MECANISMOS REGULADORES Y FERMENTACIONES INDUSTRIALESREGULACION Y COORDINACION DEL METABOLISMO MICROBIANO INDUCCIONREGULACION CATABOLICAREGULACION POR RETROALIMENTACION REGULACION DE LA SINTESIS DE RNA POR AMINOACIDOS REGULACION POR EL ESTADO O CARGA ENERGETICA REGULACION POR CONTROL DE LA PERMEABILIDAD

REGULACION Y COORDINACION DEL METABOLISMO MICROBIANO

UN MICROORGANISMO QUE CRECE SIGUE EL SIGUIENTE PROCESO METABOLICO

Rompe molculas de alto peso molecular

Introduce en la clula derivados ms pequeos

Los degrada a molculas ms pequeas

Los convierte en unidades monomricas

Construye materiales bsicos: almidn

glucosa, 6C

piruvato, 3C

Amino cidos, nucletidos, vitaminas, carbohidratos y cidos grasos.

Protenas, coenzimas, cidos nucleicos, Mucopptidos, polisacridos y lpidos

QUE IMPLICA TODO ESTE PROCESO METABOLICO ?

Produccin de cientos de enzimas que actan coordinadamente para evitar el caos.

500 reacciones metablicas se conectan con la va glucoltica y el ciclo del cido ctrico. Cada reaccin requiere una enzima determinada

QUE POSEE LA CELULA PARA ACTUAR COORDINADAMENTE ?

Mecanismos de control, que regulan las reacciones qumicas.

Por lo tanto: Una clula ideal no tiene produccin excesiva de metabolitos

EXISTEN MICROORGANISMOS MAL REGULADOS QUE PRODUZCAN EN DEMASIA DETERMINADOS METABOLITOS ?

SI

Esto ha permitido que existan microorganismos mal regulados en determinadas rutas bioqumicas y por lo tanto produzcan en demasa determinados metabolitos.

!!!! Estos microorganismos nos interesan .!!!!!

PODEMOS PROVOCAR QUE UN MICROORGANISMO BIEN REGULADO PRODUZCA UN DETERMINADO COMPUESTO ALTERANDO SUS MECANISMOS REGULADORES ?

SI

Por lo tanto: Es esencial para la microbiologa industrial el conocimiento de los mecanismos reguladores

INDUCCION

I. INDUCCION

ENZIMAS CONSTITUTIVOS

Enzimas siempre presentes entre la enorme cantidad de enzimas que un microorganismo es capaz de producir.

ENZIMAS INDUCIBLES

Enzimas no presentes, o lo estn en cantidades mnimas y que ante la presencia de una sustancia (sustrato), la clula aumenta enormemente su cantidad.

INDUCTOR

Sustancia que incrementa la sntesis de novo de las enzimas inducibles

INDUCCIONForma de regulacin de la expresin de genes, slo cuando el apropiado sustrato del enzima est presente.Muchas enzimas catablicas [la mayor parte industriales] son inducibles. EL MECANISMO DE LA INDUCCCION [En los procariotas]:

Protenas represoras controlan la transcripcin gnica

comienza . . .

Cuando la protena represora y la enzima RNA polimerasa se unen fuertemente a regin operadora y regin promotora respectivamente (secuencias especficas de nucletidos del DNA)

Si est presente la protena represora: la RNA polimerasa no puede actuar, no producindose la transcripcin.

Si no est presente la protena represora: la RNA polimerasa se une, producindose la transcripcin.

La protena represora reconoce un ligando especfico y esta unin activa la transcripcin al disminuir la afinidad de la protena represora por su secuencia de DNA especfica (operador).

INDUCCION NEGATIVA (control negativo)

Regulacin, en cual el gen/es (operon) est reprimido, en condiciones normales

OPERN Lac DE Escherichia coli :

SINTESIS DE ENZIMAS QUE HIDROLIZAN LACTOSA EN GLUCOSA Y GALACTOSA.

