas atribui-das a este tipo de canales de K+ son, entreotras, las siguientes: generación de actividadmarcapasos en el corazón, fertilización del huevoy regulación de la frecuencia de descarga de po-tenciales de acción,

Canales de K* activados por Ca2i

Son canales de K+ activados por concentra-ciones submicromolares de Ca2\ En experi-mentos en los que se miden corrientes globa-les, la cinética y la dependencia de estascorrientes están relacionadas con la activaciónde corrientes de Ca2t dependientes de voltaje8.Existen dos tipos de corrientes de K* activadaspor Ca2+, una de pequeña conductancia(15 pS) que es sensible a apamina y que, entreotras funciones celulares, es responsable de laproducción de posthiperpolarizaciones9 y, porotro lado, una corriente de gran conductancia(150-250 pS) que se bloquea por bajas concen-traciones de TEA y caribdotoxina y que contri-buye a poner fin a la entrada de Ca2t duranteur potencial de acción y a la repolarización delpotencial de acción1011, Ambos tipos de co-rriente se encuentran ampliamente distribuidosen células excitables y secretoras.

Canales regulados por segundos mensajeros

Existe un grupo, cada vez más numeroso, decanales de K+ regulados por segundos mensa-jeros. Entre este grupo se encuentran, entreotros, canales que son inactivados por meca-nismos de fosforilación acoplados a la activaciónde un receptor de serotonina como la corrienteS presente en neuronas de Aplysia12 y canalesde K* que son activados directamente por pro-teínas G13. En este grupo de canales está in-cluido otro tipo de canal de K+ que es el regu-lado por ATP, que desempeña un papelfundamental en la secreción de insulina en cé-lulas |3 pancreáticas14.

Bases moleculares de la acciónde los bioqueadores de canales de K+

dependientes de voltaje

Hemos visto en el apartado anterior que loscanales de K̂ dependientes de voltaje son

64

POSIBILIDADES DE MANIPULACIÓN FARMACOLÓGICA DE LOS CANALES DE POTASIO

sensibles al bloqueo por determinados com-puestos. Actuando desde el exterior de la célu-la existen dos tipos de compuestos que puedennteraccionar con el canal de K (: compuestos

orgánicos, con carga positiva, entre los que losmás comunes son TEA, 4-AP y qulnidina y, porotra parte, toxinas como la caribdotoxina. To-mando como ejemplo el bloqueo que la admi-nistración de TEA desde el exterior de la célulaejerce sobre las corrientes de K+ vamos a in-tentar comprender cuáles son los determinan-tes moleculares que condicionan dicha unióndel bloqueador al canal.

Los estudios sobre la estructura, derivada dela secuencia, de los canales de K+ dependien-tes de voltaje se han realizado, mediante muta-génesis dirigida, en canales de K+ Shakerlb. Di-chos estudios han indicado la existencia de unaregión, denominada H5, que está formada por19 aminoácidos y que parece formar el poro delcanal16. En esta región del canal, los aminoáci-dos se numeran siempre del 1 al 19 para resal-tar que esta región se conserva y aparece, aun-que no siempre en la misma posición en lasecuencia, en todos los tipos de canales de K+

dependientes de voltaje clonados hasta hoy. Seha observado que, en la familia de canales deK+ dependientes de voltaje RCK, que están re-lacionados con Shaker, existe una diferente sen-sibilidad al bloqueo por TEA, siendo más sensi-bles RCK1 y RCK2 que RCK4 y RCK5. Lasustitución de la treonina que ocupa la posición19 de la región H5 en RCK2 por una usina haceque ese canal pierda totalmente su sensibilidada TEA17. En cambio, el cambio de la usina, enposición 19 por cualquier aminoácido no car-gado, vuelve al canal RCK4 muy sensible a TEA.Estos experimentos, junto con otros que sugie-ren que la incorporación de un aminoácido car-gado en posición 1 disminuye la sensibilidad aTEA hacen suponer que los aminoácidos 1 y 19forman parte del sitio de unión de TEA a los ca-nales de K1 dependientes de voltaje,

Fármacos que activan canales de K+

Los fármacos que son capaces de abrir loscanales de K+ constituyen un grupo heterogé-neo en cuanto a su estructura química comopuede verse en la tabla II. No obstante esta di-versidad de estructura, todos estos fármacos ac-túan, inicialmente, abriendo canales de K+ re-gulados por ATPLB.

Existen tres hechos importantes sobre la ac-ción farmacológica de estos compuestos: pro-ducen una hiperpolarización de la célula, en

TABLA IIESTRUCTURA QUÍMICA DE LOS DIVERSOS

FÁRMACOS ACTIVADORESDE LOS CANALES DE POTASIO

Grupo químico FármacoBenzopiranoTiourea/guanidinaPiridinaPirimidinaBenzotiadiazinaTioformamidaDihldropiridinas

LemakalimPinacidiloNicorandiloMinox:diloDiazóxidoRP 52891Nigmdipino

otras palabras, el potencial de membrana sedesplaza hacia el potencial de equilibrio parael K4, con lo que se hace más negativo. En se-gundo lugar, su acción farmacológica se bloqueaen presencia de elevadas concentraciones deKf extracelular y, en tercer lugar, sus accionesson bloqueadas por sulfonilureas19 lo que, jun-to al desplazamiento por sulfonilureas de la fi-jación de estos compuestos a membranas demúsculo liso20, apoya fuertemente la ¡deadeque su lugar de acción es el canal de K<activado por ATP. No obstante, han comenza-do a diseñarse algunos fármacos21 de este gru-po capaces de actuar selectivamente sobre ca-nales de K+ activados por Ca2+,

Las indicaciones terapéuticas de los fármacosque son capaces de abrir canales de K4 po-drían incluir la hipertensión arterial, el asmabronquial, ¡a claudicación intermitente y la is-quemia miocárdica.

Las bases terapéuticas de su acción en elasma vendrían determinadas, en primer iugar,por su acción hiperpolarizante sobre la fibramuscular lisa, lo que impediría que se abrierancanales de Ca2- dependientes de voltaje y, deesta forma, entrara Ca2+ al Interior de la célulay se produjera la contracción de la célula mus-cular lisa22. Pero cada vez existen más eviden-cias que sugieren que estos compuestos podríaninterferir con la producción de IP3 en respues-ta a diversos agonistas23.

Una de sus indicaciones terapéuticas másprometedoras podría ser en la enfermedad is-quémica miocárdica. Estos compuestos, a do-sis bajas, son capaces de disminuir el tamañodel infarto en perros con oclusión de la corona-ria anterior^. No obstante, las acciones eléctri-cas de los fármacos que abren canales de K4

consisten fundamentalmente en, por una par-te, acortar la duración del potencial de accióncardíaco y, por otra, aumentar la concentración

65


de K+ extracelular que despolarizaría la zonaisquémica y así produciría un descenso en lacontractilidad miocárdica26. Este descenso enla contractilidad disminuiría el consumo de oxí-geno y disminuiría el daño isquémico.

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25. Mitani A, Kinoshita K, Fukamachi K, Sakamoto M,Kurisu K, Tsuruhara Y et al. Effects of glibencia-mida and nicorandil on cardiac function duringischemia and reperfusion in isolated perfusedrat hearts. Am J Physiol 1991; 261: H1.864-H1.871.

DISCUSIÓN

E. DEL Pozo: En relación con las posibles apli-caciones terapéuticas de los agentes queabren canales de potasio, hemos observado

que la cromakalina, un agonista del canal depotasio, potencia de forma dosisdependienteel efecto analgésico de diferentes agonistas

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POSIBILIDADES DE MANIPULACON FARMACOLÓGICA DE LOS CANALES DE POTASIO

mu, en concreto de morfina, buprenorfina ymetadona, así como la clonidina; este efectoes inhibido también de forma dosisdependien-te por sulfonilureas. Por otro lado, tambiéncomprobamos que inhibía la actividad epilep-togénica del pentilentetrazol, y en este senti-do estos agentes podrían tener utilidad. Qui-siera también referirme a la posible influenciadel tejido sobre el efecto de los agonistas delcanal de potasio en el sentido de que pareceque en músculo liso, cromakalina y pinacidi-lo actúan también en canales de potasio cal-ciodependientes, mientras que en otro tipo depreparaciones como en músculo esquelético,músculo cardíaco o células pancreáticas elefecto es más específico sobre canales de po-tasio ATP dependientes. ¿Podría aclarar es-tas diferencias?

V. CEÑA: Uno de los aspectos a los que no mehe referido en la charla es la supuesta selec-tividad de estos fármacos, y esta selectividadno se refiere tan sólo a su efecto sobre cana-les de potasio. Por ejemplo, estos fármacospueden inhibir la entrada de calcio en mús-culo liso por un mecanismo hiperpolarizante,ya que al hiperpolarizar la polaridad de aper-tura del canal de calcio voltajedependientedisminuye y, por tanto, se van a abrir menoscanales de calcio. Pero aparte de eso hay otroefecto interesante que consiste en que estoscompuestos son también capaces de inhibirlas contracciones inducidas por agonistas, ycuando se inhiben contracciones inducidaspor agonistas que están mediadas probable-mente por liberación de calcio del retículo en-doplásmico a través de la generación de IP3hay que pensar que junto a esta acción en lamembrana existen otras acciones intracelula-res. Se ha descrito que en células de múscu-lo liso alguno de estos compuestos son capa-ces de inhibir la síntesis de IP3 en respuestaa un agonista, lo cual es otro mecanismo deacción que puede contribuir a esa acción va-sodilatadora y que no tiene nada que ver consu acción sobre canales iónicos en la mem-brana.

F. SALA: ¿Cuál es el mecanismo íntimo por elque actúan estos abridores sobre los distin-tos canales de potasio?

V. CEÑA: Parece ser que su mecanismo de ac-ción consiste a nivel de competición con el si-tio de fijación de ATP al canal. No una com-petición directa, sino que de alguna formamodulan la sensibilidad del canal al ATP.

J. LÓPEZ BARNEO: Entonces sugiero que se lesllame agonistas del canal sensible de ATP, ya

que el término «abridores de canales de po-tasio» es confuso puesto que induce a pen-sar en los canales de potasio clásicos voltaje-dependientes. Me interesaría saber cómo estáel estado actual de la farmacología de los ago-nistas o abridores de canales de potasio, perono centrada en los canales regulados por ATPsino más en general. Usted se ha referido an-tes a los canales de potasio regulados porcalcio.

V. CEÑA: Desconozco si existen fármacos queespecíficamente sean capaces de abrir cana-les de potasio voltajedependientes. De hecho,el nombre de estos fármacos debe atribuirsehistóricamente a que fueron los primeros com-puestos en los cuales se demostró una accióndirecta de capacidad de abrir un tipo de ca-nal de potasio, e inicialmente se consideraronmuy selectivos para el canal de potasiodepen-diente de ATP. Actualmente con estudios demodificaciones químicas de la molécula sehan obtenido algunos compuestos capaces deabrir selectivamente canales de potasio acti-vados por calcio. La cuestión que subyace enesto es ¿hasta qué punto estas son molécu-las absolutamente selectivas para abrir un tipode canales y no tienen otras acciones? De he-cho muchos de estos compuestos que origi-nalmente se consideraron fármacos que erancapaces de abrir selectivamente el canal depotasiodependiente de ATP tienen otras ac-ciones intracelulares.

J. TAMARGO: LOS que trabajamos en vasos coneste tipo de fármacos hemos tenido la opor-tunidad de demostrar que modifican la libe-ración de calcio desde el retículo sarcoplás-mico en preparaciones incubadas en 0 calcio,y que son capaces de inhibir la entrada de cal-cio inducida por noradrenalina en preparacio-nes tratadas con 105 mol de D60O. Esto im-plica necesariamente que tiene que ser laentrada de calcio inducida por noradrenalina,no sensible a bloqueadores de canales de cal-cio voltajedependientes, es decir, la entradade calcio a través de canales dependientes dereceptor o inducida por noradrenalina. Ade-más, tanto la disminución de IP3 como la dis-minución de la liberación de calcio desde elretículo sarcoplasmático parece ser siempreun fenómeno voltajedependiente, al menos enel músculo esquelético, ya que al hiperpolari-zar la membrana disminuye la posibilidad deliberación de calcio.

A.G. GARCÍA: Me ha llamado la atención el co-mentario de la Dra. del Pozo sobre el efectoanalgésico de alguno de estos fármacos acti-

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vadores de canales de potasio sensibles aATP, y ello porque se oponen a la entrada decalcio por inactivarse los canales de calcio me-diante la hiperpolarización que producencomo antes comentaba el Dr. Ceña. Si comose ha demostrado, los calcioantagonistasmuestran un efecto sinérgico con los opioldesen cuanto a analgesia, ¿no es incongruenteque los activadores de canales de potasio, quebloquean indirectamente la entrada de calcio,tengan efecto analgésico?

E. DEL Pozo: Los activadores de canales de po-tasio bloquean la entrada de calcio indirec-tamente. Existen datos electrofisiológicos queindican que los agonistas kappa bloquean di-rectamente canales de calcio y en la analge-sia inducida por estos agentes los agonistasy los antagonistas de los canales de potasioATP-dependientes no tienen ningún efecto. Osea, que se puede discriminar la interacciónde los agonistas-antagonistas del canal de po-tasio con los diferentes opiáceos, según queéstos ejerzan su acción directamente a través

de un canal de potasio o bien la ejerzan di-rectamente a través de un canal de calcio.

A.G. GARCÍA: Teniendo en cuenta lo dicho has-ta ahora ¿no sería interesante disponer de unamolécula híbrida? Es decir, una molécula enla que se pudieran conjugar algunas propie-dades que contrarrestaran los efectos no de-seables de estos fármacos, concretamente unbloqueador beta que a su vez produjera unaactivación de canales de potasio podría resol-ver muchos problemas. ¿Les parece factibleel diseño de un fármaco híbrido de estas ca-racterísticas?

C. SUNKEL: Sí, esta es la tendencia en la actua-lidad. Se intenta diseñar fármacos con una ac-tividatí dual para conseguir dos efectos, o unefecto que antagonice algún otro efecto no de-seado.

V. CEÑA: En este contexto, existe un fármaco,nivuldipino, que claramente es un derivado aedihidropihdina y es también un antagonista delcalcio.

68

Diversidad de canales de calciovoltajedependientes

L. Gandía, A. Albulos, M.G. López y B. LaraDepartamento de Farmacología y Terapéutica. Facultad de Medicina. Universidad Autónoma. Madrid.

Introducción

Todas las células, y en especial las del siste-ma nervioso, se comunican entre sí, utilizandopara ello un lenguaje de naturaleza química oeléctrica. La información recibida es procesa-da mediante un complejo sistema de mensaje-ras intracelulares que van a traducir la señal re-cibida en un lenguaje comprensible para sumaquinaria metabólica. El catión calcio (Ca2+)es uno de los mensajeros más ubicuos y conmayor participación en procesos de regulacióncelular, Existen diferentes mecanismos regula-dores (bomba de Ca2+, secuestro en organelas¡ntracelulares, proteínas fijadoras de calcio) quepermiten mantener el Ca2' citosólico en valoresextremadamente bajos (alrededor de 100 nM},mientras que la concentración que este catiónalcanza en el medio extracelular es de unas25,000 veces superior. A esto hay que añadirel hecho de que el ambiente eléctrico negativoexistente a nivel intracelular va a generar un gra-diente eléctrico que también favorecerá la en-trada de este catión en la célula.

Ante esta situación, es factible que muchosestímulos sean responsables de generar una se-ñal consistente en la elevación de la concentra-ción citosólica de Ca2+, [Ca2+]¡, que regula ycontrola otros tantos procesos celulares que vandesde la fecundación del oocito por el esper-matozoide hasta el desarrollo del embrión, des-de la contracción del corazón hasta la de losmúsculos liso y estriado, desde la coagulaciónde la sangre hasta la regulación de la excitabili-dad neurona!, desde el transporte axoplásmicohasta el envejecimiento y muerte neuronal, des-de la secreción de hormonas hasta la libera-ción de neurotransmisores en el sistema nervio-so central y periférico.

Estas elevaciones de los valores citosólicos deCa2+ pueden producirse tanto por la liberacióndel catión desde diferentes organelas intracelu-lares como por su entrada desde el exterior ce-lular a través de diferentes canales iónicos. En-tre estos últimos podemos distinguir aquellos

acoplados a receptores y aquellos que se abrenen respuesta a la despolarización de la mem-brana (canales de calcio voltajedependlentes),y que serán objeto de discusión del presente tra-bajo.

Canales de calcio voltajedependientes

El estudio y caracterización de las diferentesvías de entrada de Ca2+ hacia el interior celu-lar va a resultar importante por varias razones:por un lado, para conocer la importancia delCa2+ como mensajero intracelular capaz dedisparar funciones tan diferentes, no sólo en di-ferentes células sino también en una misma cé-lula; por otro lado, el conocimiento de estas di-ferentes vías puede favorecer el desarrollo denuevos fármacos que Interfieran selectivamen-te con estas vías y que puedan tener un poten-cial terapéutico (p. ej., en enfermedades cardio-vasculares y del sistema nervioso, muerteneuronal).

Para la identificación y caracterización de loscanales de Ca2+ dependientes de voltaje(CCDV) se han empleado diferentes aproxima-ciones metodológicas, entre las que podemosdestacar los estudios de fijación de radioligan-dos1, estudios de captación de cationes diva-lentes marcados radiactivamente2, estudioscon sondas fluorescentes sensibles a Ca2+,particularmente fura-23, estudios funcionales4 oestudios de biología molecular6. Entre todas es-tas metodologías, lo que ha supuesto los mayo-res avances en la Identificación y caracterizaciónde los CCDV ha sido el desarrollo de las técni-cas de fijación de voltaje en parches demembrana6 (patch-damp)), junto al aislamien-to y purificación de potentes toxinas7 con selec-tividad para los diferentes subtipos de canalesde Ca2+.

