Upload
dinhkhue
View
216
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
1
�������������� ����������������������������������������������������
������������������������������ ������������������������ ���������
�
!���������"��������������������������������������� ������
������������#�����$%$�%%&�������'(�#�)����'����������(*���������
����������#������ �+������,���������������#������ ����������������-�
���������� ������������������#�����$%$�%%&���,�����
�
�#����.����.���������������������/��������0����������������'���������
1�������0���2�3�$%$45$%6��������7����������(����������������������
�������������,����3�
�#��.��������������������������������8�!���������"�����������
���������������������������� ������������������#�����$%$�%%&���,����3�
#�8�95$�:�:�;6�:�5&<���=8�95$�:�:�;6��&-&<�(�����8���������>������3��3?��
�
'����� ���8��������������� �������������@���
�
�
�
�
�
Copyright 2001 by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.
JBC Papers in Press. Published on June 4, 2001 as Manuscript M102789200 by guest on M
arch 4, 2018http://w
ww
.jbc.org/D
ownloaded from
2
��������
�
� �����������)�@��+�������������.���������������������������
����3� � �@���������������������� ������������ �������������������������
�A����������@����������������������A������������������ ����������
�����=�����@����@���������α, β,�����γ��������3� � #��������������������
���������� ����� ���������������������)�������������� ������������������
������4&��4:-$�4:-&���%%$+3� � #��������������������������� �������
�@����.��������.���������������������B���C�@������������ �����
������������������������������3� � D����������.�������B���C�@�������
���������������������������������������������������������������
��� ���������*��������������������������*��3� � 7���*����������������
0���&�����@���.���/������0��������*����������������������������
�������������� ���������*�������������������.���������������������
���*������� ��� ����0���&�����@��������*��*������������������
��� ��������3� � #����������� ��������������������� ���������
�@���������� ����������������� ���������������=��)�@����@��'α��β��γ+�������
���������������������@���������#��������������������
��������� ����������� ����� 3�
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
3
�����������
�
� �����������)�@���+��������.����������������������������������
�� ����� ����������������3� � #�������������@���)�@��'+��������������
����γ���������)�@��'α��β������γ)���������������������������������β�����γ�
��������������������.�����*���������������������������������� �
��������������,��$�����,��:�)$���+3� � #��������������������������
�����������@��'�������������������������������������� ���.������
�� ����� ����������������� �����������������������#0#:������#0#-�����
�����*��������������=�)$��:+3� � �@��'α��β������γ ���������������������
�@��������������������������������������������.���������)6�5+3� � D���
�@��'�α��β�����γ�.�������������=��������@��'α �������@���.�����.�
��������)���E$%�7+���@��'β �������@���.���*�����.���������)���E$%%�7+��
�����@��'γ �����������������������������@����.��������=�������@��'�α��
������������@���.�����*����� �����������������)���E�7+�);�$$+3� � D�
��������*�����������@����������@��'α ���� ��7���/��20���������
��������������A��������@��'����������������#@@����������������
������������ �������� ������������������� ���������������=����
�@����@��'�������� �����.�������� ����� �)$�+3�
� �@��'������@��:-��0� :5��1�6�������@��6:������������@���)5+�����
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
4
���������*����������.���������������������@���������.���
�� ������������ ������3� � 0�������� ������A���������� ��.���
�������������������������������������@�����������.����������=���
������������������������������������������ �������7"1�)�+�����.��
�����*��������������� ���������7"1�)0+�����7"1�)�+�)$:+3� � /��$-��0���&��
/���4��0��:%�����-5�����/��&4�����������������������*������ �7"1�)�+��
7"1�)0+��7"1�)�+������@��3� � ���$&�����@�$;������������.��7"1�)�+�
�����@����.�����@��$���������*������ �7"1�)�+��7"1�)�+������@��3� �
0������� ����.�������������������������/��$-��@�$;��@��$��0���&��
/���4��0��:%������/��&4������@����!20����1�'������������F��B���C�@���
������������ ���������������������������������������������
B���C�������3� � #����.���*�� �����������������.�������������
��� ���������*���������#@@����������������������*���������������3� �
����������������@���������F�������������������)���@��+����.��
��� �������������������������*���������� �������������������
�������$���������������� �������.���*�� ���������������������
���*������������������������������������������@����@��������������=3�
�
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
5
7�����������7�����
�
���������������������'��*��@�B���C��������)$$4-���G����+�
.�����������������0�������1���������"�����H��@�3�)"����� ���������
H�+3� � '����������"�)�������"��������*����������+�������������0��
�*������������� ��������������������������������.��������������
�� ���0���������3� � (���������� ����������������)(�����+�.����������
��������� ������ �����3��@�3�)#������,����+3� � "����=�����%%%��
������������ ��0�������������0��������*����������������)/�����������
@7D��������������+�������������.� ��������������������$���������
������� ������.����������������0�������1���������"�����H��@�3�
)H�+3� � �
�
����������������������!20������� ��������@���)'I!�
������(�����@�3��0��� �����H�+�.�������������������@������
���������������1��������(#:��)2�*� �����3��7��������D�+�.������������
#4�=���������������3� � 0���������������� �������������� ������������
�������@����!20�.����������.����������������������������(#:��
�����������=����������������)�(#:���@��+3� � #���(#:���@���.���
=�����������������������"@�$)!(:+��������������������#4�������3� � 0�
$-��������������������"@�$)!(:+��������� ��(#:���@���.��� ��.���*��� ��
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
6
����������������������������������-%%�������@�������������� �$%%�
µ G�������������3� � 0������������������3-������:4°��������.�����������
����������@���.���%3-��7��������������� �������������� ��.�������3-��3� �
���@���.���������������������������������������3� � #�������������������
������.����������F���������@���.������������������.��)$6+3� � #�������.��
���������������� ������������� ��F���������F������������
������������6°�3� � #�������.��������� ����$%�%%%���������$%����������
����������.���������3� � #������.���������*������%��7�#��������
������)���53:+��������� �$%��7�(!#0�����&�7� ��������������������3� �
#��������������.�������.���$%��7������� ������������$��7�
�=���F�� ������������������������7� ��������������������������53%3� �
#����������.�������.�������������$&�������������������������
�����F��� �����1"�3� � 0�����A���������@���.������?������!��10/(����� �
$�3-�J��������������� �����������������3� � #������� ��������*��������
����������@���.������������������������������������� ��#@@�������3� �
#������������@������������������� ���0���������3�.�������������������3� �
#�������������������.�������������"���'���1�����0��������
�� ������ ���*����������������������������3� � #������������@����������
���������.���$E$%�����G� 3�
�
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
7
����������������� !��������(#:���@����������������������
���*�.������������������������ ����������������������������������
#�#����������������������������)1��� �������������7��������D�+�
��������������B���C�������3� � #�����*������ ������������
������ ���������������� �������� ���.����=��.������%J��������
����*����������������)-�� G��+�)�%�µ�+����������� ����������� ���
.�����3� � #����� �������������������������������.������������������
�����������������������K������������3� � 0�����A������������������
��������.������?������!��10/(����� �$-J��������������� �������
�������� �����3� � 0�����A���.�����������?�������F�=��������
������� ���������� ����������$���������):%%������� ��$%������������
�����+�������������.���1"��)���.�����%3-���G���+�)0�������
1���������"�����H��@�3��"����� �������+3� � #���������$���������.���
������.���$%%µ�����:J�����������������������1"�����������
���������������������3� � #��������� �������������������.���������
��������B���C������������ ���1!�$%��������)0�������1���������
"�����H��@�3+�.���1"�������������������3� � L������������� �$µ ����
��������!20��������-�µ����������������%�µ������B���C������������*����
������������;:��� 63:���������B���C���@���)$3:��� $%�����G����+3� � #���������
B���C���@���.������������������������������������� ��#@@����������
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
8
�����������*3� � #���������B���C���@���������F�������� �����������������
��������������.��������-%�����G� 3�
�
���������"�����#�����$��#�������� ����B���C���@�����
�����������"���������������0�.�������������������������������� ������3� �
(�F��������������������������������)������ �������,������#����+�
.�������.���$%%�µ����������������"���������������0����%�µ G������1"��
��6°���*��� �3� � '����������"�����.���(������.�����������������
����� ���������3� � ����(������������$%�µ����������������=���
�������� �$%�� G��������������"�����%3%-�H�(��������%3$�7�
����������������������-3%�.�������������:4°������$5��3� � #�������
.��.�����.���%3%-J�#.���%����1"�������������.���1"���������� �
%3%-J�#.���%�����:J�������������������3� � �A����������������.��
����.������$%���������B���C���@����.������������������$-����������1"��
�������� �%3%-J�#.���%�����:J����������������������:4°��������3� �
0���.����� �.���%3%-J�#.���%����1"�����������B���C���@���.���
��������������.���$%%�µ�����$J��!�3� � #����������*���.����������
�����A���������������������3�
�
�����%��%���#�������#����������#@@���)'�"%&:4+�.���
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
9
��������������'��(2�����"����)���������,����+3� � �#@@��������.��
������������������'17�$&6%�������)/�"�L+����������.���$%J�
������*������������$%%����G������@�����:4°���������-�J��L��
�������3� � ���@�����-����G��������������������.�������������������
*���������3�#�������.��������������������������������$3-��$%��
����G���������������.����������3�
�
��������$�������������������������������������������������
��������������@�����������.��.���������������'17�$&6%������3� �
#���.����������������������������������������������������
.�����������������$%������G���.���$%%�µ����������.��3� � 0���������
���������������B���C���@������������$%%�µ�����������'17�$&6%�������
.����������3� � 0���������������������������:4°��.���-�J��L��������
�������%�µ���������#���;&�0A������������������ ��.��������������
.���������������������-�-����.����������������������������������������
.�*�� ������� ������������ ������������;:%%1��)������F������3�
����+3� � #������#���;&�0A������������������ ������������������
���������������*���.���������������1��� �������������)D�+3� � #��
��������������������������F����������������������������������� �
�� �������F���������������!������K���������������������������
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
10
&3%3�
�
L�� �������������7���/��20��0���)7-+�����7���/��20��0���
)7&+�.������������=�����*���������� ���������*�������������.�����
!�.=�-%�=���)�������+��������������� ������)�%%�6%%������$3-���=�$-%�
��+��������� ���������������������#���������)$-+3� � 7���/��20�������
7���/��20���.�����������������F������������7���/��20��0�������
7���/��20��0��������.������������������)$&+3� � 7���/��20������
7���/��20��.��������������7�����/��20��0������(�������� �����)$-+3� �
7���/��20����7���/��20����7���/��20�������7���/��20���.���������
�����: ��������������� ����������������F��������������.�������������������
����7�����/��20���.����������������"��/��1�6�)�����6%%�������3%����=�
$%%���+��������������� �����3� � (������� �����������.������*�����
���������� �������������������.���&����"�����������������
���������� ��������������)(����0+����������������� �������)$4+3� �
7�����/��20�/��20�2+�����7���/��20�2+�.��������������
7�����/��20�������7���/��20����������������� �2�"���������*��3� � #��
������������������������ ����������������� ����������� ������������
.����������������������������������������������)$5+�������������
�� ����������������������)$-+�����70@!��#L��7��)������F������3��������
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
11
,����+3�
�
���������������%�������� !�������#�����������������!20��
������ �B���C���@����($-!��@$;!��@�$!��2�&!��2�&M��/�40��2:%!������
(&4M�.�� ����������.�����1�'���������������������7����������
����)$;+3� � #�������.�� ��������.�����8�-K�#00#0�/0�#�0�#0#0///�
)��������+��-K�/�#0/##0##/�#�0/�//�)���������+��
-K��#/0�#�0/#0�##��#��0/�)����������+��
-K��#/�00##//0��0#�#/�#/�)����($-!+��
-K��0#�#/�#//0�/0#�#/�0/�)����@$;!+��
-K��#/�#//0#/0��0/0#/0##�)����@�$!+��
-K�0#/0##�#//0�//�0#�00#�)����2�&!+��
-K�0#/0##�#/�00//�0#�00#�)����2�&M+��
-K�0##�#/00#/��0#�00#00��)����/�40+��
-K�//�0#�00#�00#0�00/00��)����2:%!+��
-K�00/��/�#//0�/00/#0�##�)����(&4M+3� � 1�������������������
���������������������������3� � �������������������������������
.����������������������������<��������������������������������������
�������������������������������������1�'3� � ��������������������1�'��
�������� �.������*��������� ����.����������������=����������
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
12
������������� ������������������������������3� � #����� �����������
.������� ���.���������������������������� ��������(#:�3� � #��
����������������������1�'����*��������.���*���������!20��A����� 3� �
0���!20��A����� ��������������B���C��������������������@���
.�������������������.������.��������@��3�
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
13
�
'����� �
�
��������������� ������ ������������*�� ��������������������� �
�������@����.��������.������������*������������������B���C���@������
������ �����������������������������������3� � ����������������@���
���������@���������������������������������B���C���@�����������B���C�@���
������F����� ����3� � �������������.�������.����B���C���@�������������
��������������������������� ����*��������#@@�������������������
���*�����������������.������@��3� � #�����������������������@�����*�� �����
���������� ����*���.�������������������$���������������� �����3� �
#��������������������@���)6����G� +����.���*�������������������)�� 3�
$0+3� � ���������������������������������.������������������������.�
���.����������������3� � ��.*������#@@������������������*�������
�������*����������������@���.������������������������
����������� ���:%��!��)�� 3�$"+3� � L��������������.���B���C���@���.���
�����������F���������������������$���������������� ������������
=����B���C������������������*�������1!�$%��������������=������
5%J����B���C���@���.�����������������������������*���������������� �
��:%��!��������������� ��%J�����������*���������������� ���&%�
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
14
�!��)�� 3�$�+3� � ��.*�����B���C���@�������������� ���&%�!����������
.������)����������.�+3� � L������������������������� ���:%��!��
���.���������������������*���)�� 3�$!+������������������*���.���-%�
���G� �)��N7�����������7����O+3� � ������������������������
B���C���@������������������$-�%:%�!������������������������������A����
)�%+��B���C���@������������������������������������������1"�������3� �
#������������.������������ ������������������������������������� �
��������������.���������������� ���������*�������������
���������������*�������@��������3� � �
�
�������������� ��������� ��������������������������� ������ �D������������
������������������������*�� ��������������������������� �
��������������@�������������������������������������������������
���������������������(@��0������.�����������������*�������
���������������)����������.�+3� � B���C���@���.�������������� ��������
�����������B���C����������������.���������������=����
B���C�����������1!�$%��������������� ������)��N7�����������
7����O+3� � 0����������������B���C���@���.����������������������
���������������������� ������3� � #�������� ����������������������F��
������������������������=������.��������������� ��*��������)$-+��
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
15
����������� ��������)�$+�������*��������������"�)��+��������� �
�� ������������ ������3� � ��.�����������������������"�������.�����
B���C���@���������������.���*����������������������� ����*������� �
������ ����������3� � 0������� ��������������"�.�����������F�������
����3� � �������A���=���������%�µ G��������������"����$%%�µ�����1"��
.�����������F���������.�����������������*��� ���������������� �����
.���������.���1"���������� �:J�������������������3� � ������������� �
�� �����*����������������.����������������������������� �
������������������ 3� � #������-��$%����6��$%�����G������B���C���@���.���
�����������.�����������.�������������������:4�°C3� � #�������.�����
.�����.���%3%-J�#.���%����1"�����������������*������������
B���C���@���.����������������� ����������$�J��!�3� � 0�����.������� 3�
�0�)��+, �������� ����B���C���@����������������"�����������.���
����������������������6��$%�����G���):%��7+3� � �����������
B���C���@����������������������������0����������������� �������������
0�����������������������A������������������"�.���������2� ������
)�� 3��0����+3� � #������������.������������� �(����������
�����������"�����������)�� 3��0����+3� � #����������� ������
�������� ����B���C���@�������������F�������������"��������*���
7���/��20������7���/��20����.���������������������������"�)��+3� � �
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
16
�
�� ���������������������� �� �������������������������� ������ ������
�������������������������� ������ � ��������������������������@���
�������.���7���/��20�������7���/��20��0���)$:+3� � ��.*���������
����������������.����� ���������������������������� ������������
������������������������ �������3� � D�=��������������������������
*��������� ������������ �������)��#����$+������������ ����B���C���@���
�������������"����������3� � 0�����.������� 3��"��7-�����7&����.��
����������������.�����74��75��7;�����7:�������3� � 0���������F�����
#����$��������������7-����7&����-%J����������������������.���
����������%3��µ7��.�����������������74��75��7;����7:����.���
��������$�73� � �����7���/��20��0����7���/��20�������7���/��20��
���.������������������������.����������������������A������
����������� ����������������������� ��������'�(����������������
�������.����A���������7���/��20�2+ ����������.������������������3� �
#�������������������.��������������������������������������
��α$→&������������������������������������ ��������
6�)�)��������+������� ��������������������������A�����������
�������������*��3�
�
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
17
�������������������������!���"����� ������ ����������������������������
������ �D������������������������������� �������������B���C���@���.���
��������*����������������������� ����*�������������������.����
���������������� ���������*�������@�����������������@����������
�������������������*��3� � ��������������������������������)$:+������
������������������������@���=��������������� ������A���������� ��
.���������������������� ��������7"1�)�+�)�:+������.�������*��
������������� ���������7"1�)0+�����7"1�)�+�)�6+3� � /��$-��0���&��/���4��
0��:%�����-5�����/��&4�����������������������*������ �7"1�)�+��7"1�
)0+��7"1�)�+������@��3� � ���$&�����@�$;������������.��7"1�)�+�����
�@����.�����@��$���������*������ �7"1�)�+��7"1�)�+������@���)�6+3� �
7���*��������������������0���%������������ ���������@��'�/��$�&����
��������@��'γ������@��:-��0� :5��1�6���@��6:���������� ����������@��'α�
)5+3� � L���������������������.�������������������������/��$-��
@�$;��@��$��0���&��/���4��0��:%�����-5������/��&4������@����!20������
1�'������)��N7�����������7����O+������������F��B���C���@���
��������� �������������������B���C�������3� � D����������*�
��������.���*���������!��10/(�����*������F������������� �����������
���������.����� ������������������� ���$&��!��)����������.�+������
��.����������B���C���@�������� ����������������B���C���@���.��A������
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
18
������.�����*�B���C������������������������3� � 0��� ����� ��
���������������B���C����������������.��������������������������
�����������.�����������������$���������������� �����������������F��
����� 3�:�����#�����3� � �@�������� ���($-!��@$;!��@�$!��/�40������2:%!�
.�����������������������������������������������������������
��� ���������*���������������������������*���������-%�7�)�� 3�6��� ���
�� ����� ����� ����� �+3� � L�������������������2�&!��2�&M��
����(&4M�����������������������������.�������)�� 3�:(����������+3� � #��
�������������� ���������*�����������@�������� ���.��������*��
�������������.�������������������������"��������������3� �
0���� �������(&4M����.�������������� ����*��������.�������
)�� 360���� �+�������2�&M����.���� �������������������� ��������
)�� 360�����+�����������.��������@���)�� 360�����+��.����������
2�&!����.����.������������������� ����*���)�� 360�����+3� � #��
����������������� ���������������2�&!�����2�&M�����������������
��������������.���������.��������@������������������ ����*�������
2�&!�����2�&M����*�������������������"�����������.�������������
7-����7&��.�����74��75�����7;�����������.������������������
�������F�����#����:3� � #��-%J����������������������.���7-����7&�.���
%3��µ7��.������������74��75�����7;�.�� ��������$��73� � �������
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
19
�������������0���&�����������.���������������������=�����������
�����������������������P������������� ����������@���)�-+�)�� 3�-0+��*�����
0���&��������������0������/��������������������������������������� ��
���������������������������������@�����������.����������
�����3� � #����������� ������0���&������*��*������������������
������ �����@��3� � �
�
������������������������!���"����� ����������������������������������
������������ � D��������*�� ���.���������������������@������.��
�������� ��������*������������#�����������������������������.���
.��������@��3� � 0�����.���������*������������#@@����������������#�����
�����������������������������������@��3� � H��������������)$�$%��
����G.��+������������������ �������������B���C���@�������65����������
��������.�������������*��������.�����.��������������
��������������B���C���@��3� � #��=���������������������.����������
���������������)��N7�����������7����O+3� � #�������(&4M�������
�������������.�����������@��������#��������������������*���)�� 36"��
�� �+��.������������2�&M����.���� �������*�������������� �
#���������������������.�������� �������������������� ����*��3� � #��
�������������.�����-%J��������=��������������*��������.�������*��
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
20
�������������������2�&M�)%35��7+�)�� 3�6"�����+�.������������
��������.�������)4��7+�)�� 3�6"�����+3� � ������������������2�&!�
���.����.������*�������������� �#���������������������.��������.��
����������������� ����*��3� � #���������������.�����-%J������
��=��������������*��������.�������*��)�$��7+�)�� 3�6"�����+�.���
�������������.��������@��3� � ����������2�&!����2�&M��������������
���������������*���.����������������������������.���7-�)�������
���.�+3� � #����������� �����0���&����������.�������
�������������� �������������@��������0���&���������������������������
@��:-��0� :5��1�6�������@��6:�����@���������.������� 3�-0����������
7���/��20��������������������������@��'α,������*��3�
�
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
21
!����������
�
D��������������*����������������������������� ���������
�@�����������������=���������������������� �������������)$�+3� � �������������
.���������*�������������������@������������������� ��.������
������������� ��������)$:+������������������������������*��������
�������������� ���������*�������� ���3� �D�����������������
������������������� �������������@�����*��*��0���&3� � "����
������������ �����������.���������������F����������������������@����
.�����.��������F����������� �������������������3� � 0�����.������� 3�$��
���@�������������������������.����� ��������������������������������
�������������������$���������������� ������������ �����������
���������@���=�����*����������������������������*��3� � ��������@���
��������������������������������������������������������������� �����
������� �����������3� � #����������� ������������ ����F��������
�@��3� � ��F�� �������.�� ��������������� ����F�����)����������.�+3� � ���
��������B���C����������@������������������� ���������������������
�����������������������������B���C����������������������������
�������������.�����������������������������������*���������������
�����������@��������������������������.����������:4°�������*���������3� �
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
22
0������� ����B���C����������@������������������������������F���
������������.������������������ ���������*��������@����������
���������������*�������#@@�������3� � �
#����*�� ����������������������7-�����7&������������ ���
�����������"����������������@����������������������������.��
����������������������B���C���@���.���7-����7&�������������������
��=������������.����������3� � 0����*��������������������@������ ��F��
�������� ������������ �����������������������������@��'α�)$�+����
��������������������������.�������� �����������������
�� ������������ ���������������@��'���������������������A����
�����������������@�����������3� � 0�����������@���������������
7���/��20��������������������������@��'α����� �����������@����@��'α�
�����=��� ���������������������������������������� ��3� � 0���� ��
���'��K������������������������� ������������������������������� �����
������ �����@�����@��������������� � ���������� ������������� ���������
��������������� �7���/��20�/��20����������0��::��0��6:����0���%%��
�� ���������������������������@��'α,�������� ������3�
#������������������������ �������������@����.��������
�*�����@���������������������������*�����������������)$:+3� � �����
�@����������������������)�&+������������������������������������������
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
23
�������� ��������*��3� � ��.*��������������������������������*���
������������.�����=�����*����������������������������*��3� � ������ ����
����� ������������0���&�������������������������������
����������������� ����*����.�������<�������2�&M�.������������
.����������2�&!�������3� � 0������� ���0���&�.����������������
��*��*��������������������� ��������3� � D���������������������
�@������������@��'α��β������γ�.�������������������������������������
����������"������*��1�����!������)�4+��.�����.�����������������
P������������� �����������27'���������������������0���&�������
�����������������������*��*����������� ������������������������.��
���������������������������*�������)�� 3�-"+3� � #����������������������
��*�.�����@������ ��F���������@���������������������
�� ������������ �������������������� �������� ��������������������
=������������@�������������������� ��������������3� � D�����
�� ���������������=�����@��'α��β������γ�.���������*������@��������������
��� ����������������� �0���&���������������� ����������������� ����
�������3� � �@��'���������#@@������������������������ ������������
�����0��::��0��6:�����0���%%�)�5+�������������@��'α �����.���������
�� �����������������0��4%�����0��5;�)�;+����.������� ������������
�����������������3� � #��A������.������������������0��::��0��6:����G���
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
24
0���%%�����������@��'������������������� �����@�����������������*��
�������������3�
D����.���������*����������������������������@����@��'α�
�����=��� ��������������������� ���������������=�.�����������������@����
�@��'�������������������������)$�+3� � #���������������������*���
������������������ ���������*�������@�������������������������
�������������.�����.��������������������$���������������� �����3� �
����������������F���@��������@��'α�.������������������������$���$����
P������������� ������):%+����.����������������������������
������������������ ����)�@����@��'α��β��γ+������ �����������������
���������������������������������������������@��'�������
������������������������������������ ����� ��� ��������*���
��������3� �
� �*������������������� �������������������������������
���������*���������3� � ������ ��.���������):$+����������������
):�+�.��������������������$8����������������=�.��������������
��������P������������� ���������������3� � ������� ���������
��������������� �������)::+������������������ ��.��������):6+������������
):-+���������8����������������=�.��������������������@�&���@�&�
����������������� �$:%���������8�8�������=���������=�):&+3� � ��
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
25
���������������������������P������������� ���������27'����������.����
�@��������@��'����������8�8�8�����������������=������ ������
��������3�
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
26
� #��������
�
$3� 2������"3��3������D����������!3�73�)$;;5+�&� �����%������4%��$�5$�
�3� 0������3��#�������23���������23���� ������73��#��������#3��2���������73��
�������.���#3�������� ��������3�)$;;6+�*�� �������:-$���%$��%&�
:3� /�������3@3��@�����3 3������73��@����P3������ �������@3��/����D3�3��
����/���������7303�)$;;&+����������������4$���$:5$��$:;%�
63� Q���.������373��������,3@3������Q���.�����/3�)$;;%+����)�����;��
:5;;�:;%-�
-3� ������,3@3��7���?�����03������Q���.�����/3�)$;;�+����)�����$$���%64��%-:�
&3� R������3!3��@�����#313���������1373������'�����'3,3�)$;;:+�����������&����
���+ &��;%���6�5��6:��
43� 7������,3@3��"�������73����/�����!3�������������3��,��A���� 3��#������
03������#�F��,3�)$;;-+���������%������:���$%64�$%-&�
53� ���*���3��2��������73���������3��"�������13�����������(3��#�����D3�3��
��������,303����������,3������,���/3�)$;;$+�����������&���� ���+ &��55��
6&:&�6&6%�
;3� 0������23���������73����������3��������#3���������#3��#������73��L������
73������H���������#3�)$;;�+�����,��������$4&��$�&-�$�4��
$%3� #��������#3��L�������3��0������3�����������3��2���������73������
�� ��������3�)$;;�+�������%������$65���$-6��$-5�
$$3� 0��������!373�����������3��0������73��"�����,3��#�������73��@�������
03��/�����,3�����������23/3��/������!3,3��,�������2303��R�������R3R3��
���������!323��7��������3D3��1�����@3�3��������������!3�)$;;-+����������
������4%���;5&���;5&;�
$�3� ������������3������ ����������3�)�%%$+����������������&4��4:-$�4:-&�
$:3� ���������0313���������������23��!�����,373������7��������03R3�
)$;5;+�������%������$6:��;:;�;66�
$63� #��?���#3��2��� �.���'3���� ������23�����������������3�)$;54+�
���������$���&��:$�;�:$:6�
$-3� #����#3�� ����������3��L ���0����.���73��������23��7���������#3��
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
27
�.��������3�������� 3�������������03�)$;4-+����������������-%��5-&;�5-4-�
$&3� #����������3��7�F�������#3�������������03�)$;5�+���������-$������5:��
�&:��&5�
$43� ������� ���3��L�������#3�������03������ ����������3�)$;;;+�
.�$��"����#$��;��5::�5:;�
$53� ����������3��������03��7������� 3��#��?���03������������23������
�������03�)$;5:+�,3�"���3����3���-5��$%;5�$$%4�
$;3� 7����������3�������� ����03�)$;;�+��%����&�����/�����%��:4&�
�%3� #��� ������#3��7�������3����?����#3��#���������3�����������23�� ���������
'3��������������,3�)$;5:+����%���:%���:%-�:$%�
�$3� �����3�� ����������3���������'3/3�������������03�)$;44+�����������
01�2$�3��5$��$&�$�$&:$�
��3� @��� ���3�,3�� ����������3�������������03�)$;5%+�����������01�2$�3�55��
-$�-5�
�:3� (F��.�F��'303��!����@3(3�������������/303�)$;55+�����,��������$&4��
$%:6�$%6&�
�63� !����������3��!�������73�3������'��������@3�)$;5&+����������������&$��
&545�&554�
�-3� "����������"3,3��"�����#3��������D3�3������7������!3"3�)$;54+����������
������&���$�:%&�$�:%5�
