1 CA García Sepúlveda MD PhD Bioquímica de los Acidos Nucleicos Laboratorio de Genómica Viral y Humana Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de San

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CA García Sepúlveda MD PhD

Bioquímica de los Acidos Nucleicos

Laboratorio de Genómica Viral y HumanaFacultad de Medicina, Universidad Autónoma de San Luis Potosí

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Sesión #2 Principios Generales y Bioquímica del DNA

Dogma Central de la BioMol

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Dogma Central de la BioMolLas tres direcciones generales son:

de DNA a DNA (Replicación).de DNA a RNA (Transcripción).de RNA a AA (Traducción).

* Ocurren de manera normal en la mayoría de las células.

Las tres direcciones especiales son:

de RNA a RNA (Replicación de RNA).de RNA a DNA (Retro-transcripción).de DNA a AA (Solo in vitro).

*Ocurren de manera extraordinaria, pero ocurren.

Las tres direcciones desconocidas son:

de AA a DNA (Evolución inteligente).de AA a RNA (Otra forma de evolución inteligente).de AA a AA (NOTA: priones).

* Actualmente se piensa que no ocurren nunca.

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Principios Bioquímicos

El DNA es una molécula bicatenaria (duplex), antiparalela y complementaria.

• ¿Qué es el DNA?

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Cadena #1 Cadena #2

El DNA es una molécula BICATENARIA (duplex), antiparalela y complementaria.


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5' 3'

3' 5'

El DNA es una molécula bicatenaria (duplex), ANTIPARALELA y complementaria.

Cada cadena de DNA posee un extremo 5' y otro 3' (según la orientacion de la desoxirribosa).


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A

T

G

C

A

G

C

AT

G

C

T

A

CG

T

A

C

G

TA

C

G

T

El DNA es una molécula bicatenaria (duplex), antiparalela y COMPLEMENTARIA.

Cuando no se encuentran formando parte de un duplex las cadenas aisladas de DNA se denominan

ssDNA.

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3.4 nm (34 Å)

0.34 nm (3.4 Å)

2 nm (20 Å)

Hendidura mayor y menor (ambientes topológicos distintivos que permiten interacciones proteicas diferentes).

MayorBases expuestas (TF)

MinorBases menos expuestas.


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3.4 nm (34 Å)

0.34 nm (3.4 Å)

2 nm (20 Å)

Hendidura mayor y menor (ambientes topológicos distintivos que permiten interacciones proteicas diferentes).

MayorBases expuestas (TF)

MinorBases menos expuestas.


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El DNA (al igual que el RNA) es un polímero biológico.


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Nucleótidos• Constituyen la unidad estructural del DNA y RNA

• Participan en el metabolismo formando parte de varios cofactores (CoA, flavina, nicotinamida).

• Participan en la señalización intracelular

• Formados por tres subunidades químicas

Una base nitrogenada

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Nucleótidos

Una azúcar de cinco carbonos (Pentosa)

• Constituyen la unidad estructural del DNA y RNA




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Nucleótidos

Un grupo fosfato

• Constituyen la unidad estructural del DNA y RNA




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Bases nitrogenadas

Purinas

Pirimidinas

Enlace glucosídico

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Bases nitrogenadas

1

2

34

57

8

9

6Numeración de átomos de las purinas

Anillo bencénico tiene tres C en fila

Uno de ellos tendrá cadena lateral (rama NH2 u O

2) = #6

El nitrógeno que se encuentre a lado de C6 = #1

Unidos a pentosa por N9

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Bases nitrogenadas

Numeración de átomos de las purinas

La Guanina a diferencia de la Adenina se encuentra OXIDADA

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Bases nitrogenadas

1

2

3

4

5

6

Numeración de átomos de las pirimidinas

Unidos a pentosa por N1

El carbono aledaño a N1 que esté unido a O2 será #2

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Bases nitrogenadas


La Timina y el Uracilo se distinguen de la Citosina por estar doblemente oxidados.

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Bases nitrogenadas


La Timina se encuentra Metilada mientras que el urcailo no.