Los canales iónicos dependientes de voltajeconstituyen una familia de estructuras proteicasconstituyentes de las membranas celulares, for-madas por varias subunidades transmembrana.

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FARMflCOX'GiA. DE LOS CANALES IÓNICOS

TABLA

Tipo de canal

Canales de bajode activaciónT

Canales dealto umbralde activación(HVA)L

N

P

Q

1. CLASIFICACIÓN DE CANALES

Voltaje deActivación

umbral<LVA>>-6O mV

> -50 mV

>-50 mV

>-45 mV

Conductancia

6-9 pS

18-28 pS

7-14 pS

9,14,19 ps

DE CALCIO VOLTAJEDEPENDIENTES

Cinética deinactivación

T= 5-10 msVoitajedependiente

r>200 msCalciodependienter = 50 msCalciodependiente

r = 1 s

Farmacología

N¡2-Amilorida

Co2 + , M n 2 \ Cd2-DihidropiridínasCo2 í , Mn 2 i , Cd2

w-ccnotoxira GVIAw-ccnctoxira IVVIIAw-conctoxira VIVIICío-conotoxina MVIIDCo2-, Mn 2 ' , Cd2-FTX, sFTXú)-agatox¡na IVAo-conotoxina MV ICco-conotoxina MVIICío-conotoxina MVIID

Entre estas cabe destacar la subunidad a¡ queforma el poro iónico y que va a ser la responsa-ble de la permeabilidad al Ca2+ y de los meca-nismos que regulan la apertura del canal. Enesta subunidad se encuentran los sitios de uniónpara los diferentes antagonistas. La presenciade las otras subunidades (a2, |3, y y 5) es tam-bién crítica pues estas contribuyen a la funcio-nalidad del canal. Hasta el momento se hanidentificado hasta 6 subunidades at (A, B, C,D, E, S) y varias a2 y ft con lo que la posibili-dad de combinaciones justifica la diversidad decanales de Ca2+ descritos en vanos tejidos.

Dejando un poco al margen toda esta nuevainformación que emerge de estudios de biolo-gía molecular, nos centraremos en los avancesobtenidos en los últimos años gracias a los es-tudios electrofisiologicos desarrollados tanto enla célula entera como en el canal único. Se hanidentificado y clasificado al menos cuatro sub-tipos (T, L, N y P) de canales de Ca2+ voltaje-dependientes en función de sus propiedadesbiofísicas y farmacológicas.

Las primeras clasificaciones realizadas811 dis-tinguieron dos grandes subgrupos en función delrango de voltaje en et que se produce su acti-vación (tabla I). Así, se denominan canales debajo umbral de activación (LVA) aquellos que seactivan por voltajes por encima de - 5 0 mV. Son

canales que se pueden abrir en respuesta a pe-queñas despolarizaciones desde potenciales demembrana bastante negativos. Por otro lado, seconsideran canales de alto umbral de activación(HVA) aquellos cuya activación se produce porvoltajes superiores (-30 a - 2 0 mV). Otras ca-racterísticas biofísicas y farmacológicas nos vana permitir definir los diferentes subtipos de ca-nales dentro de estos dos grandes subgrupos.

Canales de bajo umbral de activación (LVA)

Dentro de este sibgrupotan sólo se ha iden-tificado un subtipo ce canal, denominado T (detransient). Este canal, descrito por primera vezpor Carbone y Lux8, recibe su nombre por suscaracterísticas cinéticas, al tratarse de un canalcon una rápida inactivación. Se caracteriza tam-bién, como ya hemos comentado, por un bajoumbral de activación (-50 a -30 mV), una con-ductancia unitaria de 8pS (en presencia deHOmM Ba2+), una permeabilidad similar aBa2+ y CB2+ y su inactivación cuando se man-tiene el potencial de membrana de la célula en-50 mV.

Farmacológicamente, los canales tipo T se ca-racterizan principalmente por su insensibilidada fármacos de tipo 1,4-dihidropiridinas (DHP)como nifedipino y Bay K 8644, y una menor

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DIVERSIDAD DE CANA.ES DE CALCIO VOLUUEDEPEND.ENTES

sensibilidad al bloqueo por el catión inorgánicoCd2+ que al Ni2*. Se han descrito algunos com-puestos orgánicos que pueden bloquear espe-cíficamente este subtipo de canal. Entre estoscabe destacar el I-octanol y la amilorida.

Los canales T han sido identificados en unagran variedad de células, Incluyendo tanto neu-ronas centrales como periféricas, células mus-culares cardíacas, esqueléticas y musculares li-sas, fibroblastos, osteoblastos, oocltos y algunascélulas secretoras. En tejidos excitables, la pre-sencia de este subtipo de canal se relaciona conuna actividad rítmica de tipo marcapasos12.

Canales de alto umbral de activación (HVA)

Si bien ¡nlcialmente las características elec-trofislológicas (conductancia unitaria del canal,cinéticas de activación e Inactivación) constitu-yeron los principales argumentos para la clasi-ficación de los diferentes subtipos de canalesde calcio, en los últimos años la ayuda de he-rramientas farmacológicas ría garado importar -cia en la Identificación y caracterización de losdiversos subtipos de canales de Ca" HVA.Hasta el momento, existen tres subtipos clara-mente identificados (denominados L, N y P)1315

y recientemente se han comenzado a identifi-car y caracterizar otros dos subtipos (denomi-nados Q y R)16'17.

En general, los canales de Ca2- HVA se ca-racterizan por su activación por mayores des-polarizaciones (-30 a -20 mV), su mayor per-meabilldad al Ba2+ que al Ca2t y su mayorsensibilidad al bloqueo por Cd2+ que por Ni2+.Las variaciones en sus cinéticas de activacióne inactivación, así como su diferente farmaco-logía, constituyen las bases para la identifica-ción y caracterización de los diferentes subtiposexistentes.

Los canales de Ca2t del subtipo L se carac-terizan por mostrar una lenta inactivación(T¡nac > 500 ms), siendo además menos sensi-bles al mantenimiento de un potencial de mem-brana ligeramente despolarizado. Su conductan-cia unitaria está en el rango de 18-25 pS.Farmacológicamente se caracteriza por su altasensibilidad a DHP, tanto agonistas (Bay K 8644)como antagonistas (nifedipino, nitrendipino, fur-nidipino), por lo que también son conocidoscomo canales sensibles a DHP. Particularmentecaracterístico es el efecto de las DHP agonistas,caracterizado por una prolongación del tiempomedio de apertura de estos canales, fácilmen-te identificable en estudios de canal único y quese traduce en una prolongación de las corrien-

tes de cola (en estudios en céiula entera) porenlentecer la desactivación de los canales.

Los canales de Ca2+ tipo L se encuentranprácticamente en casi todas las células excita-bles y en muchos tipos de células no excitables.Constituyen la principal vía de entrada de Ca2+

en el músculo cardíaco y músculo liso, y contri-buyen al control de la liberación de hormonasy neurotransmisores en diferentes preparacio-nes endocrinas y neuronales.

Los canales del subtipo N pueden distinguir-se de los L por su cinética de inactivación, yaque estos presentan una inactivación lenta(rinac50-80ms), aunque más rápida que la des-crita para los canales tipo L. Otras característi-cas biofísicas que los diferencian de los cana-tes de Ca2+ tipo L son mayor sensibilidad apotenciales de membrana ligeramente despo-larizados y su conductancia unitaria, que es algomenor (13 pS). A pesar de estos criterios biofí-sicos difererciales, en algunas preparacionespuede observarse la existencia de un ccmpc-nente IM no inactlvarte-11, por o que en gene-ral se considera que la separación de los subt1-pos de canales basada simplemente en crlter oscinéticos puede conducir a conclusiones erró-neas. Esto ha favorecido la búsqueda y de-sarrollo de herramientas farmacológicas quepermitan una mejor caracterización. Farmaco-lógicamente los canales de Ca2+ tipo N se ca-racterizan por su insensibilidad a DH P y por blo-quearse eficazmente, deforma irreversible, porla toxina w-conotoxina GVIA (CTx-GVIA)?'9'18.Aunque algunos autores han encontrado un cier-to bloqueo de canales tipo L por esta toxina,existe un amplio consenso en considerar a estatoxina como selectiva para los canales del sub-tipo N. Los canales tipo N predominan en neu-ronas simpáticas y sensoriales, encontrándosetambién en proporciones variables en diferen-tes tejidos endocrinos. No parecen estar presen-tes en células musculares. Funcionalmente pa-recen estar implicados en el control de latransmisión sináptica en neuronas periféricas yen la regulación de ía liberación hormonal encélulas neuroendocrinas.

La reciente identificación y caracterización denuevos subtipos de canales de Ca2+ ha sidoposible gracias al aislamiento, purificación y sín-tesis de nuevas y potentes toxinas capaces debloquear selectivamente componentes de lascorrientes globales de Ca2- que se habíanmostrado resistentes al bloqueo por DHP y CTx-GVIA. En este sentido, en 1989, Llinás et al19

encontraron que la toxina contenida en el ve-neno de la araña Agelenopsis aperta (FTX) era

71


capaz de bloquear las corrientes de Ca2+ resis-tentes a DHP y CTx-GVIA en neuronas de Pur-kinje, lo que les indujo a describir la existenciade un nuevo subtipo de canal de Ca2+ HVAque denominaron P (por «Purkinje»). La poste-rior purificación de este veneno llevó a la iden-tificación de varias subfracciones. Una de es-tas fracciones, las poliaminas (entre las que seencuentra la FTX y su derivado sintético sFTX)se mostraron como potentes bloqueadores delos canales de CaÍH tipo P, pero también pare-cían bloquear otras corrientes Iónicas20. Otrade las fracciones parificadas, las <o-agatoxi-nas21, parecen bloquear potentemente variossubtipos de canales de Ca2-, siendo la w-agatoxina IVA (Aga-IVA)1622 un bloqueador se-lectivo para los canales de tipo R Actualmentese utiliza la Aga-IVA como herramienta farma-cológica para caracterizar la presencia de estasubpoblación de canales en un tipo celular. Elbloqueo de canales tipo P por Aga-IVA se pue-de observar con concentrac iones bajas(10 = 100nM) y se caracteriza por ser práctica-mente irreversible tras el lavado de la toxina,aunque puede ser revertido con la aplicación detrenes de pulsos despolarizantes15'22. Les cana-les tipo P se encuentran ampliamente expresa-dos en neuronas de Purkinje y también pare-cen coexistir en otras preparaciones como enneuronas de hipocampo y en células cromafi-nes bovinas15'22-25.

Se ha aislado recientemente otro nuevo gru-po de toxinas, purificadas y sintetizadas a par-tir del caracol marino Conus magus2^27. Se handenominado co-conotoxinas MVII y parecen blo-quear selectivamente diferentes subtipos de ca-nales de Ca2' en neuronas. Entre estas, la o>-conotoxina MVIIA parece bloquear los canalesde Ca2+ tipo N, pero a diferencia de la CTx-GVIA, lo hace de forma reversible. Mediante téc-nicas de biología molecular se ha conseguidosintetizar la toxina u-conotoxina MVIIC (CTx-MVIIC)7-2E, que parece bloquear tanto canalestipo N como canales tipo P en diferentes pre-paraciones neuronales, pero que ha servido paraidentificar la presencia de un nuevo subtipo decanal HVA que ha recibido diferentes denomi-naciones. A partir de estudios de fijación de to-xinas marcadas radiactivamente se ha sugeri-do la existencia de un canal «O» correspondientea la existencia de un sitio de fijación de alta afi-nidad específico para la CTx-MVIIC28. Funcic-nalmente, se ha caracterizado la existencia deun subtipo de canal de Ca2h insensible al blo-queo por DHP, CTx-GVIA y Aga-IVA, que puedeser bloqueado por esta nueva toxina CTx-MVIIC,

y que ha sido denominado «canal Q»16'17.29.Este nuevo subtipo de canal se ha identificadoen neuronas de hipocampo, donde parece me-diar en la transmisión sináptica junto a los ca-nales tipo N17.

Finalmente, en algunas preparaciones neuro-nales se ha observado la existencia de un com-ponente residual de las corrientes globales deCa2+ tras el tratamiento con todos estos blo-queadores por lo que se especula con la exis-tencia de un quinto subtipo de canal de Ca2+.Este nuevo subtipo de canal HVA de rápida inac-tivación y caracterizado farmacológicamente porsu insensibilidad al bloqueo por DHP, CTx-GVIA,Aga-IVA y CTx-MVIIC y por su sensibilidad al blo-queo por Ni2+, ha sido denominado R16 aun-que en la actualidad, su identificación y carac-terización es controvertida.

Finalmente, cabría destacar el hecho de queesta clasificación funcional de canales de Ca^no se corresponde con exactitud a las nuevasclasificaciones que emergen a partir de estudiosde biología molecular. Como ya hemos co-mentado anteriormente, la identificación de di-ferentes subunidades « i , a2 y ¿3 y las diferen-tes posibilidades de combinación de estassubunldades pueden originar subtipos de ca-nales de Ca2' en experimentos de reconstitu-ción que no se corresponden con esta clasifi-cación funcional.

Subtipos de canales de calcioen la célula cromafin

Los datos obtenidos durante los últimos añospor varios grupos investigadores utilizando di-ferentes técnicas, que incluyen estudios de se-creción de catecolamlnas, trasiegos de isótoposradiactivos, monitorización de las concentracio-nes citoplasmáticas de Ca2+ libre y registros di-rectos de corrientes iónicas sugieren la existen-cia de varios subtipos de canales de Ca21

voltajedependientes en la membrana de las cé-lulas cromafines que, además, están acopladosde manera diferente al proceso secretor de ca-tecolaminas.

Mediante la combinación de técnicas electro-fisiológicas con herramientas farmacológicas(fármacos y toxinas), hemos estudiado la pre-sencia de diferentes subtipos de canales deCa2+ voltajedependientes en células cromafinesde tres especies diferentes: rata, gato y terne-ra. La selección de estas tres especies se hizosegún la distinta sensibilidad del proceso secre-tor de catecolaminas frente a diferentes bloquea-dores de canales de Ca2-.

72

DIVERSIDAD DE CANALES DE CALCIO VOLTAJEDEPENDIENTES

En las células cromafines bovinas, la existen-cia de más de un subtipo de canales de Ca2+

ya fue sugerida en la década de los ochenta,gracias a experimentos en los que se mostrabaque el derivado de 1,4-dihidropiridinas (DHP)nitrendipino bloqueaba la secreción de [3H]-noradrenalina en células cromafines bovinasestimuladas con nicotina o con [K+] eleva-das30. Además, el Bay K 8644, otro derivadoDHP potencia la captación de 45Ca2+ en célu-las cromafines, así como la secreción de cate-colaminas31'32. Posteriormente, mediante expe-rimentos de f i jación de radiol igandos sedemostró que la membrana plasmática de la cé-lula cromafín contiene, además de sitios deunión para [3H]-nitrendipino3133 y [3H]-isra-dipino34, otros sitios que reconocen la [1 2 5 I ] -U-conotoxina GVIA33. Además, tanto nitrendipinocomo CTx-GVIA bloquean parcialmente la cap-tación de 45Ca2+ en células cromafines bovinasdespolarizadas con K+33.

Estas dos observaciones sugirieron que la cé-lula cromafín bovina pudiera expresar más deun subtipo de canal de Ca2+; al menos el L(sensible a DHP) y el N (sensible a CTx-GVIA).Esta heterogeneidad de canales de Ca2+ se co-rroboró en 1991 con la aparición de 4 publica-ciones. Los artículos en cuestión comunicabanel hallazgo de dos3437 o tres38 subtipos de ca-nales de Ca2+ en células cromafines bovinas,mediante registros con técnicas de patch-clampde las corrientes globales o corrientes micros-cópicas que fluyen a través de dichos canales.Un subtipo de esos canales era sensible a DHP,pero otros no. Posteriormente, el uso de toxinaspermitió disecar un componente sensible a CTx-GVIA23'24'39-40, corroborando nuestros experi-mentos funcionales y de unión de radioligan-dos33 y apuntalando nuestra hipótesis inicial dela existencia de canales L y N en la célula cro-mafín bovina. Pero un hecho a destacar es queen todos estos estudios se describía la presen-cia de un importante componente o bloqueadopor la combinación de DHP y CTx-GVIA. La re-ciente disponibilidad de toxinas que bloqueanespecíficamente los canales de Ca2+ del subti-po P nos permitió investigar si este nuevo sub-tipo de canal de Ca2+ estaría presente en lamembrana de las células cromafines bovinas.Los resultados obtenidos utilizando sFTX23 yAga-IVA24 sugieren la presencia de un impor-tante componente con un comportamiento far-macológico que remeda al canal P descritoprimero por Llinás et al19 en las neuronas ce-rebelosas de Purkinje. En los últimos meses, lautilización de otra toxina, la co-conotoxina MVIIC

(CTx-MVIIC) nos ha permitido aislar lo que po-dría ser un cuarto subtipo de canal de Ca2+ enesa célula, que bien pudiera corresponder alque se ha dado en llamar O28 o Q1W7.