AUSENCIA DE LACTOSA: protena represora est unida al operador, bloqueando el acceso de la RNA polimerasa a su regin de unin (promotor), impidiendo la transcripcin

PRESENCIA DE LACTOSA: sta se une a la protena represora desligandola del operador permitiendo el acceso de la RNA polimerasa al promotor activando la transcripcin

La lactosa es un inductor natural del opern Lac de Escherichia coli.

OPERN Lac DE Escherichia coli :SINTESIS DE LAS ENZIMAS QUE HIDROLIZAN LACTOSA EN GLUCOSA Y GALACTOSA.

OPERN Lac DE Escherichia coli :SINTESIS DE LAS ENZIMAS QUE HIDROLIZAN LACTOSA EN GLUCOSA Y GALACTOSA.

OPERN Lac DE Escherichia coli : SINTESIS DE LAS ENZIMAS QUE HIDROLIZAN LACTOSA EN GLUCOSA Y GALACTOSA

INDUCCION POSITIVA ( control positivo )

Mecanismo alternativo de la regulacin negativa:

Es la regulacin por medio de protenas activadoras de la expresin gnica.

En este caso la protena activadora facilita la unin de la RNA polimerasa.

Estas protenas activadoras, al igual que las protenas represoras, se unen a ligandos especficos (inductor) pero en este caso se incrementa la afinidad de la protena activadora por el DNA con lo que se activa la transcripcin.

Si la protena activadora (Ej. CAP ) se halla presente:

La RNA polimerasa se une y tiene lugar la transcripcin

Si la protena activadora (Ej. CAP ) no se halla presente:

La RNA polimerasa no se une y no tiene lugar la transcripcin

Este tipo de control gnico recibe el nombre de induccin positiva ( control positivo )

Controles positivos y negativos de la transcripcin del ADN en mRNA.

Podemos manipular, a nivel de sntesis, la produccin de un enzima bien sea:

Introduciendo inductores autnticos o anlogos. isopropil -d-galactsido es el mejor inductor del operon lac

Por mutacin del gen regulador (el que codifica para la protena represora) inactivando la protena represora.

Por mutacin del operador con lo que la protena represora no presentar afinidad por l. MANIPULACION, A NIVEL DE SINTESIS, DE LA PRODUCCION DE UNA ENZIMA

REGULACION CATABOLICARepresin Catablica (Efecto de la Glucosa)

III. REGULACION CATABOLICA

SUPONGA A LA BACTERIA Escherichia Coli CRECIENDO EN UN MEDIO CON VARIAS FUENTES DE CARBONO

QUE SUCEDERIA ?

La bacteria podra sintetizar enzimas para degradar todas las fuentes de carbono presentes. Esto supondra un enorme derroche de energa al sintetizar protenas que no son estrictamente necesarias.

2 La bacteria lo que hace es sintetizar el sistema enzimtico para la utilizacin del mejor sustrato, reprimindose la sntesis de los otros sistemas enzimticos.MECANISMOS REGULADORES Y FERMENTACIONES INDUSTRIALES

REPRESION POR CATABOLITO : EFECTO GLUCOSA

La glucosa fu el primer sustrato estudiado que ocasionaba represin catablica

Por lo que tambin se le llama efecto glucosa, aunque no es el nico sustrato que produce este efecto.

Slo cuando se agota el primer sustrato se sintetizan enzimas para la utilizacin del siguiente.

Efecto de la glucosa en la expresin de las protenas codificadas por el opern lac

El transporte de glucosa al interior de la clula inhibe a la enzima adenilato ciclasa que es la que produce el AMPc. El AMPc se une a una protena de unin llamada CAP o CRP. El complejo AMPc-CAP y no la protena CAP por s sola, es capaz de unirse a un sitio en los promotores de los operones sensibles a la represin catablica. La unin con el complejo hace al promotor ms eficiente, por lo tanto se llevarn a cabo ms procesos de iniciacin de la transcripcin de ese promotor, Debido a que el papel del complejo CAP-AMPc es encender la transcripcin, este tipo de control se considera como CONTROL POSITIVO.