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Pentosas

Las bases nitrogenadas se unen al C1 de la pentosa a través de N9 (purinas) o N1 (pirimidinas).

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Pentosas

La numeración de los átomos de la

pentosa toma en cuenta que el carbono

#5 siempre se encuentra fuera de la

estructura cíclica.

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Pentosas

Para distinguir la numeración de los

átomos de las bases de aquella de los

átomos de las pentosas se usa el

símbolo prima (') para las PENTOSAS.

Su orientación indica la polaridad de una cadena de ácido nucleíco 5´ vs 3´.

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Pentosas

C2' puede estar oxidado o reducido (desoxidado).

El tipo de pentosa distingue al DNA (Acido Desoxyrribonucleico) del RNA (Acido

Ribonucleico)

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Fosfato

• Fosfato...• Se une al carbono 5' de la pentosa• También es responsable de una dicotomía en la nomenclatura.

Un grupo fosfato

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Fosfato

• Fosfato...• Se une al carbono 5' de la pentosa • También es responsable de una dicotomía en la nomenclatura.

NucleósidoNucleótido

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Nomenclatura correcta

Base nitrogenada Nucleósidos Nucleótidos

Adenina (A) Adenosina (A) Adenosimonofosfato (AMP)

Guanina (G) Guanosina (G) Adenosindifosfato (ADP)

Citosina (C) Citidina (C) Adenosintrifosfato (ATP)

Timina (T) Timidina (T)

Los nucleósidos y nucleótidos mencionados corresponden a los del RNA, la nomenclatura en DNA es:

Desoxiadenosina = dADesoxiadenosinmonofosfato = dAMP

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Fosfatos

• Fosfatos y enlaces fosfodiester = Polimerización de ácidos nucléicos

El fosfato del extremo 5' de un nucleótido forma enlaces fosfodiester con el carbón 3' de un nucleótido aledaño a través de un proceso de condensación

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Fosfatos



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Fosfatos



Esto explica la orientación o polaridad 5' y 3’ de los ácidos nucleicos.

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Fosfatos


Cada enlace fosfodiester conlleva una carga electroestática de -1 por lo cual la carga neta del polímero de nucleótidos (DNA) es negativa.

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Fosfatos

• Fosfatos y carga negativa del DNA responsable de migración electroforética.

(-)

(-)

(-) (-)

(-)(-)

(-)

(-)

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Fosfatos


Debido a que las pentosas y los fosfatos realmente solo cumplen con funciones estructurales (no son el sustrato informativo de una secuencia de DNA), se les considera como el armazon del DNA (Backbone).

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Fosfatos


Al igual que todos los polímeros, los ácidos nucleicos se encuentran polarizados.

Un andamiaje hidrofílico por fuera y un coro hidrofóbico por dentro.

Inevitablemente esta distribución topológica de características provoca interacciones interesantes....APAREAMIENTO DE BASES.

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Apareamiento de bases

• Puentes de hidrógeno, Complementariedad, Desnaturalización e Hibridización.

Los nucleótidos polimerizados del ssDNA tendrán expuestos átomos de H y O... Termodinamicamente muy inestable.

Estos átomos dan lugar a puentes de hidrógenos (NO COVALENTES) entre algunas bases.

Solamente algunas bases son compatibles:COMPLEMENTARIEDAD.

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Al combinar los hallazgos de Chargaff que nos decían que A = T y que G=C con las mediciones cristalográficas de Franklin y Wilkins y el modelo de Watson y Crick sabiamos que solo algunas combinaciones de bases eran posibles.

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...y así es como sabemos que la A se aparea con la T y que la G con la C...

Que entre la A y la T se dan dos puentes de hidrógeno.

Que entre la G y la C se dan tres puentes de hidrógeno.

Apareamiento clásico de bases Watson-Crick.

Por ello la G y la C se consideran interacciones S (strong), mientras que la A y la T se consideran interacciones W (weak).

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Los puentes de hidrógeno individuales son muy debiles pero su poder acumulado hacen del DNA la molécula ideal para almacenar información y perpetuarla.