En células cromafines de gato se realizaronexperimentos similares. El interés de esta espe-cie es grande ya que desde 1984 sabíamos queel proceso secretor de catecolaminas parecíacontrolarse exclusivamente por un canal deCa2+ tipo L, ya que la secreción se bloqueacompletamente por DHP30'41'42. Los registros delas corrientes globales de Ba2+ a través de loscanales de Ca2+ mostraron una alta sensibili-dad al bloqueo por DHP (tanto nisoldipino comofurnidipino bloquearon un 45%), pero es de des-tacar la presencia de un importante componente(45%) sensible a CTx-GVIA43. Incluso en pre-sencia de DHP, CTx-GVIA no es posible obtenerun bloqueo completo de las corrientes globa-les de Ba2+, lo que podría sugerir la coexisten-cia de una pequeña población de canales delsubtipo P, lo que parece confirmado por el he-cho de que la Aga-IVA, a concentraciones de SO-ZOO nM, es capaz de inducir un pequeño, aun-que significativo, bloqueo de estas corrientes.

Finalmente, este tipo de estudios ha sido tam-bién repetido en células cromafines aisladas apartir de médula adrenal de rata. El proceso se-cretor de catecolaminas en esta especie es mo-dulado de forma clara por fármacos DHP si biense ha observado un pequeño componente re-sistente a estos fármacos44. Al estudiar las co-rrientes globales de Ba2+ a través de canalesde Ca2+ se ha observado que, al igual que enbovinos y en gato, sólo se observa la existenciade canales de alto umbral (HVA) en estas cé-lulas. En cuanto a su sensibilidad farmacológica,se pudo observar la existencia de un compo-nente mayoritario modulado por DHP tantoagonistas como antagonistas, pero también seconstató la presencia de componentes sensiblesa CTx-GVIA (31%) y Aga-IVA Q5%)45.

A modo de resumen, ha podido comprobar-se la presencia de al menos tres subtipos de ca-nales de Ca2+ mediante la combinación de téc-nicas electrofisiológicas y las herramientasfarmacológicas disponibles actualmente. Estostres subtipos (L, N y P) parecen encontrarse enproporciones diferentes en las tres especies es-tudiadas (fig. 1). Así, por ejemplo, en bovinosel componente L es minoritario mientras queeste es el principal componente en el gato y prin-cipalmente en la rata. Por el contrario, el com-ponente P parece ser mayoritario en la célulacromafín bovina, mientras que su presencia esmucho menos patente en las otras dos especies.

73


60-

50-

40 -

ion

de>o

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oí

30

20

10

• Bovinos• Gato• Rata

Tipo L Tipo N Tipo P

Fig. 1. Contribución relativa de los canales de los sub-tipos L, N y P en las corrientes globales a través decanales de Ca2* en células cromafines de rata, gato,y bovinos. Para más detalles véanse referencias 23,24, 42 y 44.

Es plausible pensar que estas drásticas diferen-cias podrían tener implicaciones fisiológicas encuanto a la contribución de cada subtipo de ca-nal tanto en la regulación del proceso secre-tor de catecolaminas como en otros procesosCa2- —dependientes en estas tres especiesanimales.

Consecuencias funcionales de la diversidadde canales de Ca2+

Con la creciente disponibilidad de toxinas es-pecíficas no sólo ha sido posible identificar y ca-racterizar la existencia de múltiples subtipos decanales de Ca2t en diferentes preparacionesneuronales, sino que también ha sido factiblela identificación de ios subtipos de caíales im-plicados en procesos de neuretransmisión a di-ferentes niveles del sistema nervioso central yperiférico, tema que se trata en el artículo pos-terior de A. G. García et al. Por otro lado, el de-sarrollo de nuevas técnicas de imagen ha per-mitido la identificación de zonas activas en lamembrana (definidas como hot spots) en lasque parece que tiene lugar la exocitosis de neu-rotransmisores, junto a otras zonas silentes enlas que no se produce este proceso de exocito-sis. Es plausible que estas zonas activas esténcolocalizadas junto a un determinado subtipode canal de Ca2+ que controlaría el proceso se-cretor. Estos canales de Ca2+ permitirían el rá-pido acceso del Ca2+ desde el exterior celular,

generando un incremento en las concentracio-nes citosólicas de calcio libre en zonas próximasa la membrana en las que acontece la exoci-tosis46.

Resumen

Mediante la combinación de técnicas electro-fisiológicas y herramientas farmacológicas (fár-macos dihidropiridínicos y toxinas selectivas), seha descrito la presencia de al menos cinco sub-tipos de canales de Ca2+ dependientes de vol-taje (denominados T, L, N, P y Q) en diferentestipos neuronales. Ante esta creciente diversidad,cabe plantearse cuál es la función de cada unode estos subtipos y/o qué subtipo de canal re-gula la liberación de un determinado neurotrans-misor er las sinapsis centrales y periféricas. Endiferentes sinapsis se ha postulado que son loscanales N- y/o los Q- los que controlarían latransmisión sináptica. Estas preguntas surgentambién en relación con células secretoras encuya membrana se encuentran diferentes sub-tipos de canales de Ca2+, como es el caso delas células cromafines adrenomedulares.

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DISCUSIÓN

C. GONZÁLEZ: ¿Existe alguna relación entre eltipo de canal que expresan las distintas espe-cies y la proporción de las diversas catecola-minas que secretan?

L. GANDÍA: En los últimos años hemos logradocultivar separadamente las células que pro-ducen adrenalina y noradrenalina, pero no he-mos conseguido todavía identificar la propor-ción de canales existente en cada una de ellas.

C. GONZÁLEZ: Y a falta de datos, ¿cuál es su opi-nión al respecto?

L. GANDÍA: Parece ser que la presencia de undeterminado subtipo de canal controla la se-creción, pero insisto en que no disponemosde datos experimentales sobre la secreción di-ferencial.

V. CEÑA: A mí me llama la atención el escasoporcentaje de bloqueo inducido por dihidro-piridinas en corrientes bovinas. He observa-do que en la secuencia de bloqueadores siem-pre han aplicado furnidipino como últimofármaco. ¿Qué ocurre si invierten el orden yen lugar de comenzar por u-conotoxina GVIAcomienzan por una dihidropiridina? Lo digoporque tanto en nuestro grupo como en otroshemos comprobado que con dihidropiridinasse puede observar un bloqueo de la corrientedependiente de las dosis que puede llegarhasta el 50%.

L. GANDÍA: También hemos hecho este tipo deexperimentos pero, en estas gráficas, furnidi-pino siempre se empleaba generalmente al fi-nal, precisamente por su carácter reversible,después de los bloqueos irreversibles. Admi-nistrándolo al principio observamos en el me-

jor de los casos un 25,30% de bloqueo de lascorrientes sin ningún tratamiento previo.

A.G. GARCÍA: ¿Cuánto tiempo de cultivo teníanlas células que emplearon para estudiar el blo-queo con dihidropiridinas?

V. CEÑA: Las células tenían entre 36 y 60 h.Querría además comentar que intentamos ob-tener los registros en condiciones lo más pa-recidas posible a las fisiológicas; partimos deun potencial de fijación de -55 mV que es elpotencial de membrana de la célula que no-sotros medimos, e intentamos realizar el ex-perimento administrando pulsos despolarizan-tes. En estas condiciones hemos logradobloquear el 100% de la corriente simplementecombinando una dihidropiridina, nifedipino, yu-agatoxina IVA. Esto enlaza con la cuestiónmás general de que las diferencias entre lasclasificaciones de los distintos tipos de cana-les de calcio en los diferentes tejidos puedentener mucho que ver con las condiciones deregistro, en otras palabras, la apertura y cie-rre de los canales de calcio es obviamentevoltajedependiente, y existen una serie de pro-cesos como pueden ser fosforilaciones intra-celulares capaces de condicionar el estado deactivación y la contribución de esos canalesa las corrientes. Además, tengo algunas du-das sobre la selectividad y especificidad de es-tos fármacos o toxinas en el sentido que de-pendiendo de la concentración puedenprobablemente afectar a más de un tipo decanal.

L. GANDÍA: En relación con la pregunta del Dr.García sobre la edad de los cultivos estamos

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observando últimamente que a medida queaumenta el tiempo de cultivo, podría estarcambiando la proporción de canales a favorde un incremento de canales N. Por otro lado,en nuestro grupo utilizamos un potencial defijación de membrana de -80 mV, que quizáno sea el fisiológico, pero otro factor a consi-derar al evaluar el efecto de las dihidropiridl-nas es su voltajedependencia; de hecho, enlos estudios en rata, al existir un componenteL mayoritario, es donde hemos podido estu-diar la voltajedependencia de fumidipino, ob-servando diferencias de bloqueo del 40 a casiel 70% cambiando de -80 a -60 mV.

V. CEÑA: Un simple comentario sobre la uniónvoltajedependiente de las dlhidropiridinas. Ob-vlamente las dihldropirldinas se unen a su re-ceptor de forma voltajedependiente. De he-cho, es posible bloquear el 100% de lasecreción de catecolaminas con una dihldro-piridina simplemente despolarizando ligera-mente las células. Un potencial de -55 esequivalente al potencial de reposo de estas cé-lulas, y cuando las células son estimuladas porun potencial de acción o por un agonista coli-nérgico parten de -55 mV y en estas condi-ciones el rango de activación de las corrien-tes se eleva a partir de -55 mV.

L GANDÍA: En este sentido creo que conviene es-tablecer una diferenciación entre la funciona-lidad de un canal y la presencia de un canal.Si realizamos esta serie de experimentos queusted ha comentado, a -55 mV la conclusiónprobablemente será que el canal N no estápresente en la célula cromafín bovina cuan-do efectivamente sí lo está. Otra cosa es queal potencial de reposo de la célula el canal Nsea funcional o no sea funcional o participe.

B. SORIA: Quisiera saber cuántos tipos de cana-les de calcio hay.

L. GANDÍA: Nosotros también. En estos momen-tos los canales que se han descrito reciente-mente, 0, P y Q, empiezan a ser controverti-dos, y la tendencia es más que hablar desubtipos de canales independientes, hablar deuna familia de canales. Lo que sí está claraes que hay un canal de bajo umbral y unoscanales de alto umbral e incluso dentro delalto umbral se tiende ya a hablar de canalesL y canales no L.

B. SORIA: ¿Hay algún soporte molecular que efec-tivamente nos permita hablar de 2-3 grupos?

L. GANDÍA: La complejidad funcional de los ca-nales de calcio puede complicarse todavíamás desde el punto de vista de su biología mo-lecular. El canal de calcio consta de varias sub-unidades y, por ejemplo, se han identificadohasta 6 subunidades alfa-1 que se han deno-minado A, B, C, D, E y S, con lo cual ya tene-mos 6 subtipos de canales de alto umbral, sia esto le sumamos la posible complejidad deotras subunidades, podemos establecer unaclasificación muy amplia de los canales decalcio.

F. SALA: Usted ha empezado hablando de cua-tro criterios de clasificación: farmacología, ac-tivación, inactivación y conductancia, y se hainclinado por la farmacología como el más útil.Sin embargo, creo que el uso exclusivo de estecriterio conduce a conclusiones confusas, yaque si, como parece ser el caso, los canalessensibles a una toxina presentan varias con-ductancias, se plantean dudas acerca de laespecificidad de dicha toxina.

L. GANDÍA: ES posible, pero lo cierto es que elcriterio imperante en la actualidad es la ca-racterización farmacológica.

J. MARSAL: Quisiera introducir un elemento másde complicación en el sistema, y es que aveces sabemos que hay un tipo de canal quees funcional, pero en cambio no hace la fun-ción que esperamos de él, es decir, activarla secreción del neurotransmisor, y este esuno de los casos que hemos descrito en losque hay canales N, y estos canales son fun-cionales, pero en cambio la w-conotoxina GVIAes incapaz de inhibir la secreción de acetil-colina en esta preparación. Es decir, que qui-zás hay un efecto ligado a la ubicación deestos canales cerca de los lugares de secre-ción o bien a otro sistema que desconoz-co.

C. MONTIEL: Quisiera hacerle una pregunta enrelación con el bloqueo de las corrientes debario con distintas toxinas: ¿por qué utiliza1 /¿mol de w-conotoxina GVIA?

L. GANDÍA: En la mayoría de los trabajos conco-conotoxina GVIA se utiliza una concentra-ción de 1 /¿mol. Aparte puede haber tambiénun criterio económico.

C. MONTIEL: Sin embargo, otros autores han uti-lizado concentraciones de esta toxina del or-den de 5 /¿mol para asegurar un bloqueo com-pleto de los canales de Ca2+ tipo N.

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Canales de calcio sensibles a segundos mensajerosJ. García-Sancho

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Fisiología. Facultad de Medicina. Universidad de Valladolid.

Homeostasis del calcio citosólico.Depósitos intracelulares de calcio

La concentración citosólica de calcio ([Ca2+]¡)se mantiene a un nivel muy bajo (10-7M),aproximadamente cuatro órdenes de magnitudpor debajo de la concentración de Ca2+ extra-celular. Ciertas organelas intracelulares, que lla-maremos genéricamente depósitos intracelula-res de calcio (DIC), son capaces de acumularCa2+ en su interior hasta alcanzar concentra-ciones similares a las del medio extraceiular. Lahomeostasis del Ca2+ se logra regulando losflujos entre estos tres compartimientos, citosol,medio extraceiular y DIC (fig. 1). El Ca2+ escontinuamente bombeado desde el citosol ha-cia los otros compartimientos por ATPasas pre-sentes en la membrana plasmática y en las en-domembranas de los DIC con gasto de energíametabólica. En estas membranas existen tam-bién canales que dejan fluir Ca2+ en sentido in-verso, siguiendo su gradiente de concentración.Durante el reposo los canales están cerrados,las ATPasas predominan y la [Ca2+]¡ es baja.Durante la actividad los canales (bien en lamembrana plasmática o bien en los DIC) seabren y el Ca2- entra en el citosol, elevándose[Ca2+], y originándose una respuesta fisiológi-ca. El control de [Ca2+]¡ se lleva a cabo regu-lando la actividad de los canales Ca2+. La va-riedad de canales de Ca2+ descritos es casiinfinita. Esta revisión se centrará en los que sonregulados por segundos mensajeros y, dentro deesta categoría, en aquellos que son comunespara un gran número de tipos celulares.

En muchos tipos celulares la interacción deun agonista con un receptor específico de lamembrana plasmática da lugar a la génesis deun segundo mensajero que provoca una eleva-ción de la [Ca2+]¡, generalmente debida a la li-beración de Ca2+ desde los DIC por aperturade canales presentes en las endomembranas.La idea dominante es que estos DIC son sensi-bles a segundos mensajeros con porciones mo-dificadas del retículo endoplásmico, aunque sunaturaleza exacta y su tocalización puede variarde unas células a otras13, Las mitocondrias son

también capaces de almacenar y liberar calcio,pero parecen operar a [Ca2+]¡ muy por encimade los valores de reposo. Pueden, por tanto, coo-perar amortiguando elevaciones transitorias de[Ca2t] generadas por otros mecanismos o al-macenar calcio en condiciones de sobrecarga,pero no se cree que desempeñen un papel prin-cipal en el control de [Ca2t]¡.

En condiciones de reposo los canales estáncerrados y las bombas predominan, lo que con-duce a la generación de un gradiente de Ca2+

dirigido desde los DIC hacia el citosol (fig. 2).

[Ca2+] (M)

10-3-,

10 - 4 -

1 O 5 -

1 O 6 -

1 O 7 -

1 O 8 -

M. extraceiular Depósitos

Citoso!

V Y

Fig. 1 Regulación de la concentración de Ca2* cito-sólico. Se representa el compartimiento citosólico se-parado del medio extraceiular y de los depósitos in-tracelulares de calcio por las correspondientesmembranas. Las bombas (A y B) transportan el Ca2*contragradiente de concentración desde el citosol ha-cia los otros compartimientos. Los canales (a y b, lí-neas de puntos) dejan entrar el Ca2* en el citosol di-sipando el gradiente de concentración. En lasordenadas, concentración de Ca2* (M) en escala lo-garítmica. El tamaño de los depósitos es mucho me-nor que el del compartimiento extraceiular. Si se abresolamente el canal «b» los depósitos se vacían haciael citoplasma, donde aumentará la concentración deCa2* transitoriamente, ya que la bomba «A» transpor-ta rápidamente el Ca2* hada el medio extraceiularLa apertura del canal «a» ocasiona, por el contrario,un aumento mantenido de la [Ca2T]¡, ya que el com-partimiento extraceiular es de mucho mayor tamañoque el extraceiular.

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Fig. 2. Vaciamiento yllenado de los depósi-tos intracelulares decalcio (DIC). VOCC: ca-nales de Ca2* voltaje-dependientes; CCE:entrada de Ca2* capa-citativa; A: agonista; R:receptor; PLC: fosfoli-pasa Q acoplada al re-ceptor a través de unaproteína G. A la izquier-da se representan tresmecanismos de controldel vaciamiento de losDIC (canales):1) liberación de Ca2'inducida por Ca21

(CICR); 2) ADP-ribosacíclica (cADPR), y3) inositol trisfosfato(TP3). La Ca2*-ATPasa,a la derecha (bomba)bombea el Ca2* desdeel citosol a los depósi-tos. QCa representa

calcio ligado a las proteínas fijadoras de Ca2' dentro de los depósitos. S es un sensor localizado en la membra-na de los DIC, que es inhibido por Ca2*. Cuando los DIC se vacían S es desinhibido y produce un mensajerocapaz de activar CCE.

c

JI I ^̂ H

r1

PIP,

Ca2 +

•1

cADPR\ 2

\ ^

g vocc|

i

t ¡I

V

A ^

•o

QCa

DIC

©

(

//

Ca2*

CCEH

1

\ ?

h

/T Bomba

/

El tamponamiento por proteínas fijadoras deCa2t presentes dentro de los DIC (QCa en lafig. 2) permite el almacenamiento de grandescantidades de Ca2+ con un aumento relativa-mente modesto de [Ca2+]. Cuando los canalesse abren, el Ca21 es liberado al citosol y la[Ca2+]¡ aumenta. Este aumento de [Ca2t] estransitorio, ya que la cantidad de Ca2+ almace-nada en los depósitos es limitada y el Ca2' li-berado al citosol es rápidamente bombeado almedio extracelular por la ATPasa de la membra-na plasmática (fig. 1). En muchas células el va-ciamiento de los depósitos intracelulares es de-tectado por un sensor (S en la fig. 2) que escapaz de abrir, por un mecanismo desconoci-do, canales de Ca?+ de la membrana plasmá-tica. Esto causa entrada en Ca?+ desde el me-dio extracelular (entrada capacitativa de Ca2+

[CCE])\ lo que mantiene la [Ca21], elevadamientras los DIC están vacíos. Una vez que loscanales de los DIC se cierran, el Ca21 se bom-bea desde el citosol hacia los DIC, y, cuando es-tos se han rellenado, la CCE cesa y la [Ca21]desciende a los valores de reposo (fig. 2). Asípues, la interacción de un agonista con un re-ceptor de membrana provoca generalmente unaumento bifásico de [CaZ l ] ¡ compuesto de

un aumento rápido y transitorio por liberaciónde Ca2t desde los DIC y una elevación mante-nida debida a la entrada desde el medio extra-celular a través de la vía capacitativa5. Inclusoen la situación de reposo el escape de Ca2+

desde los DIC hacia el citosol es relativamenterápido, ya que inhibidores selectivos de la AT-Pasa de los DIC, como la tapsigargina6 o el áci-do ciclopiazónico7 causan el vaciamiento com-pleto de los DIC en pocos minutos.