REPRESION POR CATABOLITO: FUENTES DE CARBONO REPRESORES

La combinacin de la induccin y represin aseguran una economa celular notable ya que slo se sintetizan los enzimas indispensables. Evitando el uso de fuentes de carbono represoras en el medio de cultivo se puede aumentar la produccin de enzimas sensibles a la represin catablica.

Por ejemplo: usando manosa en el crecimiento de Pseudomonas fluorescens var. cellulosa se produce 1500 veces ms celulasa que crecindola en presencia de galactosa

REGULACION POR RETROALIMENTACION

IV. REGULACION POR RETROALIMENTACION

REGULACION DE RUTAS ANABOLICAS O DE BIOSINTESIS

En contraste a las rutas catablicas que suelen estar reguladas por el sustrato inicial.

Como ocurre en los dos sistemas de regulacin ya descritos: Induccin y Regulacin catablica

Las rutas anablicas o de biosntesis suelen estar reguladas por el producto final

Como es el caso de la retroalimentacin

Ribosoma

mRNA

DNAINDUCCIONrepresinLas rutas catablicas suelen estar reguladas por el sustrato inicial.Como ocurre en los dos sistemas de regulacin : Induccin y Regulacin catablicasustrato inicialLas rutas anablicas o de biosntesis suelen estar reguladas por el producto finalComo es el caso de la retroalimentacin (feedback) producto final

Existen dos tipos fundamentales de regulacin por retroalimentacin:

4.1. Inhibicin por retroalimentacin

4.2. Represin por retroalimentacin

4.3. Regulacin por retroalimentacin en rutas ramificadas

4.1. INHIBICIN POR RETROALIMENTACINEs un fenmeno en el cual un metabolito, generalmente el metabolito final de una secuencia metablica Inhibe la accin de una enzima anterior que, generalmente, es la primera de la secuencia.

MATERIAL INICIAL

Enzima A

Primer intermediario

Enzima B

Segundo intermediario

Enzima C

Tercer intermediario

Enzima D

PRODUCTO FINALLA ACTIIVIDAD DE LA PRIMERA ENZIMA DE LA VIA ES INHIBIDA POR EL PRODUCTO FINAL CONTROLANDOSE SI LA PRODUCCION DEL PRODUCTO FINAL INHIBICIN POR RETROALIMENTACIN

Inhibicin por retroalimentacin

El inhibidor es el producto final y no un derivado en contraste con el sistema clsico de inhibicin por competicin

El inhibidor (producto final) no se parece ni en tamao, ni en forma, ni en carga al sustrato.

Por lo que se llama inhibicin alostrica.

En la inhibicin por competicin:

El inhibidor se asemeja al sustrato y compite por el sitio activo del enzima (Inhibidor Isostrico).

Las ENZIMAS ALOSTRICOS generalmente :

Estn formados por dos o ms subunidades.

Una de las cuales lleva el centro activo (sitio de unin al sustrato); y

La otra el sitio de unin al inhibidor

Cuando el inhibidor se une a su centro, se distorsiona la conformacin del enzima impidiendo la unin del enzima a su sustrato

ENZIMA ALOSTERICA: Mecanismo de inhibicin enzimtica por efecto alostrico

Sitio alostrico Sitio de unin con el sustrato Efector alostrico Sustrato

Cambio de conformacin sn sl sitiode unin con el sustrato. La reaccin enzimtica procedeSe inhibe la reaccin enzimtica

El sustrato no se puede unir

Cuando el efector se combina con el sitio alosterico, se altera la conformacion de la enzima que el sustrato ya no se puede unir Como es posible qu un producto final inhiba la actividad de una enzima que acta sobre un sustrato muy poco relacionado con el ?

Regulacin de la sntesis de lisina por retroalimentacin

4.2. REPRESIN POR RETROALIMENTACIN

La represin por retroalimentacin es un fenmeno muy comn.