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Enlaces no-covalentes: Puentes de hidrógeno

• Breviario cultural

Four Main Types of Noncovalent Interactions in Cells:

Hydrogen Bond (H-Bonds): Specialized polar interaction where the positive hydrogen (H) atom is partially

shared by two negative atoms. Hydrogen (H) is a proton that is partially dissociated from the donor atom so it

can be shared with a second acceptor atom:

H bonds: Properties and Characteristics:

individual H-bonds are very weak

~ 1/20th the strength of covalent bond

multiple H-bonds together are strong

highly directional; strongest when atoms

are arranged in a straight-line.

Water weakens H-bonds by forming

competing H-bonds.

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Enlaces no-covalentes: Iónicos



Ionic bonds: Electrostatic interactions between atoms of opposite charge (+) and (- ); Ionic bonds are formed

by atoms that can fill outer shell by transferring electrons from another atom, instead of sharing electrons.

Water molecules “cluster” to orient around fully charged ions and polar groups that contain permanent dipoles, this reduces the attraction between oppositely charged ions or polar groups: Water significantly decreases ionic interactions.

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Enlaces no-covalentes: Atracciones VdW



(3) Van der Waals attractions: Fluctuation of the electron cloud around any nonpolar atom forms a transient

dipole that induces an opposite transient dipole in a nearby atom, causing a very weak attraction between the

atoms.

Two macromolecules with complementary molecular surfaces can bind together very tightly as a result of multiple, weak noncovalent interactions, which together have a very large effect(s). (Van der Waals forces are not weakened by water).

Fig 2-16 Macromolecules bind together very tightly if they have

matching complementary surfaces that interact through multiple

noncovalent bonds. This is critical for biological interactions

between proteins!

In the figure, the plus (+) and minus (-) signs mark chemical

groups that can attract each other if opposite charges are aligned

in pairs (+) (- ) in close proximity.

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Enlaces no-covalentes: Attracción Hidrófoba



(4) Hydrophobic forces:

Water lattice: Water molecules join together transiently via H-

bonds; even at 37C (98F) ~15% of water molecules are joined

to four other water molecules in an H-bonded water network

(lattice). This causes water molecules to have a cohesive

property resulting in high surface tension, etc.

Water forces hydrophobic groups together because clustering

the hydrophobic groups reduces the

disruptive effects on H-bonded water network (lattice).

Repulsion from water results in attraction between hydrophobic

groups called hydrophobic bonds.

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Enlaces covalentes: Fosfodiester

Hydrogen bonds areNOT COVALENT

Why is this biologically important?

Enlace covalente: se forma cuando dos átomos se aproximan lo suficiente como para compartir electrones.

Single bond: one electron from each of the two atoms is shared

Double bond: four electrons are shared

Fig 2-8 Covalent bonds have a defined spatial arrangement of atoms.

Fig 2-9 Covalent double bonds restrict rotation around bonds between atoms.

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Enlaces covalentes: Polares


Fig 2-10 Water is polar; Oxygen is nonpolar

Fig 2-12 Water molecules: (A) line drawing, (B) ball and stick model, (C) spacefill shows geometry of molecule and the van der Waals radii

Polar bond: A covalent bond, where one of the atoms has a higher attraction for the electrons in the bond than the other atom. The bond is polar: one end slightly negatively charged and the other end slightly positively charged.

Example Water: Overall charge on water molecule is neutral (#electrons = #protons) but the electrons are asymmetrically distributed, so the water molecule is polar. Oxygen pulls electrons away from the hydrogen nuclei leaving a small net positive charge. Excess of electrons on the oxygen atom creates a small net negative charge at opposite side.

small net (-) negative charge

Small net (+) positive charge

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• Geometria de las bases Watson-Crick apareadas

Buckle

Coplanar Propeller twist ()

Buckle ()

Helical twist (Ω)

Roll (twist coplanar)

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Coplanar

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Propeller twist ()

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Buckle ()

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Helical twist (Ω)

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Roll (propeller coplanar)

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Conformaciones

La conformación del enlace entre las bases nitrogenadas y la pentosa es responsable de estas diferencias (enlace glucosídico).