Liberación de calcio de los depósitosintracelulares

Se conocen dos familias de canales de Ca2t

de los DIC, los receptores de ryanodina (RyRs)y los receptores de inositol-trisfosfato (IP3Rs).Ambos tipos de canales, que pueden coexistiren una misma célula, tienen una gran homolo-gía de secuencia, y podrían derivar de una pro-teína ancestral común, pero el mensajero quecontrola su activación es distinto1.

Los receptores de ryanodina38"11 se llamanasí porque son capaces de ligar con alta afini-dad este alcaloide. La unión de ryanodina al RyRestabiliza un subestado parcialmente abiertodel canal, que conduce al vaciamiento de este

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CANALES DE CALCIO SENSIBLES A SEGUNDOS MENSAJEROS

Fig. 3. Liberación deCa2* de los depósitosintracelulares. En los 3casos existe un recep-tor tetramérico de es-tructura muy similar enla membrana de losDIC. A: RyRl del retícu-lo sarcoplásmico (RS)del músculo esqueléti-co; forma un pie con elreceptor dihidropiridíni-co (DHPR) del túbulolque responde a ladespolarización de lamembrana (AV) y sufreun cambio de confor-mación que se transmi-te a la cabeza de RyRy abre el canal deCa2* del RS; B: libera-ción de Ca2* inducidapor Ca2* (CICR) en eimúsculo cardíaco yquizá en algunas neu-ronas; la apertura

de un canal de Ca2* voltajedependiente (VOCC) de la membrana plasmática en respuesta a AV deja entrar unapequeña cantidad de Ca2* que abre RyR2, liberándose Ca2* de los depósitos que amplifica la seña! inicial; C:IP3R, la interacción del agonista (A) con un receptor de la membrana da lugar a la generación de IP3 que al-canza los depósitos intracelulares movilizando el Ca2* que contienen. Tomada de Berridge MJ1.

Calsecuestrina

Calsecuestrina Calsecuestrinao calreticulina

TABLA IEXPRESIÓN DE LOS RECEPTORES DE RYAIMODINA

Tejido RyR1 RyR2 RyR3

Músculo esqueléticoCorazónCerebroHígadoEstómagoRiñon, pulmón,

bazo, duodeno,íleon

tipo de DIC. Se conocen tres tipos de RyRs (ta-bla I) I !. El RyRl es el canal de Ca2+ de los DICdel músculo esquelético (fig. 3A). En el múscu-lo esquelético la señal que libera el Ca2+ alma-cenado es la despolarlzación de la membranaplasmática. La despolarizacíón es detectada porun receptor dihidropiridínico (DHPR) presenteen la membrana de los túbulos T. El cambio con-formacional del DHPR se transmite físicamen-te al RyRl presente en la membrana del retícu-lo sarcoplásmico (RS) y da lugar a la aperturadel canal, la liberación de Ca2+ al sarcoplasmay la contracción muscular9'10.

En el músculo cardíaco el canal de Ca2- delos DIC es el RyR2 (fig. 3B) I 0 n . El canal asocia-do a RyR2 se abre por el aumento súbito de la[Ca2+] en su entorno Inmediato. En este caso,una pequeña cantidad de Ca2- que entra a tra-vés de canales de Ca2+ voltajedependientes(VOCC) presentes en la membrana plasmáticay activados por su despolarización dispara laapertura del canal asociado a RyR2 y la libera-ción de grandes cantidades de Ca2+ desde elRS. Este proceso se conoce como liberación decalcio activada por Ca2t (CICR)12-13. Muchas cé-lulas nerviosas poseen también RyR2 (ta-

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ADP-ribosa cíclica O

HO OH ADP-ribosa HO OH

Fig. 4. Síntesis y catabolismo de la ADP-ribosa cíclica.

bla I)11, y se ha propuesto que el CICR podríacontribuir a amplificar los aumentos de [Ca2+]¡originados por activación de los VOCC en las cé-lulas nerviosas14.

La cafeína estabiliza el estado abierto de loscanales asociados a los RyRs, facilitando así laactivación de las células que los poseen. Hayque tener en cuenta, sin embargo, que este roes el único efecto farmacológico de la cafeína.Este fármaco inhibe también las fosfodiestera-sas, elevando así los valores de nucleótidos cí-clicos, e interfiere con la activación de VOCC.El dantroleno bloquea la liberación de Ca2+ delos DIC asociados a RyRs, pero podría tener tam-bién otros efectos secundarios.

Recientemente se ha demostrado que RyR2está sujeto también a modulación por un men-sajero químico, la ADP-ribosa cíclica (cADPR)15.Este mensajero se produce a partir de NAD+

por acción de la enzima ADP-ribosllciclasa (fig.4), ampliamente distribuida en los tejidos de ma-míferos. La cADPR es capaz de activar los ca-nales asociados a RyR2 en parches de mem-brana de RS a [Ca2+] de reposo y de inducirliberación de 45Ca de vesículas de RS, pero node microsomas de cerebro16. Su mecanismode acción parece ser aumentar la sensibilidad

al Ca2+ del CICR. En las células B pancreáticascADPR también induce liberación de Ca2+ delos DIC y su síntesis es estimulada por el aumen-to de la concentración de glucosa, por lo quese ha propuesto que podría estar implicada enel control de la secreción de insulina17.

Se ha identificado un RyR3 que se expresa am-pliamente en muchos tipos celulares (tabla I)11.Su función es desconocida. Difiere de los otrosRyRs en que no es sensible a cafeína.

Los IP3Rs tienen una distribución casi univer-sal en las células animales-4. Se conoce unagran variedad de agonistas extraceluiares que soncapaces, interaccionando con receptores demembrana específicos, de activar una fosfolipa-sa C (PLC) específica de fosfatidil-inositol (tablaII). La PLC, actuando sobre el fosfatidil-inositol-bisfosfato produce inositol-trisfosfato (IP3) y dia-cilglicerol, un activador de la proteincinasa C. ElIP3 interacciona con los IP3Rs y produce libera-ción de Ca2+ de los DIC. La sensibilidad de losIP3Rs al IP3 puede variar dependiendo del sub-tipo de receptor (se conocen cinco variedades),grado de fosforilación, entorno lipídico, conteni-do de Ca2+ de los DIC y [Ca2t] en la vecindad.La heparina inhibe los IP3Rs, pero no se cono-cen inhibidores selectivos capaces de atrave-

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TABLA IIRECEPTORES LIGADOS A FOSfOLIPASA C ESPECÍFICA DE FOSFATIDIL-INOSITOL

Transducción por proteína G y PLC/31Acetilcolina, histamina, noradrenalina, serotoninavasopresina, bradicinina, sustancia P, bombesinaendotelina, neuromedina, TRH, GnRH, PTHOdorantesLuz

Transducción por receptores ligados a tirosincinasa y PLCyi

ATP, PAF, glutamato, angiotensina II,neuropéptido Y, trotnbina, colecistocinina,

Factores de crecimiento epidérmico (EGF)Antígenos (linfocitos T)

V derivado de plaquetas (PDGF)

sar la membrana celular. Se ha descrito la pre-sencia de otros ¡nositoles-fosfato y de las enzimasnecesarias para su metabolismo en las célulasanimales. Para algunos de ellos se han propues-to funciones de segundos mensajeros118.

Entrada capacitativa de Ca2+

Como se ha comentado anteriormente, lasseñales que resultan de la activación de la PLCson bifásicas5. Se ha propuesto que la fasetardía de entrada de Ca2t podría estar media-da también por IP3, por uno de sus derivados(IP4) o por la acción concertada de ambos*8.Sin embargo, la evidencia experimental paraesta hipótesis es contradictoria. Se ha demos-trado, por otro lado, que el vaciamiento de losDIC por maniobras que no aumentan la sínte-sis de i nositoles-fosfato (tapsigargina, ionófo-ros de Ca2+, incubación prolongada en mediosin Ca2+) activan la entrada plasmática deCa2- tanto o más que los agonistas naturales4.A partir de estas observaciones, se ha propues-to que el vaciamiento de los DIC daría origena la producción de un mensajero que activa-ría una vía de entrada de Ca2+ de la membra-na plasmática (CCE; fig. 2)4. Así pues, la ma-yor parte de la entrada de Ca2+ inducida porlos agonistas fisiológicos sería un tanto indirec-ta, secundaria al vaciamiento de los DIC queinducen19. Este complejo mecanismo asegu-ra que: 1) [Ca2+]¡ permanece elevada mien-tras el agonista está presente; 2) cuando el ago-nista desaparece, [Ca2+]¡ permanece elevadapor un tiempo hasta que se rellenan los depó-sitos intracelulares y se cierra la vía capacita-tiva. Se ha demostrado la existencia de CCEen un gran número de células4. La naturale-za del canal responsable de la entrada deCa2+ es desconocida. Recientemente se hademostrado en mastocitos y otros tipos celu-lares la existencia de una corriente de entra-

da de Ca2+ que se activa por vaciamiento delos DIC (ICRAC), que muy probablemente es re-sonsable de la CCE2022.

El mecanismo de activación de la CCE es des-conocido. Entre los candidatos propuestos figu-ran los ¡nositoles-fosfato118, el GMP cíclico23, unmetabolito producido por el citocromo P45024,o un factor de naturaleza desconocida que secoliberaría y se coacumularía con el Ca2+ enlos DIC {Caícium influx factor [CIF])25. No exis-ten, por el momento bloqueadores selectivos dela CCE. Los inhibidores del citocromo P450, par-ticularmente los derivados imidazóllcos sustitui-dos en Nj, bloquean la CCE24'26, pero inhibentambién la entrada a través de canales de Ca2+

voltajedependientes27. La CCE puede modular-se negativamente por fosforilación28.

Rellenado de los depósitos intracelularesde Ca2"

Se propuso inicialmente que, tras la liberacióndel Ca2+, los DIC podrían rellenarse directa-mente utilizando Ca2+ extracelular a través dela vía capacitativa. Sin embargo, se ha demos-trado posteriormente que el rellenado de los DICsucede por bombeo del Ca2+ desde el citosol,una vez que los canales de Ca2* de los DIC secierran429. Los tiempos medidos para el semi-rellenado de los depósitos oscilan entre 4s paralos timocitos a 30-60 s para neutrófilos y célu-las leucémicas-9'3031. Ya que la velocidad debombeo de Ca2+ aumenta exponencialmentecon su concentración, la [Ca2t]¡ debe ser undeterminante importante de la velocidad de re-llenado de los depósitos. La entrada de Ca2+ através de la membrana plasmática es esencialpara mantener [Ca2*]¡ elevada y, así, permitirun rellenado adecuado de los depósitos. Estoes garantizado por la CCE, que se mantiene ac-tivada mientras los depósitos están vacíos y secierra una vez que se han llenado19. Cuando se

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bloquea CCE el rellenado de los depósitos esmuy lento ya que, al bombearse el Ca2h citosó-lico a los DIC, disminuye la [Ca2-]¡ y la ATPasade los DIC deja de bombear. Cuando la [Ca2+]¡se mantiene elevada por otros motivos (p. ej.,por activación de otros canales de la membra-na plasmática) y los canales de los DIC estáncerrados, los DIC (y quizás otros orgánulos in-tracelulares como las mitocondrias) se sobrecar-gan con Ca2 ' .

Conclusión

La activación celular por agonistas conlleva unaumento de la [Ca2+] bifásico, con un compo-nente rápido y transitorio, debido a liberaciónde Ca2" de los depósitos intracelulares (DIC), yotro más tardío y mantenido, debido a entradade Ca21 desde el medio extracelular. En amboscasos, el mecanismo incluye la apertura de ca-nales selectivos presentes en la correspondien-te membrana. Existen dos tipos de canales enla membrana de los DIC, los receptores deinositol-trisfosfato y los receptores de ryanodina.Estos últimos se activan por cambios del poten-cial de membrana o de la [Ca2+] en su entor-no, pero son también regulados por un mensa-jero qufmico, la ADP-ribosa cíclica. La entradatardía de Ca2+ se debe a la apertura de un ca-nal de la membrana plasmática, que es activa-do por un mediador desconocido que se pro-duce en los DIC cuando estos se depletan deCa2-. La existencia de esta vía de entrada ca-pacitativa de Ca2+ asegura la prolongación enel tiempo de la señal de Ca2+ inducida por elagonista y un rellenado adecuado de Ca2t unavez que la acción del agonista cesa.

Agradecimiento

Algunas de las investigaciones recogidas eneste artículo fueron financiadas por la DGICYT(Proyecto PB92-0268).

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DISCUSIÓN

B. SORIA; ¿Cuántos tipos de ICRAC hay, y qué re-lación de permeabilidad existe entre calcio ysodio?

J. GARCÍA-SANCHO; lCRac-Ch viene de Calcium re-léase actlvated calcium channel. Este canal esselectivo para el calcio, y prácticamente notransporta sodio ni bario. La opinión actual esque el ICRAC es el implicado en esta entradacapacitativa de la que hemos hablado.

F. BARROS: Usted se ha ceñido mucho a célu-las no excitables, pero en células excitableshay otras posibilidades, ¿qué relación podríahaber en células excitables entre señal de de-pósitos durante la segunda fase de entrada decalcio frente a un mecanismo indirecto de ac-tivación, por ejemplo, de actividad eléctricapor vía canales de potasio o por vía otros me-canismos, que no sea precisamente un me-canismo de mensajero intracelular procedentede depósitos?

J. GARCÍA-SANCHO: En algunas células excitables,por ejemplo, en células cromafines, se ha des-crito este tipo de mecanismos que se activanal vaciar los depósitos. Es más difícil de eva-luar porque en este caso existe el ruido de fon-do de los canales voltajedependientes. Quizála suma de mecanismos sea más efectiva paraprovocar secreción en el sentido de que lospicos deben ser más marcados pero realmen-

te se dispone de muy pocos datos en célulasexcitables.

F. BARROS: ¿Se podría realmente eliminar de al-guna manera la necesidad de esta entrada decalcio externo y conseguir que el mensajerointracelular funcionara de manera totalmen-te independiente en células excitables?

J. GARCÍA-SANCHO: Si usted elimina el calcio ex-terior no puede tener lugar entrada de calcio.Se sabe que en muchas células la liberaciónse produce sin calcio externo.

F. BARROS: SÍ, pero no se mantiene. A largo pla-zo no tenemos ninguna evidencia de que laliberación de depósitos pueda seguir funcio-nando, sin entrada de calcio externo.

C. MONTIEL: Se sabe que existe un receptor deryanodina 2 cardíaco que se activa por el cal-cio que entra por canales de Ca2f tipo L aco-plados directamente con este receptor. Sinembargo, usted se ha referido a un segundomensajero, la ADP-ribosa cíclica. ¿Funciona-ría de forma coordinada el calcio que entracon este segundo mensajero?, ¿en qué por-centaje participaría cada uno de estos dos sis-temas?

J. GARCÍA-SANCHO: Esto es especulativo, ya quenadie ha medido ambos sistemas de forma si-multánea. Ahora bien, la complejidad no ter-mina aquí. En células nerviosas, por ejemplo,

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hay quien piensa que los mecanismos de li-beración a través del receptor de rianodina2 son importantes, pero no se descarta la po-sibilidad de un mensajero químico que estécambiando el umbral o el set point Ce todoel sistema. Los factores que controlan las en-zimas que sintetizan la ADP-ribosa cíclica sontodavía mal conocidos. Existe además un ter-cer receptor de ryanodina de distribución uni-versal que es insensible a la cafeína y cuya fun-ción se desconoce.

J. TAMARGO: ¿Cuál sería, en términos generales,según su experiencia, el agonista que pone enmarcha más fácilmente el mecanismo de va-c'amiento de los depósitos?

J. GARCÍA-SANCHO: En cada caso concreto habráque emplear el que sea más potente y se de-sensibílice menos; puede ser también que unode ellos se desensibilice y al cabo de pocossegundos se estén rellenando otra vez los de-pósitos. Es difícil concretar más ya que depen-de de la preparación utilizada.

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Relación estructura química-actividadfarmacológica de los moduladores de los canales

de calcioC. Sunkel, M. Fau de Casa-Juana, L. Santos, M.M. Gómez, J. Priego,

M.R Ortega y A. García*Departamento de Investigación. ALTER S.A Madrid y 'Departamento de Farmacología. Facultad de Medicina.