Regula la sntesis de aminocidos y nucletidos pricos y pirimidnicos.

Por ejemplo:

Si existe un nivel alto del aminocido triptfano en el medio de cultivo, el microorganismo no va a gastar energa sintetizando los enzimas implicados en la biosntesis de triptfano.

ESTA REGULACIN SE LLEVA A CABO MEDIANTE EL PRODUCTO FINAL

EN ESTE CASO TRIPTFANO, QUE IMPIDE QUE LOS GENES QUE CODIFICAN PARA ESOS ENZIMAS NO SE TRANSCRIBAN EN RNA MENSAJERO.

EL OPERN TRP EN Escherichia coli

En Escherichia coli el opern trp est formado por:

Un promotorUn operador, y Cinco genes que codifican para los enzimas implicados en la sntesis de triptfano.

EL OPERN TRP EN Escherichia coli

El GEN REGULADOR codifica para una protena represora inactiva que no se puede unir al operador por lo que la RNA polimerasa se une al promotor sintetizndose las enzimas.

Por el contrario, si el triptfano est presente y no se necesita ms, la protena represora se une al triptfano y se convierte en su forma activa, la cual se une al operador bloqueando la unin de la RNA polimerasa al promotor e impidiendo la sntesis de los enzimas.

4.3. REGULACIN POR RETROALIMENTACIN EN RUTAS RAMIFICADAS: VIA BIOSINTETICA

Inhibicin por retroalimentacin

PROLINA

ACIDO GLUTAMICO ARGININA

Inhibicin por retroalimentacin

Existen tres tipos de regulacin por retroalimentacin en rutas ramificadas:

Isoenzimas o Diferencial

b) Concertado

c) Acumulativo

a. Isoenzimas o Diferencial

E

D

A B C F G

HVarios enzimas diferentes (denominados isoenzimas) catalizan la reaccin inicial estando cada uno de ellos inhibido por un producto distinto.

Concertada

E

D

A B C F G

HDistintos productos se unen para inhibir una nica enzima.

c. Acumulativa

E

D

A B C F G

H

Distintos productos inhiben en distinta proporcin a una nica enzima.

A la hora de utilizar un microorganismo a nivel industrial:

El ms fcil de desregular sera el concertado.

Por lo que, se tiende a usar aquellos microorganismos que utilizan este sistema.

Es el caso de Corynebacterium glutamicum para la produccin de lisina (aminocido deficitario en vegetales).

V. REGULACION DE LA SINTESIS DE RNA POR AMINOACIDOS

Escherichia coli un "control global" Regular la sntesis de RNA en los casos de crisis metablica

La mayor parte de ejemplos de regulacin vistos responden a condiciones nutricionales especficas:

Presencia de un disacrido, o

Ausencia de un aminocido en el medio.

MECANISMOS REGULADORES Y FERMENTACIONES INDUSTRIALES

Escherichia coli un "control global" Regular la sntesis de RNA en los casos de crisis metablica

Hace ms de 20 aos se descubri en Escherichia coli un "control global" :

Cuando se transferan las clulas de un medio rico a un medio pobre se paraba la sntesis de RNA disminuyendo la sntesis de protenas.

Esta observacin indica que las clulas bacterianas pueden regular la sntesis de RNA en los casos de crisis metablica.

Actualmente se sabe que SE INHIBE sntesis de rRNA y tRNA bajo esas condiciones:

Cuando se ACUMULAN dos guaninas polifosfatos (ppGpp y pppGpp) las cuales son sintetizadas por la enzima Rel A

CUANDO FALTA UN AMINOCIDO, EN LA SNTESIS DE PROTENAS

El correspondiente tRNA se encuentra en el ribosoma sin su grupo aminoacil.

Provoca que la enzima Rel A sintetice pppGpp a partir de GTP (que se utiliza como fuente de energa en muchos pasos de la sntesis proteica).