�&3� "�F����,3�3�)$;;%+����%����#$�1���$��$$��:-%�:-6�
�43� "������� ���13���� �������3,3'3������'���������D3/3�)$;;6+� ��%��%��
0������3����&44�&5��
�53� �����F���03����������3��#�������3�� ������,3����������23��������3��L��.���
�3��!����������#3��2��������#3���������?���#3�)$;5-+��%�����&�����/����$:��
$-%-�$-$&�
�;3� @�������D3,3��!�����,373���������/3'3��'����������3��1��������,3��
'�����'3,3���������73���*�����13"3��1�����23,3������D���������#303�
)$;56+����%���:$$��&�&�&:$�
:%3� @������/3��������(303������D��������303�)$;5;+����������������&6��
$�4:%�$�4:&�
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
28
:$3� ��R����0373��H������73������������������0303�)$;;�+� �������--��:%&�:$��
:�3� �����'3�3��'�����3D3��@����3���������,3�3��0������3�3��@����"3��Q������3��
L��������#3!3�����������03,3��Q��� ��,3�������7�����,3��(�������3���������3��
��F��"303��7��.���!3,3��D����������,3,3��( ����,3�������������'373�
)$;;5+����%���:;-��-$$�-$&�
::3� 0�������73�������������23��L�������#3����������'3��L��� 3������
7�����.����3�)$;;;+����%���6%$��4$:�4$4�
:63� ������03����� �������73��(�����,3!3��@����13������L���F��!373�)$;;$+�
�����&6��566�565�
:-3� �.�������D3��2� �����3������������3��������#3����������#3��7���������#3��
���������3��#�������73��������� ������3�)$;;4+����)�����$&��&;:&�&;6&�
:&3� D�����@3!3������������03��/�������,3�3��7��.���,373���������@3��
7���F��'3@3��2����(3�3��D��������,3���������������'3,3�)$;;&+����������
������4$���%$:5��%$66�
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
29
�������
�
�#������*�������������8��@��������������<�1"������������������
�����<�7����������<�/��20���2����� ���������<�0���������� ��<�/����
������<��@��'���@��������<�(@��0���F��������������������������<�
7-��7���/��20��<�7&��7���/��20��<�74��7���/��20��<�75��7���/��20��<�
7;��7���/��20��<�7:��7���/��20��<�(�������
���������� ���������������3�
�
�������������3���������� 3������ ����������3������������������������3�
� by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
30
Figure Legends
Fig.1. Size-fractionation of rhIL-2 produced in Eschericia coli and [35S]rhIL-2
synthesized by in vitro transcription and translation, and the cell proliferation activity
of each fractionate.
rhIL-2 produced in Eschericia coli (A, B) and [35S]rhIL-2 synthesized by in vitro
transcription and translation (C, D) as described in “Materials and Methods” were subjected
to gel filtration using Superose 12 columns. The amount of rhIL-2 produced in Eschericia
coli was measured by protein assay (Bradford method) (A) and the cell proliferation
activity of each fractionate was determined using Cell Titer 96 Aqueous one solution
reagent (see “Materials and Methods”) (B). C, radioactivity of [35S]rhIL-2; D, the cell
proliferation activity of [35S]rhIL-2. Arrows indicate the elution positions of blue dextran
2000 (V0, void volume), bovine serum albumin (m.w. 67 kDa) (1), ovalbumin (m.w. 43
kDa) (2), chymotrypsinogen (m.w. 25 kDa)(3), ribonuclease A (m.w. 13.7 kDa)(4), and
mannose (m.w. 180 Da) (5).
Fig. 2. Binding of [35S]rhIL-2 to ribonuclease B-coated plates (A) and effects of
high-mannose type glycans on binding (B).
Plates were coated with ribonuclease B, ribonuclease B treated with Endo H, or
ribonuclease A as described under “Materials and Methods”, and the amount of bound
[35S]rhIL-2 was measured using a liquid scintillation counter after being released with 1%
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
31
SDS. A, [35S]rhIL-2 concentration dependence. Plates coated with 20µg/ml
ribonuclease B (••), ribonuclease A (��), or ribonuclease B treated with Endo H
(∆∆) were incubated for 2h with various concentrations of [35S]rhIL-2 (up to 4 ×
105dpm/ml) in PBS. B, inhibition curves obtained for the binding of [35S]rhIL-2 to
ribonuclease B-coated plates in the presence of various high-mannose type glycans,
Man5GlcNAc2Asn (�), Man6GlcNAc2Asn (�), Man9GlcNAc2Asn (�), and
Man3GlcNAc2Asn (�). The inhibition curves obtained using Man7-8GlcNAc2Asn were the
same as those obtained using Man3GlcNAc2 (data not shown). Results are means of three
experiments (standard deviations were less than 5 %).
$����%�� � ��&����������������'��������������������������������� ������
Wild-type and mutant forms of [35S]rhIL-2 synthesized by in vitro transcription and
translation were analyzed using Superose 12 column chromatography. A, wild type; B,
E15D; C, L19D; D, L21D; E, N26D; F, N26Q; G, G27A; H, N30D; I, E67Q. Arrows
indicate the elution positions of bovine serum albumin (m.w. 67 kDa) (1), ovalbumin (m.w.
43 kDa) (2), chymotrypsinogen (m.w. 25 kDa) (3), ribonuclease A (m.w. 13.7 kDa) (4).
$����(�� � �������������'����'�������������������������������'�� ��������
��������������������������)���������������*!+���������������,����������
�����������*)+��
The binding assay and the CTLL-2 cell proliferation assay were performed as described in
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
32
“Materials and Methods”. ���, N26Q mutated IL-2; ���, wild type IL-2;����,
N26D mutated IL-2; ∆∆, E67Q mutated IL-2; ���, E15D mutated IL-2; ���, L19D
mutated IL-2; ���, L21D mutated IL-2; ◊�◊, G27A mutated IL-2; ♦�♦, N30D
mutated IL-2. Results are means of three experiments (standard deviations were less than
5 %).