Universidad Autónoma. Madrid.

Introducción

La modulación farmacológica de la actividadde los canales lentos de calcio voltajedepend¡en-tes tuvo su origen en el hallazgo de Fleckens-tein1 al comprobar que el verapamllo disminuíala contractilidad cardíaca y que un exceso deCa2+ contrarrestaba dicho efecto, acuñando eltérmino de antagonista del Ca2+ para definir alos fármacos que eran capaces de impedir la en-trada de Caz+ a la célula a través de los cana-les Iónicos.

Desde entonces, las 4-aril-l,4-dih¡dropirldinas(1,4-DHP) se han convertido en el grupo más Im-portante de antagonistas del calcio. Estos com-puestos son potentes vasodilatadores arteriola-res con efectos relativamente insignificantes sobreel corazón2. Además, se ha descrito un nuevogrupo de 1,4-DHP que aumenta la entrada decalcio. Estos activadores de los canales de cal-do representan un nuevo grupo de compuestoscon potentes efectos vasoconstrictores y con ac-tividad cardíaca inotrópico-positlva3.

Nuestro grupo de trabajo ha estado Interesa-do en los últimos años en la modificación del ani-llo de 1,4-DHP a la búsqueda de nuevas activi-dades asociadas a este núcleo. Así, se hansintetizado 4-aril-l,4-DHP con potentes activida-des cardiovasculares y cerebrovasculares4, asícomo derivados con actividad vasoconstrictoray vasorrelajante5. Uno de ellos presenta Intere-santes propiedades sobre diversos parámetroscardiovasculares actuando como agonista delcalcio56.

Por otra parte, hemos modificado la estructu-ra de 1,4-DHP sustituyendo el resto aromáticode la posición 4 por un resto alquilo. Así, se hanconseguido nuevas series de compuestos quepresentan una interesante actividad antitrombó-tica7 y antagonista del factor de activación pla-quetaria (PAF)8.

4-aril-l,4-dihidropiridinascomo calciomoduladores

Nuestro primer objetivo de búsqueda de unanueva 4-aril-l,4-DHP se dirigió hada la síntesisde una estructura «clásica» del tipo de nlfedipi-no, es decir, que reuniera los requisitos estruc-turales de un antagonista del calcio. Estos re-quisitos fueron ¡nicialmente definidos por Loev9

y son, básicamente, los siguientes:

La actividad aumenta con la sustitución en laposición 4 del anillo en la secuencia H < Me<ci -cloalquilo <heterociclo< fenilo <fenllo susti-tuido.

La sustitución en el átomo de N, así como laoxidación del anillo, provoca la pérdida casi to-tal de la actividad.

Los grupos esteres en las posiciones 3 y 5 delanillo son los óptimos para la actividad.

De esta manera llegamos a la síntesis de uncompuesto denominado «fumidipino»10, cuyaestructura está recogida en la figura 1.

Este compuesto tiene la particularidad estruc-tural de presentar dos centros quirales, señala-dos en la fórmula (con asteriscos), con lo cualexisten 4 isómeros ópticos.

La obtención a escala industrial de este com-puesto produce un racemato RR/SS con unariqueza superior al 99%. La síntesis de los cua-tro diastereoisómeros11 ha permitido llevar acabo los ensayos del desplazamiento de la uniónde 3H-isradipino en íleon de cobaya de cadauno de ellos, siendo el orden de afinidad el si-guiente: SS>SR>RR>RS 1 2 . De estos datosde desprende que los estereoisómeros más ac-tivos son aquellos que presentan la configura-ción S para el C4 de! anillo de DHP, dato queconcuerda con lo publicado en la literatura so-bre 1,4-DH P, en la que se observa que los enan-tiómeros S son más activos que los R13.

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FARMACOLOGÍA DE LOS CANALES IOVCOS

Fig. 1. Furnidipino; 'centros quirales. Fig. 2. PCA-50938.

El furnidipino es 10 veces más potente queel niíedipino relajando la aorta de rata y 358 ve-ces más potente en la arteria coronaria de cer-do despolarizada con potasio. El productoaumentó el flujo coronario a dosis inferiores alas del nifedipino y la duración de acción fuemás prolongada.

Fue significativamente más activo en venasmesentéricas de pequeño diámetro que en lascorrespondientes arterias mesentéricas, mien-tras que el nifedipino no demostró ningún efec-to diferencial. Los resultados en diversos vasosdemostraron una alta selectividad del furnidipi-no por los lechos vasculares.

Los estudios hemodinámicos demostraronque el furnidipino reduce la forma dosisdepen-diente, tanto la poscarga como la presión tele-diastólica del ventrículo izquierdo y la precarga,aumentando de esa forma el gasto cardíaco. Enpacientes con angina estable, su administraciónintravenosa ha demostrado una buena toleran-cia, ausencia de inotropía negativa apreciable,reducción del trabajo del corazón a' disminuirla resistencia periférica y el retorno venoso,aumento del índice cardíaco al incrementar eltrabajo del ventrículo izquierdo, sin influencia enla frecuencia cardíaca que sólo aumenta, juntocon la mayor disminución de las presiones sis-tólica y diastólica, a las dosis más altas.

En contraste con otros antagonistas del cal-cio como el verapamilo, el diltiazem y el bepri-dilo, el furnidipino no afecta la conducción auri-culoventriculary, por tanto, puede ser prescritoa pacientes en los que aquellos fármacos estáncontraindicados.

La ausencia de actividad inotrópica negativay la no afectación de la conducción del noduloauriculoventricular y de la frecuencia cardíacapermiten el uso conjunto del furnidipino con blo-queadores beta.

En modelos animales de isquemia inducidapor ligadura de arteria coronaria, el fjrnidipino

previno completamente la mortalidad y la fibri-lación ventricular tras situaciones de isquemia-reperfusión. En un modelo de infarto de miocar-dio inducido por isoproterenol, disminuyó lamortalidad y redujo sustancialmente el área deinfarto.

El furnidipino mostró una buena tolerancia yun buen perfil farmacológico de seguridad, asícomo muy baja toxicidad a largo plazo. Poseeun margen de segundad superior a los repre-sentantes de la segunda generación de antago-nistas del Ca21.

El furnidipino posee las características de unfármaco de elección en la prevención y el trata-miento de diferentes situaciones clínicas asocia-das a lesión miocárdica tales como angina deesfuerzo estable, angina inestable, angioplastiacoronaria, Infarto agudo de miocardio con reper-fusión tras trombólisis, cirugía cardíaca y tras-plante cardíaco.

El campo en el que el furnidipino pudiera con-vertirse en el primer agente terapéutico realmen-te nuevo y original es el de la protección de lamuerte súbita cardíaca.

Basándonos en experiencias previas, decidi-mos introducir el resto de l,2-benzisotíazol-3-ona-l,l-d¡óxido en la cadena lateral de una 1,4-DHP, conservando los demás patrones de sus-titución clásicos en el anillo. De esta forma seobtuvieron una serie de derivados, de entre loscuales destaca el compuesto cuya clave de la-boratorio es PCA-509385 (fig. 2).

El PCA-50938 posee una relación de selecti-vidad tisular vasos/corazón muy alta (686) encomparación con el nifedipino (39) e incluso elfelodipino (126). La selectividad también semuestra en vasos cerebrales cuando se compa-ra con arterias femorales o mesentéricas. Pormedio de la utilización de técnicas de radioli-gando se ha demostrado que posee una mayorafinidad en el cerebro que el nifedipino y el fe-lodipino.

RELACIÓN ESTRUCTURA QUÍMICA-ACTIVIDAD FARMACOLÓGICA DE LOS MODULADORES DE LOS CANALES DE CALCIO

a H

0

KH

JJH

I

- N 0 2

0

~"CH3

os

o/s

\ -/0

Fig. 3. PCA-50941. Fig. 4. PCA-50982.

Por otro lado, la instauración del efecto vaso-dilatador y la reversibilidad de su efecto son mu-cho más lentas que las de nifedipino.

El PCA-50938 posee actividad protectora fren-te a la isquemia cerebral. Este efecto ha sido de-mostrado en varios modelos experimentales deisquemia realizados en ratones, gerbos y cabraconsciente, donde el PCA-50938 aumentó el flu-jo sanguíneo cerebral y la supervivencia de losanimales en estudio, así como también dismi-nuyó el número de neuronas lesionadas por laanoxia.

Cabe destacar que este producto es sustan-cialmente menos potente como hipotensor queel nisoldipino y el felodipino en diversos mode-los de hipertensión en rata. En conjunto, ade-más, el aumento de la frecuencia cardíaca pro-ducido por el PCA-50938 es menor que elinducido por el felodipino y el nisoldipino.

Por otra parte, se observó, sorprendentemen-te, que uno de los compuestos de esta serie,cuya clave de laboratorio es PCA-50941 (fig. 3),presentaba efecto vasoconstrictor y aumentabala presión arterial5'6.

Desde el punto de vista estructural, hay quedestacar que este compuesto vasoconstrictor di-fiere de los agonistas del calcio descritos hastael momento. Puede observarse que nuestrocompuesto presenta dos restos esteres en lasposiciones 3 y 5 del anillo de 1,4-DHP. Uno deellos está unido al resto de benzisotiazolona através de un puente etilénico y el otro a un res-to de 2-metiltetrahidropirano. Ninguno de losagonistas descritos hasta ahora presenta estepatrón de sustitución, ya que en concreto el BayK 86443 incorpora un grupo nitro en la posi-ción 3 del anillo, el CGP 2839214 es una lacto-na y el YC 17015 es una amida. Por ello, estenuevo compuesto se suma al heterogéneo gru-po de agonistas del calcio.

Se han llevado a cabo cálculos teóricos16 ycomparaciones entre estructuras cristalinas de

algunos agonistas y antagonistas, y se ha pos-tulado una hipótesis que explica las diferenciasconformacionales entre estos, en función del en-lace de hidrógeno que forma en 1-NH y la orien-tación de los grupos esteres.

El PCA-50941 aumenta las contracciones deaorta de conejo inducidas por adición de Ca2+

en presencia de 10mM de K+ con la mismapotencia que el Bay K 86445. Sus efectos va-soconstrictores coronarios, muy débiles o inclusoinexistentes, contrastan, por el contrario, con elpotente efecto constrictor de coronarla que pre-senta el Bay K 86446. El producto muestra unapronunciada selectividad vascular frente a la car-díaca, mientras el Bay K 8644 posee ambas ac-ciones vasoconstrictoras e inotropopositivas demodo acusado. En este sentido, el PCA-50941presenta ligeros efectos inotrópicos positivos enaurícula aislada de cobaya y efecto ¡notropone-gativo en el corazón perfundido de rata.

Además, este compuesto mostró un perfil bi-fásico de vasoconstricción y varorrelajación, enaorta de conejo, mientras que el Bay K 8644fue un agente vasoconstrictor puro.

Ambos compuestos, en corazón aislado derata, disminuyeron el flujo coronario. En el casodel Bay K 8644, al causar un marcado aumen-to de la fuerza contráctil, el gasto cardíacoaumenta. Por el contrario, el PCA-50941 causauna disminución de la fuerza contráctil que con-duce a un gasto cardíaco disminuido.

Los estudios hemodinámicos in vivo actual-mente en curso confirman la potencial aplica-ción de este compuesto en situaciones clínicastales como estados de shock, hipotensión idio-pática crónica, migraña vascular, etc. Su selecti-vidad tisular y su prolongada duración de acciónotorgan al PCA-50941 un perfil cardiovascularmás favorable que otros agonistas del calcio 1,4-dihidropiridínicos.

El último compuesto de tipo l,4-aril-l,4-DHPdesarrollado ha sido el PCA-5098217 (fig. 4).

89

FARMACOLOGÍA DE LOS CANALES ICNICOS

H,C-"

1

0

iH CH30

\ / I I

V N JL1 3

H

o /No

5. Trombodipino.

Este compuesto posee la característica de que,además de incorporar un resto de benziso:ia-zolona en el éster en C3, posee una agrupaciónde l,3-di-(N-morfol¡no) isopropilo. Esta modifi-cación ha permitido obtener derivados dihidro-piridínicos solubles en agua, mediante la forma-ción de sus sales correspondientes, de formasimilar a lo que sucede con el amlodipino.

La velocidad de instauración del efecto rela-jante del PCA-50982, en tiras helicoidades deaorta de conejo contraída con potasio, fue máslenta que la del amlodipino. La actividad des-plazante del PCA-50982 de [3H] isradipino eníleon de cobaya va aumentando linealmente conel tiempo de incubación. La cinética de instau-ración del efecto hipotensor de este compues-to resultó muy diferente de la del nifedipino.Mientras este último tiene un efecto tempranoacusado, el PCA-50982 disminuye la presión ar-terial y la frecuencia cardíaca de forma lenta ypaulatina, alcanzándose el efecto máximo trasuna hora de administración del compuesto. Enratas espontáneamente hipertensas y conscien-tes no se aprecia aumento de la frecuencia car-díaca y el efecto hipotensor del PCA-50982 durómás de 18-20 h.

El PCA-50982 no produce aumento de la fre-cuencia cardíaca, e incluso presenta un ligeroefecto bradicardizante. La instauraciór de la hi-potensión lenta y gradual puede ser la princi-pal causa de la ausencia de taquicardia refleja.A este efecto coadyuva otro adicional vasodila-tador mixto (arterial y venoso) similar al de losnitratos, con mejora de la función cardíaca.

Este producto presenta la ventaja sobre otrosde la misma familia de ser altamente soluble enagua, lo que lo hace especialmente indicadopara su uso en venoclisis en unidades de cui-dado intensivo y en accidentes cardiovascularesgraves y agudos que incluyen isquemia cerebral,coronaria y crisis hipertensivas y anginosas.

4-alqu¡l-l,4-dihidropiridinas con nuevaspropiedades farmacológicas

Vluchos grupos han descrito la actividad an-tiplaquetaria de 1,4-DHP usadas comúnmentecomo bloqueadores de los canales del calcio18.Sin embargo, la concentración usada en estaaplicación es de 2-3 órdenes de magnitud másaltas que la necesaria para alcanzar los efectossobre el sistema cardiovascular. Este hecho noscondujo a la idea de una nueva serie de 1,4-DHP con una mayor actividad antitrombótica ybásicamente libre de efectos cardiovasculares.Así, se suprimió el sustituyente aromático delanillo de DHP, que es esencial para la accióncomo bloqueadores de los canales de calcio-.De esta forma, hemos introducido una resto al-quilo, preferentemente metilo, en la posición4 del anillo de 1,4-DHP. Simultáneamente, he-mos unido un grupo de 2-benzisotiazolona-l,l-dióxido mediante un puente alquilénico al car-boxilato en C-37. De todos los compuestos sin-tetizados, fue seleccionado para su posterior de-sarrollo farmacológico y clínico el trombodipino,que aparece en la figura 5.

Este compuesto posee un perfil farmacológi-co muy diferente del de la aspirina y otros fár-macos con actividad antiplaquetaria. El trombo-dlpino posee un amplio espectro de actividadantiagregante, ya que es capaz de inhibir tantola agregación como la reacción de liberación delas plaquetas estimuladas con los diversos ago-nistas fisiológicos19. Este compuesto es sólo undébil inhibidor de la agregación plaquetaria in-ducida por trombina o ácido araquidónico.

Cuando se administra por vía oral o intraperi-toneal a dosis entre 0,1 y 10 mg/kg, el trombo-dipino ha demostrado poseer una potente acti-vidad antitrombótica.

La administración a ratones de dosis únicasde compuesto Indujo un alargamiento del tiem-po de hemorragia de forma dependiente de ladosis desde la primera hora de su administra-ción. Este efecto fue máximo a la dosis de10 mg/kg.

El trombodipino protegió a los animales de ex-perimentación de la muerte inducida por ago-nistas fisiológicos Individuales y asociados en-tre sí, en un modelo de trombosis inducida por2 agonistas que fue seleccionado por nuestrogrupo por el hecho de que, a menudo, los epi-sodios de trombosis son iniciados por más deun agonista16'2"1.

Esta protección del trombodipino frente a laformación del trombo in vivo está-relacionadacon su efecto sobre la activación de las plaque-

90

RELACIÓN ESTRUCTURA QUÍMICA-ACTIVIDAD FARMACOLÓGICA DE LOS MODULADORES DE LOS CANALES DE CALCIO

tas, ya que el compuesto no modifica la adhe-sividad plaquetaria, responsable de la formaciónde la primera monocapa de plaquetas sobre lalesión vascular, ni actúa sobre los procesos decoagulación y fibrinólisis22.

El mecanismo de acción del trombodlplno esmuy diferente del de los otros fármacos antipla-quetarlos utilizados en la actualidad. Este com-puesto no afecta a la producción de tromboxanoA2 como la aspirina23, ni modifica la unión de fi-brinógeno a su receptor en plaquetas, como en elcaso de ticlopidina24. Se ha demostrado quetrombodipino antagoniza selectivamente la entradade calcio en plaquetas a través de canales ope-rados por receptor, sin interferir con el mecanis-mo responsable de la movilización de calcio delos depósitos intracelulares25. Más recientemen-te, se ha sugerido que esta actividad del compues-to es específica para las plaquetas, ya que esteefecto no se manifiesta en otras células tales comoneutrófilos humanos o timocitos de rata26.

Cuando se administraron dosis únicas de has-ta 800 mg a voluntarios sanos, el trombodipinofue bien tolerado. Se apreció un alargamientosignificativo del tiempo de hemorragia que, sinembargo, permaneció dentro del intervalo de va-lores normales e inhibición de la agregación deplaquetas inducida por distintos agonistas27.

