8/12/2019 03 Bradshaw Et Al Food PH Bacteria

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E f f e c t s o f C a r b o h y d r a t e P u l s e s a n d pH o n P o p u l a t i o n S h i f t sw i t h i n O r a l M i c r o b i a l C o m m u n i t i e s i n v i t r oD . J . BRADSHAW, A . S . McKEE, a n d P . D . MARSHP a t h o l o g y D i v i s i o n , PHLS C e n t r e f o r A p p l i e d M i c r o b i o l o g y a n d R e s e a r c h , P o r t o n D o w n , S a l i s b u i y , W i l t s h i r e S P 4 O J G , E n g l a n dA m i x e d c u l t u r e c h e m o s t a t s y s t e m was u s e d t o d i s t i n g u i s h b e t w e e n t h ee f f e c t s o f c a r b o h y d r a t e a v a i l a b i l i t y pe r se a n d t h e l o w p H g e n e r a t e df r o m c a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s m o t h e p r o p o r t i o n s o f b a c t e r i a w i t h i nm i c r o b i a l c o m m u n i t i e s . N i n e o r a l b a c t e r i a were grown a t pH 7 a n dp u l s e d w i t h g l u c o s e on t e n c o n s e c u t i v e d a y s . I n one c h e m o s t a t , t h epH w sm a i n t a i n e d a u t o m a t i c a l l y a t 7 t h r o u g h o u t t h e e x p e r i m e n t a lp e r i o d , w h i l e i n t h e o t h e r , p H c o n t r o l was d i s c o n t i n u e d f o r s i x h o u r sa f t e r e a c h p u l s e . G l u c o s e p u l s e s a t n e u t r a l pH h a d l i t t l e e f f e c t on t h ec o m p o s i t i o n o f t h e m i c r o f l o r a . O n l y t h e p r o p o r t i o n s o f A . v i s c o s u sa n d V . d i s p a r i n c r e a s e d ; L . c a s e i a n d S . mutans r e m a i n e d a t l o wl e v e l s ( 0 . 2 a n d 1 . 0 o , r e s p e c t i v e l y ) . A c e t a t e a n d p r o p i o n a t e weret h e p r e d o m i n a n t e n d - p r o d u c t s o f m e t a b o l i s m ; l a c t a t e l e v e l s we r e l o w .I n c o n t r a s t , w h e n pH was a l l o w e d t o f a l l a f t e r e a c h g l u c o s e p u l s e ,t h e c o m p o s i t i o n o f t h e m i c r o f l o r a a l t e r e d d r a m a t i c a l l y . T h e amountso f L . c a s e i a n d S . mutans i n c r e a s e d b o t h a s a p r o p o r t i o n o f t h e t o t a lcount a n d i n a b s o l u t e n u m b e r s , a s d i d V . d i s p a r , w h e r e a s t h e amountso f t h e o t h e r G r a m - n e g a t i v e o r g a n i s m s ( B . i n t e r m e d i u s , F . n u c l e a t u m ,a n d N . s u b f l a v a ) a n d S . s a n g u i s were c o n s i d e r a b l y r e d u c e d . L a c t a t ef o r m e d a m a j o r p o r t i o n o f t h e m e t a b o l i c e n d - p r o d u c t s . S u c c e s s i v eg l u c o s e p u l s e s r e s u l t e d i n b o t h a m p l i f i e d c h a n g e s i n t h e m i c r o f l o r aand a s t e a d i l y greater r a t e a n d f i n a l e x t e n t o f a c i d p r o d u c t i o n . T h i si s i n agreement w i t h t h e r e p o r t e d s h i f t s i n t h e o r a l m i c r o f l o r a i n v i v oi n response t o f r e q u e n t c a r b o h y d r a t e i n t a k e . A n a l y s i s o f t h e d a t a s t r o n g l ys u g g e s t s t h a t th e p H g e n e r a t e d f r o m c a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s m , r a t h e rt h a n c a r b o h y d r a t e a v a i l a b i l i t y per s e , i s r e s p o n s i b l e f o r t h e w i d e l yr e p o r t e d s h i f t s i n c o m p o s i t i o n a n d m e t a b o l i s m o f t h e o r a l m i c r o f l o r ai n v i v o .J D e n t R e s 6 8 ( 9 ) : 1 2 9 8 - 1 3 0 2 , S e p t e m b e r , 1 9 8 9

I n t r o d u c t i o n .T h e f r e q u e n t c o n s u m p t i o n o f f e r m e n t a b l e d i e t a r y c a r b o h y -d r a t e s i s a s s o c i a t e d w i t h s h i f t s i n t h e b a l a n c e o f c o m p o n e n t so f t h e m i c r o f l o r a o f d e n t a l p l a q u e a n d w i t h a c h a n g e i n i t sm e t a b o l i c a c t i v i t y . S e v e r a l s t u d i e s h a v e r e p o r t e d a r i s e i n t h ep r o p o r t i o n s o f S t r e p t o c o c c u s m u t a n s a n d l a c t o b a c i l l i w i t h ac o n c o m i t a n t r e d u c t i o n i n S . s a n g u i s . T h i s i s a c c o m p a n i e d b ya s i m p l i f i c a t i o n o f t h e m e t a b o l i s m o f p l a q u e f r o m a h e t e r o f e r -m e n t a t i v e p a t t e r n t o one w h e r e m o s t c a r b o h y d r a t e i s c o n v e r t e dt o l a c t a t e ( d e S t o p p e l a a r e t at., 1 9 7 0 ; D e n n i s e t a l . , 1 9 7 5 ;S t a a t e t a l . , 1 9 7 5 ; M i n a h e t a l . , 1 9 8 5 ) . S u c h a c h a n g e i n t h em i c r o f l o r a a n d i t s m e t a b o l i s m w o u l d p r e d i s p o s e a s i t e t o d e n t a lc a r i e s ( B o w d e n e t a l . , 1 9 7 8 ) .