Dos conformaciones de la pentosa (C2' endo o C3' endo) dictan angulos del enlace glucosídico diferentes (anti y syn, respectivamente) y con ello el acercamiento (0.5 nm) o distanciamiento (0.7 nm) del armazón (grupos fosfato unidos a la pentosa).

Anti – Avion

Syn - Soldado

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Conformaciones

La conformación del enlace entre las bases nitrogenadas y la pentosa es responsable de estas diferencias (enlace glucosídico).

Dos conformaciones de la pentosa (C2' endo o C3' endo) dictan angulos del enlace glucosídico diferentes (anti y syn) y con ello el acercamiento (0.5 nm) o distanciamiento (0.7 nm) del armazón (grupos fosfato unidos a la pentosa).

Anti – Avion

Syn - Soldado

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Conformaciones

• A DNA, B DNA & Z DNA

La estructura tridimensional del DNA fue propuesta por Watson & Crick en base a los hallazgos cristalográficos de Franklin y Wilkins en 1953.

La conformación clásica del DNA propuesta por Watson & Crick consiste en dos cadenas polinucleotídicas antiparalelas y complementarias en forma de helice alfa (sentido antihorario de 5' a 3').

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Conformaciones

No obstante, cambios conformacionales de la pentosa modifican el marco estructural del DNA y con ello la orientación de las bases nitrogenadas.

Tres conformaciones para el DNA: A, B y Z

Conformación B es la típica de Watson & Crick y la más común in vivo.

Conformación A ocurre cuando el DNA está deshidratado.

La Conformación Z ocurre como consecuencia de ciertas secuencias de bases, ricas en AT y secuencias repetitivas de telomeros y centromeros.

• A DNA, B DNA & Z DNA

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Conformaciones

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Conformaciones

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Conformaciones

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Conformaciones

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Conformaciones

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Conformaciones

Propeller twist ()

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Conformaciones

Anti

Syn

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Conformaciones

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DNA-A

A

B

• Conformación de pentosa en C3’-endo lleva a syn y a que los dos grupos fosfato se aproximen (a 0.59 nm).

• Las bases nitrogenadas se encuentran bajo torsión y a 0.5 nm del eje de la hélice.

• Los escalones separados por 0.256 nm en vez de 0.34 nm.

• Hélice es más ancha y posee 11 bases por cada vuelta de 360°.

• Hendidura mayor (M) es profunda pero angosta.

• Hendidura menor (m) es ancha y superficial.

• Conformación usual para cadenas de RNA e hibridos DNA-RNA.

• Conformación usual en fragmentos de DNA cortos.

m

M

Coro axial

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DNA-B

m

M

A

B

• Estructura cristalográfica de Franklin & Wilkins.

• Conformación de pentosa en C2'-endo lleva a que las bases nitrogenadas se encuentren más relajadas y pucker en anti.

• Grupos fosfato lejos uno del otro (0.7 nm).

• 10.4 o 10.5 bases por giro de 360°.

• Rotación hacia la derecha en sentido 5’ - 3'.

• Escalones de bases separados por 0.34 nm.

• Hendiduras M y m más accesibles a proteinas.

• Bases no torsionadas y perpendiculares al eje molecular.

• Permite libertad de flexión de 15° (muy util si uno quiere compactar el DNA).

• Conformación fisiologica de DNA

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DNA-Z

• Helice con giro a la izquierda en sentido 5' - 3'.

• Presente in vivo cuando existe la secuencia apropiada y una tensión superhelicoidal correspondiente.

• Hélice más delgada y elongada que A o B (12 bases por giro 360°).

• M imperceptible.

• M angosta.

• Conformación favorecida ante altas concentraciones de sales, con algunas substituciones de bases y cuando la secuencia posee alternaciones purina- pirimidina.

• Bases casi perpendiculares al eje molecular.

• Distancias entre grupos fosfato variables.

• Eje central de molécula inaccesible.