La administración de 200 mg/día de trombo-dipino durante 90 días a pacientes de enferme-dad arterosclerótica incipiente, moderada oavanzada, produjo una marcada inhibición dela agregación plaquetaria inducida por coláge-no, ADP y trombina, sin que se modificaran losparámetros de coagulación. Los resultados dela bioquímica de seguridad demostraron que elcompuesto es perfectamente tolerado y poseeun amplio margen de seguridad28.

El PAF es un mediador fosfolipídico implica-do en muchos procesos fisiológicos y patológi-cos, entre los que se pueden mencionar elasma, la anafilaxia, alteraciones cardiovascula-res y el shock séptico. El PAF actúa sobre lascélulas a través de receptores específicos en lamembrana celular.

Durante el cribado farmacológico de los com-puestos que presentaban un resto de tioéter uni-do a través de un puente etilénico al carboxila-to de la posición 3 del anillo de 1,4-DHP, seobservó que inhibían la agregación plaquetariainducida por PAF, pero no presentaban inhibi-ción a la agregación inducida por otros agonis-tas tales como ADP, colágeno, trombina y ácidoaraquldónico8.

De todos los compuestos obtenidos, se ha se-leccionado el tiapafant, que aparece en la figu-

Fig. 6. Tiapafant.

ra 6. Se trata de un derivado del núcleo de 1,4-dihidropiridina, carente de actividad sobre el sis-tema cardiovascular, que posee actividad anta-gonista del receptor del PAF8.

El análisis de los datos obtenidos en experi-mentos de unión al receptor del PAF en plaque-tas, neutrófilos y macrófagos alveolares de va-rias especies, incluyendo la humana, demostróque el tiapafant es un potente antagonista, es-pecífico y reversible de este receptor29.

Cuando se administra por vía intravenosa uoral , en dosis de 0,1 a 2 m g / k g (DE50 =0,45mg/kg), el tiapafant es capaz de antago-nizar el efecto hipotensor del PAF. En estos ex-perimentos también se observó una inhibicióndel aumento de permeabilidad vascular media-do por PAF30. Este efecto protector se mantu-vo cuando el tiapafant se administró a ratas querecibieron dosis letales y subletales de endoto-xina bacteriana por vía intravenosa31.

La administración a cobayas de tiapafant porvía intravenosa u oral bloquea de forma selecti-va la broncoconstricción inducida por PAF, asícomo la trombocitopenia y leucopenia acompa-ñantes. Además, este compuesto fue capaz debloquear los efectos de la inyección de antíge-no en pulmones de cobayas activamente sen-sibilizadas frente a dicho antígeno. Este efectono ha podido ser demostrado para ninguno delos antagonistas del PAF conocidos hasta elmomento32, por lo que se ha sugerido que eltiapafant posee características originales en estetipo de situaciones patológicas33.

Finalmente, se ha demostrado que el tiapa-fant es activo en una serie de modelos de infla-mación y shock dependientes de PAF, endoto-xina bacteriana, agregados de IgG y de IgE34.

Los estudios clínicos de fase I en los que sehan administrado de 10 a 640 mg de tiapafanta voluntarios sanos, han demostrado que el pro-ducto es bien tolerado y no posee efectosadversos35.

91


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RELACIÓN ESTRUCTURA QUlt/ICA-ACTIVIDAD FARMACOLÓGICA DE LOS MODULADORES DE LOS CANALES DE CALCIO

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DISCUSIÓN

A. ALBILLOS: ¿Cuál es el sitio de unión de la mo-lécula de dihidropiridina en el receptor?, ¿esel anillo piridina o depende de la conforma-ción que adopta la molécula?

C, SUNKEL: Uno de los radicales más importan-tes es el NH en la posición 1 del anillo. Sicambia la conformación va cambiando laorientación de ese grupo NH, y ello tiene im-plicaciones en la unión de la molécula al re-ceptor. Otra parte importante en la unión alreceptor son los grupos carboxilatos, quecomo puede apreciarse en un modelo mole-cular, pueden adoptar dos orientaciones quemodifican la conformación. Otro tipo de fija-ción son las uniones de tipo Van der Vaals, porejemplo, del grupo aromático.

A. ALBILLOS: ¿Qué ocurre, por ejemplo, con am-lodipino, que tiene un cloro en lugar de NO2?

C. SUNKEL: ES un cloro derivado.A. ALBILLOS: O sea, ¿que no tienen que haber

necesariamente grupos NO2 en la posición2 y 3?

C. SUNKEL: NO, por ejemplo, el amlodipino esun 2-cloro derivado, otros compuestos sinte-tizados en nuestro laboratorio, por ejemplo elPCA50938 es un 2-3 dicloro-derivado, y exis-ten también trifluometilderivados. El mejorsustituyente es un grupo que atraiga electro-nes, no que los ceda como, por ejemplo, ungrupo metilo. En este último caso no seríaun antagonista del calcio potente.

M. HURLÉ: ¿El agonista PCA-50941 tiene acciónbifásica como ocurre con algunos compues-tos que son agonistas o antagonistas según lasdosis?

A.G. GARCÍA: Creo que la mayoría de las dihidro-piridinas son una mezcla racémica de agonistay antagonista. De hecho, se ha descrito quenifedipino, a dosis subnanomolares posee cier-to efecto vasoconstrictor. En el caso de la mo-lécula sintetizada por el Dr. Sunkel et al, po-see la particularidad de que dependiendo delórgano se manifiesta más o menos el efectoagonista o antagonista.

C. MONTIEL: Cuando habla de las estructuras tri-dimensionales de las dihidropiridinas, ¿se re-fiere a la molécula en estado sólido, cristali-no?, ¿qué ocurre cuando está en solución?

C. SUNKEL: Siempre que hablamos de confor-mación nos referimos al estado sólido. En so-lución, y teniendo en cuenta que los enlacespueden rotar, la conformación va cambiandoconstantemente. El problema de la químicamédica para diseñar es que desconocemoslo que se llama conformación activa del com-puesto; no sabemos cómo es la conformaciónactiva en el momento que el compuesto seune al receptor y forma el complejo.

F. BARROS: Puesto que hay diferentes tipos deantagonistas orgánicos de canales de calcio¿existe alguna estructura general en los cana-les que actúe como un sitio de unión al Igualque podría ocurrir, por ejemplo, para las ben-zodiacepinas y ciertos receptores?

C. SUNKEL: No lo COnOZCO.A.G. GARCÍA: En cualquier caso, como reflexión

final, deberíamos considerar la enorme plas-ticidad de las moléculas dihidropiridínicas, queposeen una variedad de acciones farmacoló-gicas extraordinariamente amplia.

93


J. TAMARGO: Con respecto a los pockets para di-hidropiridinas quisiera comentar que, si exis-ten, deberían localizarse a nivel extracelular.Por otra parte, se supone que hay un pocketintracelular para el verapamilo y que hastahace poco pensábamos que era para el dil-tiazem. Los datos más recientes apuntan quelos derivados del diltiazem también tendríanun pocket extracelular.

J. LÚPEZ BARNEO: Usted ha comentado la dife-rencia de afinidad de los 4 esteroisómeros enel cerebro, pero había un grupo que tenía un

alto nive! de unión del furnidipino y otro grupoque se unía con menos afinidad, ¿ha obser-vado esa diferencia de los mismos esteroisó-meros en otros tejidos que no sean el cerebro?

C. SUNKEL: En cerebro y corazón. Se ha com-probado que la configuración que importapara la actividad de estos compuestos que tie-nen dos centros de simetría, es la configura-ción del carbono 4 del anillo de 1-4- de dihi-dropíridina. Y tanto en el corazón como en elcerebro siempre es la configuración S la quemuestra mayor afinidad por el receptor.

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La señal celular del caldo:implicaciones fisiológicas

y farmacoterápicasA.G. García, A. Albulos, L. Gandía, B. Lara, M.G. López y M. Villarroya

Departamento úe Farmacología y Terapéutica. Facultad de Medicina. Universidad Autónoma. Madrid.

Introducción

De la lectura de los anteriores artículos deGandía et al y García-Sancho se desprende laimportancia del catión calcio (Caí+) como men-sajero ubicuo que participa en múltiples proce-sos biorreguladores. Así pues, la elevación delas concentraciones citosólicas de Ca2T,[Ca2t]¡, tras la activación de canales de Ca2+

plasmalemaleso íntracelulares, constituye unaseñal celular que activa distintos procesos fisio-lógicos (íig. 1). El objetivo de este artículo es re-saltar el significado fisiológico de esa señal ce-lular y su relevancia para el desarrollo de nuevosfármacos calciomoduladores. Ilustraremos es-tas facetas con un ejemplo en el que poseemosexperiencia directa, la secreción de neurotrans-misores. Finalmente, haremos algunas conside-raciones sobre las posibilidades de desarrollarrjevos fármacos que modulen la actividad dedistintos subtipos de canales de Ca2+ neura-nales.

Gradientes de calcio y secreción

Para esclarecer la forma en que se mcdulantos fenómenos de neurosecreción por camoiostransitorios de la [Ca2+],, se han seguido dosestrategias fundamentales. Por una parte, se hademostrado que puede inducirse secreción decatecolaminas por [Ca2-]¡ relativamente bajas,en el orden de 1 ¡M, en células cromafines bo-vinas permeabilizadas1. Igualmente, la estimu-lación de células intactas produce cambios dela [Ca2+]¡ en torno al nM durante ¡a activacióndel proceso secretor2"1. Por otra parte, se hanhecho predicciones teóricas sobre los cambiosespaciotemporales de la [Ca2+]¡, que tendrían

lugar en microdominios citosólicos, en el sub-plasmalema en donde tiene lugar la exocitosis.Se ha calculado que durante la despolarizacióncelular, la [Ca2tl, puede incrementarse desdeel nivel basal de 0,1 ¡M hasta 10-100¡iM57. Es-tas concentraciones son considerablemente ma-yores que las que se detectan al medir los cam-bios globales promedio de la [Ca2+]¡ en unacélula cargada con fura-2.

Una explicación plausible para estas opinio-nes divergentes serta la propuesta de que des-de la óptica cuantitativa, la secreción produci-da a altas y bajas [Ca2-]¡ podría ser similar. Sinembargo, la velocidad inicial de la secreción seaceleraría de manera considerable por [Ca2+j¡elevadas8. De tener lugar sólo en ciertos micro-dominios celulares, estas concentraciones tanelevadas no podrían detectarse con las técnicasutilizadas para la medición promedio ce loscambios de ;Ca2-]¡ con fura-2, deoidc a subaja resolución espacie-temporal. Por tanto, esfactible que las células que producen una se-creción rápida en respuesta a estímulos fisioló-gicos, tipo neuronas9 célu as crcmafines10 o cé-Mas de la hipófisis anterior-1, puedan hacerloporque las [Ca2+]¡ que se alcanzan en domi-nios exocitóticos son sustancialmente más ele-vadas que las que se han utilizado en célulaspermeabilizadas.

Augustine y Neher12 estudiaron la Ca2--dependencia de la secreción en células croma-fines individuales, midiendo simultáneamente lacapacitancia eléctrica de la célula como índicede exocitosis, y la [Ca2+]¡ con fura-2. Encontra-ron que la diálisis intracelular de Ca2* con unapipeta de patch-clamp disparaba la secreción.La secreción se incrementó cuando las [Ca2+]¡

95


Como mensajero univesal, el calcio controlamúltiples funciones fisiológicas

Ca2+

Muerte ) í SecreciónV celular / \ de hormonas

\ - ^ Ca2

Contracción I Movimientomuscular J V celular

Ca2t " ^ ^ y Ca2

División ydiferenciación

celular

Plasticidadneuronal

Modulación Coagulaciónde la actividad/ V saneuínea

eléctrica /Ca2

neurotransmisores

Fig. 1. Multiplicidad de funciones biológicas controladas por señales desencadenadas por incrementos transito-rios de la concentración citosólica del catión Ca2*. En el vértice de la pirámide destaca la secreción de neuro-transmisores porque es la función fisiológica elegida para ilustrar la temática de este artículo.

eran mayores de 0,2 pM y se saturaba a con-centraciones mayores de 10 ¡iM. La secrecióntenía un coeficiente de H¡II para la [Ca2+]¡ de 2.La aplicación de pulsos despolarizantes brevesprodujo incrementos transitorios tanto de la[Ca2+] como de la secreción. La comparaciónde las velocidades de secreción durante estasdespolarizaciones, con las producidas por la diá-lisis de Ca2', sugiere que, durante la despola-rización celular, la [Ca2+]¡ que se alcanza endominios subplasmalemales de secreción pue-de ser mayor de lOftM. La medición promediode la [Ca2+]¡ en células intactas indica cambiosmucho menores. Por ello, cabe concluir quedurante la despolarización, deben producirsegradientes espaciales muy acusados de la[

Para el estudio de gradientes de Ca2+ y se-creción en células cromafines bovinas, utiliza-mos en nuestro laboratorio una estrategiadiferente13. Se midieron los cambios de la[Ca2+]¡ y la secreción de catecolaminas en cé-lulas estimuladas con una solución despolarizan-te (100 mM de K+). Una vez despolarizadas, seofreció a las células Ca2+ o Ba2+ en forma deescalón brusco, o en forma de rampa lineal quepermitía el incremento gradual de la concentra-ción extracelular de cada catión, desde 0 a2,5 mM, en un período de 10 min (fig. 2). Ob-servamos una clara separación entre los cam-bios de la [Ca21], y el curso temporal de la res-puesta secretora. Con el escalón de Ca2+ seapreció un incremento paralelo de la [Ca2+], yla secreción, que alcanzó un pico en pocos se-

96

LA SEÑAL CELULAR DEL CALCIO: IMPLICACIONES FISIOLÓGICAS Y FARMACOTERÁPICAS

[Ca2+],

Fotomultiplicador

Fura-2 encélula única

t

Bombaperistáltica

LámparadeXe

Secreción

Cámarade

superfusión

Células

Fig. 2. Dispositivo utilizado para el estudio de gradientes de cationes divalentes Ca^' y Ba*'*, y su influencia so-bre el proceso de secreción de catecolaminas en células cromafines aisladas de médula suprarrenal bovina, ymantenidas en cultivos primarios. Los recipientes DyC son los utilizados normalmente para preparar gradientescontinuos de sacarosa para la preparación de partículas subceiuiares por centrifugación diferencial. La secreciónde catecolaminas se controla, continuamente, mediante un detector electroquímico al que se dirige el líquidoque superfunde las células cromafines. También pueden colectarse muestras y las catecolaminas presentes enlas mismas se analizan fluorométricamente. Los incrementos de la [Ca2*], se miden con un equipo de microfluo-rometría adaptado a un microscopio invertido, en una sola célula de cromafín cargada con la sonda fluorescentefura-2. En este mismo equipo hemos adaptado recientemente los elementos necesarios para medir, simultánea-mente en la misma célula, corrientes de Ca2*, cambios de la [Ca2+]¡ y secreción de catecolaminas. Adaptadode Michelena P et al13.

gundos. El paralelismo se perdió después de po-cos minutos, ya que la secreción volvió a valo-res básales pero la [Ca2+], permaneció elevadaen una meseta de 0,4/tM. Con la rampa deCa2+ tan sólo observamos un pequeño picotransitorio de secreción, a pesar de que la[Ca2+]¡ permaneció elevada durante todo el pe-ríodo de 10 min de estimulación. Esta separa-ción entre [Ca2+]¡ y secreción se apreció tam-bién en condiciones experimentales en las que

era factible que los canales de Ca2+ L perma-necieran abiertos, ya que se utilizó una ligeradespolarización (18mM de K+) y el activadorde esos canales, Bay K 8644 (1 ¡M). En otraspalabras, la secreción fue, de nuevo, transitoriapero la [Ca2+]¡ permaneció elevada en una me-seta. Si en vez de Ca2+ se aplican escalones orampas de Ba2+, se obtienen respuestas secre-toras no inactivantes. Estos resultados sugierenque la velocidad y la cuantía de la secreción no

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FARMACOLOGÍA DE IOS CANALES IÓNICOS

son una función simple de la [Ca2t]¡ que se al-canza en un momento dado, y son compatiblescon las siguientes conclusiones: 1) la velocidadde secreción depende de la existencia de ungradiente de Ca2t muy acusado, que permitaalcanzar [Ca2~]¡ muy elevadas (10-100pM) enlos mlcrodomios citosólicos en los que aconte-ce la exocitosis probablemente ubicados cercade la boca interna de los canales de Ca2t L, y2) la inactivación [Ca2+],-deperdiente de loscanales de Ca2+ contribuye a disipar ese gra-diente de Ca2~ y a regular ia secreción14.

Otro importante factor que puede contribuira modular la secreción a medio y largo plazo esel de la existencia de varios depósitos de vesí-culas secretoras, uno de vesículas fácilmente li-bera bles, ancladas en el plasmalema, y otro dereserva. Este esquema surgió de las observacio-nes siguientes. La velocidad de secreción conla diálisis de Ca2+ a través de una pipeta depatch es considerablemente menor, para unadeterminada [Ca2+],, que la observada en res-puesta a despolarizaciones breves (Ca2+ extra-celular que penetra en la célula por canales deCa2+)12. Por otra parte, la cantidad total de se-creción es siempre mucho mayor con la diálisisde Ca2+ que con la elevación rápida de la[Ca2"1], por despolarización. Neher y Zücke'15

utilizaron DM-nitrofeno (un compuesto que uneCa2+ y lo libera rápidamente por fotolisis) parainvestigar la cinética de la secreción Ca2*-dependiente en células cromafines bovinas. Lafotolisis produjo la elevación de la [Ca2+], en es-calones de 100/ ÍM, que indujeron una secre-ción intensa de varios segundos de duración,seguida de una lenta y persistente secreción. Losdistintos componentes de esta cinética puedenrepresentar la existencia de depósitos vesicula-res con mayor o menor disponibilidad para se-cretar. Tanto el transporte de vesículas, desdeel depósito de reserva hasta el liberable, comola propia secreción parecen ser fenómenosCa2+-dependientes. En base a ello, Heinemannet al16 han propuesto un modelo de secreciónque consta de dos fases. El modelo contemplala existencia de una depresión o un aumento dela secreción en ciertas condiciones experimen-tales. Así, después de la aplicación de estímu-los intensos, el depósito liberable disminuye, loque ocasiona una depresión de la respuesta se-cretora cuando se estimula, posteriormente, lacélula. La recuperación de la secreción se ace-lera cuando se incrementa moderadamente la[Ca2-]¡; ello se debe, probablemente, a la recu-peración del depósito liberable. Con esta mani-pulación, el depósito puede rellenarse de más,

por lo que las respuestas secretoras subsiguien-tes pueden estar incrementadas17.