Este pppGpp por medio de una pirofosforilasa llamada Gpp lo convierte en ppGpp que a su vez inhibe la sntesis de rRNA y tRNA permitiendo nicamente la sntesis de aminocidos.

CUANDO EXISTEN NIVELES ACEPTABLES DE AMINOCIDOS

El ppGpp por medio de una 3' fosforilasa llamada Spo T se convierte en el intermediario normal GDP GTP

El mecanismo por el cual se activan unos mRNA (los implicados en la sntesis de aminocidos) y otros se inhiben no se conoce de momento.

Este mecanismo, preciso y rpido, protege a la bacteria de un crecimiento deficiente

VI. REGULACION POR EL ESTADO O CARGA ENERGETICA

ESTADO ENERGETICO DE LA CELULA

Existe una ecuacin emprica mediante la cual se puede determinar el estado energtico de una clula:

[ATP] + 1/2 [ADP] E = --------------------------------- [ATP] + [ADP] + [AMP]

Cuando el valor de E es alto: indica que no hay biosntesis

Cuando el valor de E es bajo: indica que hay biosntesis puesto que se est consumiendo ATPMECANISMOS REGULADORES Y FERMENTACIONES INDUSTRIALES

ESTADO ENERGETICO DE LA CELULA

Se ha comprobado que una clula en fase logartmica de crecimiento, metabolismo primario, presenta un valor de E = 0,5.

Sin embargo, en fase estacionaria tiene un valor de E = 0,8.

En fase estacionaria cambia drsticamente el metabolismo celular pasando al metabolismo secundario.

Los motivos por los cuales ocurren estos cambios no se conocen, aunque deben ser mltiples debido al gran nmero de reacciones metablicas donde actan el ATP, ADP y AMP.

La membrana citoplasmtica controla el paso de los nutrientes al interior de la clula, as como hacia el exterior de la clula.

Existen cuatro mecanismos que regulan el transporte de nutrientes.

1.- Difusin pasiva2.- Difusin facilitada

3.- Transporte activo

4.- Transporte por translocacin de grupo

VII. REGULACION POR CONTROL DE LA PERMEABILIDAD

1. Difusin pasiva

Molculas de H2O y algunos nutrientes liposolubles pasan libremente a travs de la membrana hasta equilibrar concentraciones.

No hay consumo de energa.

2. Difusin facilitada

Los nutrientes se unen a una protena transportadora para atravesar la membrana pasando de mayor a menor concentracin.

No hay consumo de energa.

3. Transporte activo

La mayor parte de los nutrientes son transportados mediante este mecanismo.

Este proceso permite concentrar, en el interior celular, altos niveles de nutrientes necesarios para las actividades metablicas.

Hay consumo de energa.

El ATP distorsiona el sitio de unin a la protena transportadora dificultando a la molcula la salida de la clula.

4. Transporte por translocacin de grupo

En este tipo la protena transportadora es una enzima que aade un grupo fosfato del cido fosfoenolpirvico al nutriente durante el transporte.

Este nutriente alterado ya no es capaz de unirse a la protena transportadora por lo que se acumula dentro de la clula.

Generalmente, el control de actividad de las enzimas es por encendido o apagado de las enzimas y est asociado con enzimas alostricas durante la inhibicin de feedback:

Cuando los productos en una va aumentan, ellos mismos producen feedback a la primera enzima de la va y cierran la sntesis de los productos finales e intermedios.

Inhibicin feedback

Feedback acumulativo: ni F ni H pueden reducir separadamente por completo la actividad de e1, posiblemente cada uno puede lograr una reduccin parcial pero juntos pueden pararla totalmente.

Vas ramificadas

Feedback secuencial: F y H provocan feedback en e4 y e6 respectivameante provocando la acumulacin de D. D entonces produce feedback sobre e1.

Feedback multivalente: ni F ni H por separado producen efecto alguno en e1 pero juntos tienen actividad inhibitoria.