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Apareamiento no-clasico de bases

• Apareamiento alternativo

A.T Watson-Crick A.A N1-amino symmetricG.C Watson-Crick A.C Reverse WobbleA.U Watson-Crick A.A N7-amino symmetricG.U Wobble G.G N1-carbonyl symmetricA.U Reverse Hoogsteen G.G N3-amino symmetricA.C Reverse Hoogsteen G.G N1-carbonyl,N7-aminoSheared G.A G.A N7-N1 amino-carbonylG.A imino A.G N3-amino,amino-N1A.A.N7-amino C.C N3-amino symmetricG.G.N7-imino U.U 4-carbonyl-imino symmetricU.U imino-carbonyl U.U 2-carbonyl-imino symmetricU.C 4-carbonyl-amino U.C 2-carbonyl-aminoA.U Reverse Watson-CrickG.C Reverse Watson-CrickG.U Reverse WobbleG.C N3-amino,amino-N3 A.U Hoogsteen

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A.T Watson-Crick A.A N1-amino symmetricG.C Watson-Crick A.C Reverse WobbleA.U Watson-Crick A.A N7-amino symmetricG.U Wobble G.G N1-carbonyl symmetricA.U Reverse Hoogsteen G.G N3-amino symmetricA.C Reverse Hoogsteen G.G N1-carbonyl,N7-aminoSheared G.A G.A N7-N1 amino-carbonylG.A imino A.G N3-amino,amino-N1A.A.N7-amino C.C N3-amino symmetricG.G.N7-imino U.U 4-carbonyl-imino symmetricU.U imino-carbonyl U.U 2-carbonyl-imino symmetricU.C 4-carbonyl-amino U.C 2-carbonyl-aminoA.U Reverse Watson-CrickG.C Reverse Watson-CrickG.U Reverse WobbleG.C N3-amino,amino-N3 A.U Hoogsteen

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A.T Watson-Crick A.A N1-amino symmetricG.C Watson-Crick A.C Reverse WobbleA.U Watson-Crick A.A N7-amino symmetricG.U Wobble G.G N1-carbonyl symmetricA.U Reverse Hoogsteen G.G N3-amino symmetricA.C Reverse HoogsteenG.G N1-carbonyl,N7-aminoSheared G.A G.A N7-N1 amino-carbonylG.A imino A.G N3-amino,amino-N1A.A.N7-amino C.C N3-amino symmetricG.G.N7-imino U.U 4-carbonyl-imino symmetricU.U imino-carbonyl U.U 2-carbonyl-imino symmetricU.C 4-carbonyl-amino U.C 2-carbonyl-aminoA.U Reverse Watson-CrickG.C Reverse Watson-CrickG.U Reverse WobbleG.C N3-amino,amino-N3 A.U Hoogsteen

A:U1 y 6 en WC versus 6 y 7 en Hg

1

6

7

6

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Tetradas y Quadraplex

• Otras conformaciones del DNA (Tetra/Quadruplex)

• DNA del 5to Elemento.

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Tetradas y Quadraplex

A.- Tetradas de Guanina en arreglo planar unidos por puentes de hidrógeno tipo Hoogsten.

B.- Quadraplex de Guanina (cuadraplex-G) en arreglo paralelo de 4 cadenas distintas de DNA.

C.- Quadraplex-G intermolecular formado entre 2 cadenas de DNA ricas en repeticiones de Guanina formando una asa (hairpin).

D.- Quadraplex-G intramolecular entre regiones ricas en Guanina de la misma molécula formando dos asas antiparalelas.

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Implicaciones prácticas

La conformación del DNA afecta a las propiedades fisico-químicas de la molécula y por ende el tipo de interacciones que pueden ocurrir.

Ejemplo: Proteína (tonos de azul) unida al promotor de Interferón Beta (rojo) con especificidad por la hendidura menor (TIP: Esto solo ocurre con el DNA-B nunca en el DNA-A ni a DNA-Z).

Inferencia....la modulación de la conformación del DNA definitivamente tiene repercusiones funcionales.

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Implicaciones prácticas

Otro ejemplo...

Unión dependiente de conformación de una proteína CRO 434 (Helix Turn Helix Motif en verde) a una secuencia de DNA (operador OR1 del bacteriófago 434 en rojo).

Reconocimiento específico de hendidura mayor.

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Resúmen

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