Canales de calcio y neurosecreción

Conocer cuál es la participación de cada sub-tipo de canal de Ca2+ (L, N, P, Q) en la regula-ción de la liberación de distintos neurotransmi-sores en distintas sinapsis, saber su grado deacoplamiento con la maquinaria secretora, asícomo su distribución geográfica y su aportaciónindividual a los cambios de la [Ca2+]¡ en micro-dominios neuronales constituye, ahora mismo,uno de los temas de investigación más canden-tes en neurociencia.

Ante esta creciente diversidad de canales deCa2+ , cabe plantearse cuál es la funciónde cada uno de estos subtipos y /o qué subti-po de canal regula la liberación de un determi-nado neurotransmisor en las sinapsis centralesy periféricas. En el SNC, se ha demostrado quela co-cono:oxina GVIA (GVIA), un bloqueador se-lectivo de canales N, inhibe potentemente, aun-que parcialmente, la liberación de gluta-mato18'19, de acetilcolina20, de dopamina:9'2: yde noradrenalina22. Otros estudios muestran unpapel predominante de los canales no N no Len la liberación de neurotransmisores en sinap-sis centrales23. Por otro lado, en sinapsis peri-féricas, parece que es el canal tipo N el que re-gula predominantemente la liberación deneurotransmisores. Así, en neuronas simpáticasde rata, Hirning et aP encontraron que la GVIAera capaz de bloquear la liberación de noradre-nalina. Un bloqueo similar por GVIA en sinap-sis noradrenergicas periféricas ha sido descritopor Clasbrummel et al25 y Feuerstein et al26.Más recientemente, Wheeler et al27 han descri-to que tanto los canales de Ca2+ tipo N comolos Q regulan la transmisión sináptica en el hi-pocampo.

La regulación del proceso secretor de cate-colaminas por un determinado subtipo de ca-nal de Ca2+ parece ser algo más complejo.Como describen Gandía et al en un artículo an-terior, la presencia en células cromafines de losdiferentes subtipos de canales varía en funciónde la especie estudiada. En la célula croma-fin de gato hemos identificado canales tipo L yN en proporciones similares. Sin embargo, elproceso secretor de catecolaminas puede blo-quearse totalmente sólo por dihidropiridinas(DHPs) antagonistas, y muy poco por GVIA2S.En la célula cromafín bovina, el patrón obser-vado parece ser mucho más complejo. Los ca-nales tipo L suponen tan sólo un 15-20% cuan-

LA SEÑAL CELULAR DEL CALCIO: IMPLICACIONES FISIOLÓGICAS Y FARMACOTERAPICAS

do se estudian las corrientes globales de Ba2+;sin embargo, el bloqueo de la secreción porDHP es de un 50%. Si bien estos datos apoyanla idea de que este subtipo de canal estaría muydirectamente relacionado con el proceso de exo-citosis, también nos indican la existencia de otrocomponente que es capaz de controlar, aproxi-madamente, otro 50% del proceso exocitótico.Este 50% no se bloquea por la combinación deGVIA y w-agatoxina IVA (IVA), un bloqueador decanales P, a pesar de que estos eran los com-ponentes mayoritarios en los estudios electrofi-siológicos. Recientemente, con la disponibilidadde una nueva toxina, la u-conotoxina MVIIC(MVIIC), hemos conseguido bloquear de una for-ma contundente el proceso secretor de cateco-laminas en células cromafines bovinas, median-te la combinación de esta toxina y DHP. Estosdatos funcionales parecen sugerir la existenciade un nuevo subtipo de canal de Ca2+, deno-minado Q, en la membrana de la célula croma-fin bovina, dato que parece confirmarse por es-tudios electrofisiológicos29.

Localización de canales de calcioen microdominios del plasmalema:importancia para la regulaciónde la neurosecreción

Existen varios trabajos que sugieren que la li-beración de neurotransmisores no ocurre al azaren toda la superficie del plasmalema. Por ejem-plo, Schroeder et al30 han utilizado delicadoselectrodos de fibra de carbono, cuya punta sepule al fuego hasta que alcanza 1 ¡nm de diáme-tro. Cuando se acerca este electrodo a una cé-lula cromafín, y esta se estimula con agentesdespolarizantes, el electrodo detecta la secre-ción de catecolaminas mediante técnicas ampe-rométricas17. Moviendo el microelectrodo pordistintas áreas de la superficie celular, se hanidentificado microdominios en los que no se pro-duce exocitosis, junto a otros en que sí aconte-ce (zonas activas). Por otra parte, Augustine yNeher12 llegaron a la conclusión de que la[Caz+], subplasmalemal, durante la despolari-zación celular, podría alcanzar valores de dece-nas de jamol. Para generar esta señal de Ca2+

tan drástica y versátil, se impone el esbozo deuna nueva hipótesis. Para poder elevar la[Ca2+]¡ así, los canales de Ca2+ deberían api-ñarse cerca de las zonas activas exocitóticas. Esdecir, los canales de Ca2+ que suministran elCa2+ necesario para disparar rápidamente lasecreción formarían una unidad morfofuncionalcon las estructuras de la maquinaria secretora,

muy cerca de aquellos lugares en los que lasvesículas se acumulan y se anclan al plasmale-ma, preparándose para vaciar su contenido alespacio extracelular tan pronto como un poten-cial de acción active dichos canales. Llinás etal31 han proporcionado evidencias en favor deesta hipótesis en la sinapsis gigante del calamar.La tecnología disponible hasta el momento sólopermite el uso de este modelo sináptico paradetectar, con suficiente resolución espaciotem-poral, los rápidos cambios de la [Ca2l]¡ que seproducen en microdominios cercanos al axole-ma durante un potencial de acción. Para ello,utilizaron una fotoproteína (n-aequorina-J) que,al poseer baja afinidad por el Ca2+, puede de-tectar cambios de decenas de /¿mol en la con-centración citosólica del catión. Con esta preci-sa estrategia demostraron la existencia detransientes de [Ca2+]¡ en puntos específicos dela terminación presináptica del axón gigante delcalamar.

La célula cromafín es demasiado pequeñapara lograr una resolución espacial suficiente yapreciar microdominios de transientes de[Ca2+]¡. Sin embargo, tiene la ventaja de queposee varios subtipos de canales de Ca2+ (véa-se el artículo de Gandía et al en esta monogra-fía) y de que su respuesta secretora es fácilmen-te cuantificable con técnicas flurométricasclásicas, o con las más modernas de ampero-metría. Por ello, hemos estudiado en este mo-delo la vinculación que cada canal de Ca2+ po-see con la maquinaria secretora y planteado lahipótesis de que determinados subtipos de ca-nales de Ca2+ se encuentren más cercanosque otros al dispositivo secretor.

En células cromafines de gato, el análisis ci-nético y farmacológico de corrientes globalesde Ca2+ y Ba2+ reveló la presencia mayorita-ria de canales de Ca2+ N y L32. Por otra parte,sabemos desde hace una década que la se-creción de catecolaminas en células cromafi-nes felinas es extremadamente sensible a con-centraciones nanomolares de activadores ybloqueadores DHP de canales L33. Este hechonos llevó a preguntarnos por la razón de la exis-tencia en la célula cromafín de gato de canalesN y L, y cuál sería su participación relativa enel control de la secreción. El pico de corrienteglobal de Ca2+ se inhibió un 47% por la DHPfurnldipino, y la corriente tardía un 80%. La GVIAredujo el pico de corriente un 42% y un 55%la fase tardía. En lo que se refiere a la señal ci-tosólica del Ca2+, producida por pulsos brevesde K+ elevado aplicados a células cromafinesfelinas cargadas con fura-2, esta se redujo un

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Tratamiento delnervio esplácnico

Célula cromafínbovina

Vaso

Fig. 3. Esquema de la sinapsis colinocromafín en lamédula de la glándula suprarrenal intacta. Modelo quepropone la distinta localización geográfica de los dis-tintos subtipos de canales de Ca2* para explicar elbloqueo selectivo de la secreción de catecolaminasa la circulación, por agentes que afectan canales deCa2* voltajedependientes L o Q, pero no los P o N.Los canales alejados de la maquinaria secretora pue-den surtir de Ca2' y la célula para regular otras fun-ciones distintas a la de exocitosis, y que requieren con-centraciones más bajas del catión. Por ejemplo, eltransporte de vesículas desde el aparato de Golgi hastael depósito liberable, situado adyacente al plasmale-ma, la activación de enzimas que participan en la sín-tesis de catecolaminas mediante fosforilaciones Ca2* -dependientes, o la expresión génica.

44% porfurnidipino y un 42% por GVIA. La se-creción de catecolaminas, sin embargo, se afec-tó de manera diferente por ambos bloqueado-res. Mientras que el furnidipino bloqueó más deun 95% la respuesta secretora al K+ elevado,la GVIA la redujo apenas un 20%. Así pues, loscanales L y N parecen aportar cantidades simi-lares de Ca2+ al interior celular. Pero el Ca2f

que ve el citosol parece que tiene «diferentescolores». Uno sirve para secretar (canales L),pero el otro no (canales N). Esta observación nosllevó a plantear la hipótesis de que los canalesde Ca2+ del subtipo L tendrían que ubicarse enla inmediata vecindad de los sitios activos deexocitosis en el plasmalema2834.

Durante los últimos meses hemos sometidoesta hipótesis a una cuidadosa evaluación enotro modelo de célula cromafín, el bovino, cuyadotación de canales de Ca2+ parece más hete-

rogénea que la felina. De hecho, en la célula cro-mafín bovina hemos disecado al menos cuatrosubcomponentes en sus corrientes globales deCa2H, a saber, uno sensible a furnidipino (canalL), otro a GVIA (canal N), un tercero a IVA (ca-nal P) y un último componente sensible a MVIIC(canal Q)29. Con anterioridad a estos experi-mentos, habíamos observado que la secreciónde catecolaminas en la adrenal intacta bovinaera insensible a GVIA, y sólo parcialmente sen-sible a DHP35'36. Más tarde, demostramos quela corriente de Ca2+ poseía un componentesensible a IVA, y sugerimos que los canales Pcolaborarían con los L en el control de la se-creción cromafín bovina37'38. Pero hace unosmeses observamos que la secreción cromafínbovina era insensible a IVA29. La reciente dis-ponibilidad de MVIIC nos ha permitido encon-trar el eslabón perdido en esa compleja cade-na de múltiples canales de Ca2+ y secreción.Ei furnidipino por un lado y la MVIIC por otroreducen a la mitad la secreción y la combina-ción de los dos la abóle. Así pues, la célula cro-mafín bovina en cultivos primarios expresacuatro subtipos de canales de Ca2+ (L, N, P,Q), pero sólo dos, los L y los Q, parecen estarestrechamente vinculados a la regulación dela exocitosis.

Nuestros resultados chocan parcialmente conotros presentados en un estudio reciente, en losque se midió, simultáneamente, en una únicacélula cromafín, la corriente global de Ca2+ y lasecreción, esta mediante la capacitancia eléc-trica de la membrana39. En este estudio seconcluye que la corriente global de Ca2t en lacélula cromafín bovina consta sólo de 3 com-ponentes, L, N y P. Se asevera que los 3 cana-les contribuyen al control de la secreción, perolos L poseen un peso específico considerable-mente mayor. Para explicar esta discrepanciapodrían esgrimirse diferencias metodológicas enel cultivo de las células, en diseños experimen-tales o en la técnica utilizada para medir la se-creción. Artalejo et al39 utilizaron técnicas depatch-clamp y capacitancia para medir corrien-tes de Ca2+ y secreción, respectivamente. No-sotros utilizamos técnicas de patch-clamp paramedir corrientes, amperometría y fluorescenciapara cuantificar secreción y, además, cuantifi-camos la captación de 45Ca2+ y medimos loscambios de la [Ca2+]¡. Por lo demás, las neu-rotoxinas que utilizamos son las mismas. Por tan-to, el hecho de que nosotros adscribamos al con-trol de la secreción a canales Q y L y Artalejoet al39 a canales L, N y P constituye una dis-crepancia tan drástica que es difícil de reconci-

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liar aduciendo, tan sólo, diferencias metodoló-gicas.

del plasmalema en las que la exocitosis no tie-ne lugar.

Una hipótesis y un modelo

En la suprarrenal intacta, las células croma-fines de su médula liberan, directamente a lacirculación, sus catecolaminas adrenalina ynoradrenalina. Para que nuestro organismoresponda adecuadamente con reacciones dealerta, lucha o huida ante una determinada si-tuación de estrés o peligro, la secreción de ca-tecolaminas debe ser rápida, contundente yprecisa. Es lógico, pues, que los sitios activosde secreción se localicen preferentemente enla zona del plasmalema que mira a la luz vas-cular (fig. 3). Esta especialización geográficade la secreción sugiere que los canales deCa2+ de los subtipos Q y L deben colocalizar-se con los sitios activos exocitóticos, en la su-perficie celular que mira a los vasos. De estamanera, cuando el nervio esplácnico activa lacélula cromafín mediante la secreción de ace-tilcolina, esta genera potenciales de acción queselecionan, seguramente, los 4 canales deCa2+. Pero sólo el Ca2+ que entra por los L ylos Q es capaz, por su localización estratégi-ca, de generar una rápida y transitoria eleva-ción de la [Ca2+]¡ de varias decenas de ^mol.Esta es una señal, pues, altamente localizadaen un microdominio de la célula cromafín, cer-cano al plasmalema de la superficie secreto-ra, allíen donde las vesículas permanecen an-cladas a la membrana, dispuestas para expelersu contenido catecoiaminérgico a la circulaciónen unos pocos ms.

Como comentamos al principio, el Ca2+ re-gula multitud de procesos biológicos. Una cé-lula como la cromafín debe asegurar una se-creción continuada de catecolaminas ensituaciones de estrés prolongados. El transpor-te de nuevas vesículas para reponer las ya uti-lizadas, la síntesis de catecolaminas median-te enzimas que requieren para su activaciónuna fosforilación, o la expresión de los genesque dirigen la síntesis de estos u otras enzimasson todos fenómenos Ca2+-dependientes. Sinembargo, los valores de [Ca2+], que requierenson sustancialmente menores, y tampoco pre-cisan cambios o gradientes tan bruscos comolos que necesita la maquinaria secretora parafuncionar con extremada rapidez. Es plausibleque esos incrementos de la [Ca2+]¡ en microdo-minios de la maquinaria secretora se produzcanpor vía de los canales N y P que, en la célulacromafín bovina, estarían ubicados en las zonas

Implicaciones farmacoterápicas

La sobrecarga de las células con un excesode Ca2+ es un mecanismo citotóxico que pue-de causar su muerte. De hecho, se acepta quela excesiva entrada de Ca2+ constituye un me-canismo patogénico crucial en varias enferme-dades del aparato cardiovascular y del sistemanervioso central, por ejemplo, la hipertensión,la enfermedad isquémica coronaria, el infartode miocardio o el ictus. La acumulación excesi-va de Ca2+ en neuronas se ha asociado tam-bién a enfermedades neurodegenerativas deevolución crónica del tipo enfermedad de Alz-heimer o de Parkinson. El Ca2t parece desem-peñar también un importante papel en patolo-gías del tipo de la epilepsia, que cursan con unahiperexcitabilidad neuronal. Dada esta rica pa-tología, no es extraño que la mayoría de los es-fuerzos para la búsqueda y desarrollo de fárma-cos que interfieren con la homeostasis celulardel Ca2+ se hayan canalizado hacia la preven-ción de la entrada y la sobrecarga celular deCa2+.

Los denominados actualmente antagonistasdel calcio40, bloqueadores de la entrada deCa2+, o bloqueadores de canales de Ca2+ inhi-ben selectivamente los canales del subtipo L.Constituyen un grupo heterogéneo de molécu-las con gran relevancia en el tratamiento de en-fermedades del aparato cardiovascular. Apartede sus ya clásicas indicaciones en el tratamien-to de la hipertensión y de la isquemia corona-ria, se está en este momento resaltando su ac-tividad citoprotectora por prevenir la sobrecargade Ca2+ en situaciones de isquemia tisular.Tanto a nivel preclínico como clínico existen nu-merosos datos que apoyan esta actividad. Sonlos siguientes: 1) a nivel cardíaco, el verapamiloy el diltiazem, pero no el nifedipino, disminuyenla incidencia de reinfartos y la mortalidad en pa-cientes con infarto agudo de miocardio4143; 2)a nivel cerebral, el nimodipino previene las se-cuelas neurológicas tras una hemorragia sub-aracnoidea, y la flunarizina posee claros efec-tos antimigrañosos; 3) algunas dihidropiridinas(nifedipino, lacidipino, isradipino), el verapami-lo y el diltiazem poseen potencial antiaterogé-nico, y 4) el verapamilo, el diltiazem y el nitren-dipino protegen frente a la toxicidad renalproducida por radiocontrastes; además, el ve-rapamilo protege frente a la nefrotoxicidad in-ducida por ciclosporina44.