$����-�� � ������������������ �������������� ������������������������
�����������������
03�0�������������������������@��������������"������*��1�����
!�������1!"�)$���+�����.���������A������������������3� � #������������
���0���&�������.���������������������������3�@��:-��0� :5��1�6������@��6:��
.���������������@��'�������������������3�
"3�0������������������@��������������������������������.�����
.�������������������1!"�)$���+3� � �@���������.��������<���������
��������������)α+�� ���)β+��������A�����)γ+3� � #��0���&����������.��3�
�
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
Table 2. Yields of dimer in wild-type [35S]rhIL-2 and eight [35S]rhIL-2 muteins.
Protein Yield of dimer (dpm) a % ratio
IL-2 1.21 �106 � 6.30 � 104 b 100
E15D 2.12 �105 � 1.10 � 104 17.0
L19D 9.50 �104 � 4.80 � 102 7.9
L21D 0 0
N26D 1.25 �106 � 6.10 � 104 103
N26Q 1.19 �106 � 5.60 � 104 98
G27A 0 0
N30D 1.81 �105 � 9.08 � 103 14.9
E67Q 1.30 �106 � 6.20 � 104 107
Each result was obtained from one reaction of in vitro transcription and translation using 2.5 µg of
plasmid DNA template, 200 µl of lysate, and 200 µCi of [35S]methionine. Following the reaction,
the dimeric form of each IL-2 was recovered by Superose 12 column chromatography. a % ratio was calculated as [dimer of mutated IL-2 (dpm)] / [dimer of wild-type IL-2 (dpm)] b Standard deviations were calculated from 5 independent experiments.
by guest on March 4, 2018 http://www.jbc.org/ Downloaded from
Table 3. Inhibition of mutated [35S]rhIL-2 binding to plates coated
with ribonuclease B by oligomannosyl derivatives
Concentration for 50% inhibition
Compounds N26Q N26D
M5 0.2µM 0.2µM
M6 0.2µM 0.2µM
M7 >1mM >1mM
M8 >1mM >1mM
M9 >1mM >1mM
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
2 030
40
O
.
D
.
(
5
9
5
n
m
)O
.
D
.
(
5
2
5
n
m
)R
a
d
i
o
a
c
t
i
v
i
t
y(
d
p
m
×
1
0-
4 ) 0 . 2
0 . 10
0 . 2
0 . 10
0 . 2
0 . 10 210
21
43
5V
oO
.
D
.
(
5
2
5
n
m
)ABCD
F i
g
.
1
by guest on March 4, 2018 http://www.jbc.org/ Downloaded from
A
0
1
2
3
B
[3
5S
]
r
h
I
L
-
2
(
d
p
m
×
1
0-
5/
m
l
)
Concentration (M)
1 0 1
0 1
0 1
0 1
0
100
5 0
0
1 2 3 4
- 6 -
5- 7- 8-
9
R a
d
i
o
a
c
t
i
v
i
t
y
(
d
p
m
×
1
0-
3
)
I n h
i
b
i
t
i
o
n
(
%
)
M5M6
M9
M3
F
i
g
.
2
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
1 2 3 4
wild type1
0
0
1
0
1
A
B
C
E15D
L19D
D
E
F
L21D
N26D
N26Q
20 30 40
G
E67Q
20 30 4020 30 40
G27A
N30DH
I
0 0
Time (min)
Fig. 3
1 2 3 4 1 2 3 4
by guest on March 4, 2018 http://www.jbc.org/ Downloaded from
1 2 3 4
2
4
6
E
6
7
Q
N26Q
N26D
1 .
0
0.5
0
O .
D
.
(
5
2
5
n
m
)
B
A
[35S]rhIL-2 (pM)
502 512
0
6.23 .
01
.
50.
7
50
.
3
7
wild type
[3
5S
]
r
h
I
L
-
2
(
d
p
m
×
1
0-
5/
m
l
)
R a
d
i
o
a
c
t
i
v
i
t
y
(
d
p
m
×
1
0-
3
)
N
2
6
Q
N
2
6
D
w
i
l
d
t
y
p
e
E
6
7
Q
F
i
g
.
4
◆◆◆◆ ◇◇◇◇ ◇◇◇◇◇◇◇◇ ◇◇◇◇◆◆◆◆ ◆◆◆◆ ◆◆◆◆
◇◇◇◇◇◇◇◇ ◇◇◇◇ ◇◇◇◇ ◇◇◇◇ ◇◇◇◇ ◇◇◇◇◆◆◆◆ ◆◆◆◆ ◆◆◆◆ ◆◆◆◆ ◆◆◆◆ ◆◆◆◆ ◆◆◆◆
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from
Keiko Fukushima, Sayuri Hara-Kuge, Hiroko Ideo and Katsuko YamashitaCarbohydrate recognition site of interleukin-2 in relation to cell proliferation
published online June 4, 2001J. Biol. Chem.
10.1074/jbc.M102789200Access the most updated version of this article at doi:
Alerts:
When a correction for this article is posted•
When this article is cited•
to choose from all of JBC's e-mail alertsClick here
by guest on March 4, 2018
http://ww
w.jbc.org/
Dow
nloaded from