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En la actualidad se están investigando mu-chos nuevos bloqueadores de canales L, y tam-bién algunos activadores. Se persigue encontraruna mayor selectividad tisular y un mejor perfilfarmacocinético. Especialmente relevantes sonla citoprotección y el potencial antiaterogénico,así como sus posibles aplicaciones no cardio-vasculares (p. ej., enfermedades del tipo del co-lon irritable, con alteraciones secretoras y mo-toras del tracto gastrointestinal).

La farmacología de los canales de Ca2+ no Lestá por descubrir. Tan sólo disponemos de neu-rotoxinas, que se han utilizado recientemente enmodelos de isquemia cerebral para conocer susposibles efectos neuroprotectores45. Por ejem-plo, con una única inyección en bolo de co-conotoxina MVIIA (MVIIA), un inhibidor reversi-ble de los canales de Ca2' N, se produce unaneuroprotección significativa cuando el péptidose administra 24 h antes de la agresión isqué-mica. La toxina protegió las neuronas piramida-les de área CAÍ del hipocampo de rata, frenteal daño producido por una isquemia cerebralglobal. Sin embargo, la MVIIC, que bloquea ca-nales Q con mayor afinidad que los N y P, noprodujo neuroprotección. La MVIIC sifué eficazpara reducir el volumen de infarto neocorticalen modelos de isquemia focal de cerebro derata. La toxina es eficaz tanto si se administradurante la oclusión como tras el episodio isqué-mico, lo que sugiere que la ventana terapéuticapara instaurar un tratamiento postictus puedeser mayor de lo que se pensaba. Estos datos,aunque aún son preliminares y escasos, sugie-ren que los conopéptidos y sus derivados pue-den ser útiles en la profilaxis del daño neuronalsecundario a un accidente isquémico por ictus,parada cardíaca, trauma craneal o trauma dela médula espinal.

Los bloqueadores de canales N podrían tam-bién ser eficaces en otros síndromes específi-cos del sistema nervioso central. Por ejemplo,la administración intratecal de MVIIA abóle larespuesta nociceptiva observada con el test deformalina en la pata trasera de la rata. Por otraparte, la alodinia táctil se suprimió selectiva-mente en un modelo de dolor neuropático trasla administración intratecal de MVIIA; esteefecto fue 100 veces más potente que el demorfina.

ra hematoencefálica) y su rápida degradaciónpor vía oral. Por tanto, los esfuerzos deben diri-girse a la síntesis de moléculas no peptídicasque bloqueen uno u otro subtipo de canal deCa2\ Una de las estrategias que se están si-guiendo consiste en esclarecer la estructura mo-lecular de neurotoxinas conocidas. Así, esclare-cer la estructura tridimensional de conotoxinasy agatoxinas constituye el primer paso para lacomprensión de los determinantes molecularesque les confieren selectividad para unirse a undeterminado canal. Con esta idea, hemos defi-nido recientemente la estructura tridimensionalde la GVIA, mediante el uso de técnicas de re-sonancia magnética nuclear de protones46. Laestructura es globular; la molécula en soluciónse dobla y estabiliza mediante 3 puentes disul-furo y varios enlaces de hidrógeno intramolecu-lares. En la periferia se encuentran 14 gruposhidroxilo, completamente expuestos al solven-te. Estos grupos, más las cadenas laterales deusina y arginina con residuos polares, que emer-gen radialmente del núcleo peptídico, propor-cionan elementos específicos de reconocimientopara la interacción de la toxina con el canal neu-ronal N. En la actualidad, en colaboración conJ Álvarez-Builla (Universidad de Alcalá de He-nares), estamos intentando sintetizar moléculasno peptídicas basándonos en los farmacóforosde la GVIA, que pudieran bloquear selectiva-mente los canales de Ca2+ del subtipo N.

Otra importante pregunta por contestar se re-laciona con la definición del númer.o.de cana-les de Ca2t que controlan la liberación de neu-rotransm¡sores. Se han identificado ya muchossubtipos de receptores para varios neurotrans-misores (cinco para dopamina, 12 para seroto-nina). Es plausible,, pues, que la liberación deun neurotransmisor pudiera controlarse por sub-tipos de canales de Ca2+ diferentes, de acuer-do con el tipo de receptor presente en una de-terminada sinapsis.

Finalmente, cabe preguntarse hasta dónde va-mos a llegar con esta creciente diversidad decanales de Ca2+ y cuál es la función específi-ca de cada subtipo de canal. En cualquier caso,esta enorme complejidad tiene un lado positi-vo, y es la diversidad de dianas para buscar fár-macos cada vez más selectivos que modulenuno u otro subtipo de canal de Ca2+.

Perspectivas farmacoterápicas

El uso clínico de péptidos que bloqueen ca-nales de Ca2+ neuronales está condicionadopor su limitada difusión (no atraviesan la barre-

Resumen

Dada la diversidad de funciones fisiológicasque controla el catión Ca2+, no debe sopren-dernos el creciente número de subtipos de ca-

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LA SEÑAL CELULAR DEL CALCIO: IMPLICACIONES F SIOLOGICAS v F A R M A C O T E R A P C A S

nales de Ca2+ voltajedependientes (L, N, P, Q,T) que se están identificando y caracterizando.No es difícil entender que un canal L controlela contractilidad miocárdica, uno, T, el marca-pasos de una neurona y otro, N, la liberaciónde noradrenalina en neuronas simpáticas. Sinembargo, cuando como en el caso de la célulacromafín bovina se expresan varios subtipos decanales de Ca2+ simultáneamente (L, N, P y Q)surge la pregunta inevitable de para qué tantocanal en una misma célula. Si clamos créditoa la selectividad de las neurotoxlnas para iden-tificarlos, la secreción de catecolaminas en lacélula cromafín bovina se controla por canalesL y Q. En la célula cromafín de gato se expre-san por igual los canales L y N, pero son los Llos que dominan el proceso secretor. Estos ha-llazgos nos han conducido a postular la hipóte-sis de que ciertos subtipos de canales de Ca2+

que dominan el control de la secreción (los Qy L en la célula cromafín bovina, los L en la feli-na) se encontrarían apiñados en lugares cerca-nos a la maquinaria secretora. De esta mane-ra, al despolarizarse la célula cromafín yseleccionarse sus canales de Ca2+, se produci-rían rápidas y drásticas elevaciones de la[Ca2+]¡, pero sólo en aquellos microdominlosdel subplasmalema especializados para secre-tar. De esta manera, el resto de la célula estaríaa salvo de una exposición masiva de Ca2+, quepodría serle nociva. El Ca2+ que penetra en lacélula por canales no acoplados a la maquina-ria secretora (N y P en la célula cromafín bovi-na, N en la felina) serviría otras funciones celu-lares Ca2+-dependientes, pero no relacionadasde inmediato con la exocitosis rápida. Si bienlos canales de Ca2t del tipo L poseen una ricafarmacología, con clara proyección clínica en en-fermedades cardiovasculares y neurológicas (an-gina, hipertensión, ictus o migraña), los cana-les no L carecen de farmacología. El recienteesclarecimiento de la estructura tridimensionalde algunas neurotoxinas peptídicas permitirá uti-lizarlas de «molde» para el diseño y síntesis decompuestos con afinidad selectiva por uno uotro subtipo de canal de Ca2+ neuronal. La cre-ciente diversidad de canales de Ca2+ dificultala comprensión de su relevancia fisiológica y fi-siopatológica. Pero, como contrapartida, plan-tea el reto de la búsqueda de antagonistas delcaldo y de agonistas del calcio con una pronun-ciada selectividad neuronal. Varias enfermeda-des neurodegenerativas (enfermedad de Alzhei-mer o de Parkinson), neurotógicas (epilepsia) ypsiquiátricas (demencias o depresión), así comolos cuadros de isquemia cerebral, podrían be-

neficiarse de esta estrategia antes de que ter-mine esta década del cerebro.

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DISCUSIÓN

M. CRIADO: ¿Cuántas clases de células croma-fines hay?, o cuando hablamos de las célulascromafines en la médula adrenal de distintasespecies, ¿son estas células tan homogéneas?

A.G. GARCÍA: En bovino, por ejemplo, el 40%son células noradrenérgicas, el 60% adrenér-gicas, en el hombre predomina fundamental-mente la adrenalina, es decir, hay variacionesen función de la especie. Lo que no existenson células que fabriquen las dos catecolami-nas, aunque algunos autores han sugerido queun pequeño porcentaje serían células mixtas.

M. CRIADO: Quisiera hacerle otra pregunta, ¿esposible que la expresión de canales se afecteen cultivo?

A.G. GARCÍA: Por supuesto. Como antes ha se-ñalado el Dr. Gandía es muy posible que laexpresión de canales L y/o N se incrementecon la edad de las células. Aunque muchosgrupos trabajan con cultivos heterogéneos, he-mos elaborado una tecnología para separarpoblaciones homogéneas de células. Otracosa que queremos hacer es trabajar en ro-dajas de médula adrenal. Al igual que se tra-baja en rodajas de hipocampo, queremos tra-bajar en rodajas de médula adrenal, paraconocer in situ la proporción existente de cadasubtipo de canales de calcio en la célula cro-mafín.

V. CEÑA: En principio yo estoy absolutamentede acuerdo con una microanatomía regionalde los canales, y no sólo en la célula croma-fin, sino que hay otros sistemas donde pare-ce ser por datos indirectos que también exis-te. Uno de estos sistemas es el hipocampodonde hay corrientes llevadas por determina-dos canales cuyo bloqueo no afecta la secre-ción de glutamato. Quería además plantearleuna cuestión. Cuando se despolariza una cé-lula con concentraciones elevadas de potasioextracelular, la señal intracelular de calcio seeleva y permanece elevada incluso duranteminutos hasta que desaparece la concentra-ción extracelular de calcio. Desde un puntode vista, digamos, electrofisiológico, pensan-do en la cinética de los canales, parece im-

probable que un canal de calcio esté abiertodurante un minuto seguido en respuesta adespolarización. La pregunta es ¿qué meca-nismos podrían estar implicados en este man-tenimiento de una señal intracelular de calcioelevada, justo hasta que cesa el estímulo des-polarizante, aunque este período de tiempodure un minuto?

A.G. GARCÍA: Hay canales que están abiertostoda la vida, es decir, que un canal de calciopuede estar abierto minutos. Usted ha hechoexperimentos aplicando hasta 5 pulsos despo-larizantes y ha observado que puede haberuna inactivación de canales que es gradual,y nunca vemos a los canales totalmente inacti-vados y totalmente activados, sino que estáncontinuamente pasando de un estado a otro.Puede que alguno de los subtipos de canalesque estamos viendo contribuyan de forma im-portante al mantenimiento de esa señal de cal-cio ya que se ¡nactivan muy lentamente.

V. CEÑA: ES que la corriente neta de entrada enrespuesta a un pulso despolarizante desapa-rece a los lOs, y es un hecho que bastantegente ha comprobado que un pulso despola-rizante eléctrico mantiene los valores de cal-cio intracelular elevados incluso durante va-rios minutos hasta que cesa dicho pulso,mientras que sin cambios en el voltaje la co-rriente neta de entrada desaparece como mu-cho en 10 s.

J.E. ESQUERDA: Como usted ha hecho algunasreferencias a la acción letal del calcio, me gus-taría hacer un comentario al margen sobre laacción «vital» del calcio. Desde hace algúntiempo se conoce que las neuronas presen-tan dependencia de factores neurotróficos yque la retirada de estos factores comporta lamuerte por apoptosis de las mismas. In vitro,este tipo de muerte neuronal se evita simple-mente por la acción despolarizante de un me-dio de cultivo con potasio elevado; es decir,que elevaciones moderadas del calcio intra-celular pueden sustituir la acción trófica me-diada por factores neurotróficos. En este sen-tido, la señal del calcio es una señal vital.

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A.G. GARCÍA: En relación con su comentario, re-cuerdo que existe comercialmente un mediode cultivo que favorece la emisión de prolon-gaciones por las neuronas y que tiene una con-centración ligeramente elevada de potasio; elBay K 8644 también favorece la emisión deprolongaciones, y el factor de crecimiento ner-vioso eleva ligeramente las concentraciones decalcio. Estoy de acuerdo con usted en que unapequeña elevación de la concentración de cal-cio constituye una señal trófica para las neu-ronas.

J. LÓPEZ BARNEO: Las células cromafines, comousted ha demostrado in vivo, están polariza-das funcionalmente y liberan en la zona cer-cana a donde está el vaso, ¿sabe si hay al-guien que haya hecho experimentos parademostrar si los canales que se relacionan conla secreción, ya sean L, P o Q se distribuyenen forma de clusters, es decir, en cúmulos decanales? Esto parecería lógico y apoyaría laidea de que en un modelo presináptico, quees lo que en definitiva es la célula cromafín,los canales que participan en la secrecióncomo en un terminal presináptico clásico seacumulan justo donde están las vesículas.

A.G. GARCÍA: Hay dos formas de estudiar esteaspecto, una mediante autorradiografía conmoléculas yodadas como la w-conotoxinaGVIA, que es poco discriminativa, y otra conmoléculas fluorescentes. En nuestro grupo te-nemos previsto trabajar con estas moléculasfluorescentes en cuanto dispongamos de ellas.Hasta el momento, diversos grupos han co-municado datos que permiten inferir indirec-tamente que esto es así. El problema en es-tas células pequeñas como las nuestras es queestos estudios para idénticos agrupamientosde canales son difíciles.

J. MARSAL: Como en las células cromafines coe-xisten las catecolaminas y el ATP, en nuestromodelo coexisten la acetilcolina y el ATP, y conla u-conotoxina GVIA lo que hacemos es prác-ticamente no modificar la secreción de acetil-colina y en cambio inhibir totalmente la secre-ción de ATP. No sé si usted tiene unaexplicación para eso. Por el contrario, la FTXinhibe la secreción de ambos, tanto de acetil-colina como de ATP en nuestro modelo. ¿Que-rría preguntarle si ha estudiado la secreciónde ATP utilizando estos antagonistas y si havisto alguna modificación.

A.G. GARCÍA: Tenemos datos publicados de co-secreción de catecolaminas y de ATP y noexiste un paralelismo total entre ambas secre-ciones. Creo que todos los investigadores que

trabajan en célula cromafín aceptan que lascatecolaminas y el ATP están coalmacenados.A mí, personalmente, me parece difícil que dela misma célula 2 sustancias que están coal-macenadas en la misma vesícula se secretenen función de la entrada de iones calcio porvías distintas.

J. MARSAL: ¿Cómo sabe que coeixsten en unamisma vesícula en todas las vesículas, las ca-tecolaminas y el ATP?

A.G. GARCÍA: ESO es difícil de saber. Como ustedconoce, las técnicas de separación de vesícu-las por centrifugación diferencial proporcionanpreparaciones con una gran homogeneidadde vesículas cromafines: hasta el momento,nadie puede asegurar que se trate de un solotipo de vesículas.

B. SORIA: De los registros que mostraba usteden los que variaba la concentración de calcio,parece interfirse que existe una buena corre-lación entre la liberación de catecolaminas yla primera derivada de la concentración decalcio, la velocidad con la que varía la concen-tración de calcio. ¿Cómo se podría conciliaresta observación con algo que parece bienaceptado como son los cambios transitoriosrápidos muy localizados dentro de las estruc-turas?

A.G. GARCÍA: Creo que estos experimentos tie-nen la limitación de la baja resolución es-paciotemporal de las técnicas que estamosutilizando. Ahora mismo estamos reconside-rando todas estas hipótesis que hemos ex-puesto aquí, y que se basan en estudios rea-lizados en poblaciones celulares, con nuevosestudios en célula única; estamos midiendosimultáneamente corrientes de calcio, señalde calcio y secreción en la misma célula cro-mafín, y estamos empezando a manejar es-tas técnicas con cierta soltura. Esperamos queesta estrategia nos ayudará a corroborar o re-chazar nuestra hipótesis original sobre la lo-calización de ciertos subtipos de canales decalcio en lugares próximos a la maquinaria se-cretora.

M. VALDEOLMILLOS: En la célula beta como en lacélula cromafín, la secreción es dependientede calcio. Ahora bien, después de una primerafase lo que cada vez cobra más cuerpo es quequizá el calcio no es la señal primaria, sinoque la cantidad de liberación está moduladapor otros segundos mensajeros, en concretoparece ser que los valores de AMP cíclico tie-nen un papel fundamental, ¿qué se sabe conrespecto a AMP cíclico a otros segundos men-sajeros en células cromafines?

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LA SEÑAL CELULAR DEL CALCIO: IMPLICACIONES FISIOLÓGICAS Y FARMACOTERAPICAS

A.G. GARCÍA: Se sabe mucho y nada. Mucho quisiera añadir una cosa. No olvidemos queporque hay bastante literatura y nada porque la tirosin hidroxilasa es uno de los sustratosios distintos grupos de investigadores no se po- más conocidos de la proteincinasa A y la fos-nen de acuerdo en cuanto al papel del AMP forllación de la tirosinhidroxilasa es imprescin-cíclico y de la PKA en la regulación de la exo- dible para la síntesis de noradrenalina, por tan-citosis. Sin embargo, creo que convendría te- to, creo que en este proceso de secreciónner en cuenta que la secreción total depende continuada, la participación de segundos men-del calcio en un rango muy estrecho. sajeros como el AMP cíclico debe ser impor-

X. GUITART: Con respecto al AMP cíclico sólo tantísima.

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FUNDACIÓN! ¡DR. ANTONIOI ESTEVE

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17 MONOGRAFÍAS DR, ANTONIO ESTEVE · 17 monografÍas dr, antonio esteve farmacologÍa de los canales iÓnicos a.g. garda fundaciÓn •lie dr antonio ¡esteve