T h e s e p o p u l a t i o n s h i f t s i n t h e p l a q u e m i c r o f l o r a c o u l d b ed u e t o c e r t a i n s p e c i e s h a v i n g e i t h e r ( a ) a more e f f i c i e n t s y s t e mo f u p t a k e / m e t a b o l i s m o f d i e t a r y c a r b o h y d r a t e s , t h e r e b y g i v i n gt h e m a c o m p e t i t i v e a d v a n t a g e ( K e e v i l e t a l . , 1 9 8 4 ; va n d e rH o e v e n e t a l . , 1 9 8 5 a ) , or ( b ) a b e t t e r a b i l i t y t o grow i n en-v i r o n m e n t s w i t h a l o w pH ( H a r p e r a n d L o e s c h e , 1 9 8 4 ) . T h e s etwo p o s s i b i l i t i e s c a n n o t b e s e p a r a t e d i n v i v o b e c a u s e o f t h ei n e v i t a b l e c h a n g e s i n t h e pH f o l l o w i n g sug ar c h a l l e n g e s . C o n -s e q u e n t l y , we h a v e d e v e l o p e d a m i x e d c o n t i n u o u s - c u l t u r e sys-R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n D e c e m b e r 1 5 , 1 9 8 8A c c e p t e d f o r p u b l i c a t i o n A p r i l 2 5 , 1 9 8 9 T o whom c o r r e s p o n d e n c e a n d r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e a d d r e s s e dD . J . B . was s u p p o r t e d b y a g r a n t f r o m t h e M e d i c a l R e s e a r c h C o u n -c i l o f G r e a t B r i t a i n .

1 2 9 8

t e r n i n w h i c h we c a n d e t e r m i n e t h e e f f e c t s o f c h a n g e s i n s i n g l ep a r a m e t e r s o n t h e s t a b i l i t y a n d m e t a b o l i s m o f o r a l m i c r o b i a lc o m m u n i t i e s ( M c K e e e t a l . , 1 9 8 5 ) . F o r s e p a r a t i o n o f t h e e f f e c to f c a r b o h y d r a t e a v a i l a b i l i t y p e r s e f r o m t h e pH g e n e r a t e d f r o md i e t a r y s u g a r s , t h i s s y s t e m h a s b e e n p u l s e d r e p e a t e d l y w i t hg l u c o s e , a n d t h e pH e i t h e r m a i n t a i n e d t h r o u g h o u t a t 7 o r a l -l o w e d t o c h a n g e a f t e r e a c h p u l s e a s a r e s u l t o f b a c t e r i a l m e -t a b o l i s m .M a t e r i a l s a n d m e t h o d s .

B a c t e r i a l s t r a i n s a n d i n o c u l a t i o n s . -The b a c t e r i a u s e d i nt h e c o n t i n u o u s - c u l t u r e s y s t e m w e r e S t r e p t o c o c c u s m u t a n s R 9( a h u m a n p l a q u e i s o l a t e ) , S . s a n g u i s NCTC 7 8 6 5 , S . m i t i o rE S 1 8 6 , L a c t o b a c i l l u s c a s e i AC 4 1 3 , A c t i n o m y c e s v i s c o s u sWVU 6 2 7 , N e i s s e r i a s u b f l a v a A 1 0 7 8 , V e i l l o n e l l a d i s p a r ATCC1 7 7 4 5 , B a c t e r o i d e s i n t e r m e d i u s T 5 8 8 , a n d F u s o b a c t e r i u m n u -c l e a t u m ATCC 1 0 9 5 3 . T h e b a c t e r i a w e r e g r o w n i n p u r e c u l t u r eo n b l o o d a g a r ; r e p r e s e n t a t i v e c o l o n i e s o f e a c h o f t h e n i n e o r -g a n i s m s w e r e p o o l e d a n d d i s p e r s e d i n a s e r u m - b a s e d t r a n s p o r tf l u i d ( B o w d e n a n d H a r d i e , 1 9 7 1 ) . A l i q u o t s ( 0 . 5 m L ) o f t h em i x t u r e w e r e d i s p e n s e d i n t o c r y o t u b e s ( N u n c , J e n c o n s S c i -e n t i f i c L t d , L e i g h t o n B u z z a r d , E n g l a n d ) a n d s t o r e d i n t h e g a sp h a s e a b o v e l i q u i d n i t r o g e n . T h e c o n t e n t s o f a c r y o t u b e w e r ed i s p e r s e d i n 1 0 m L o f p r e - r e d u c e d BM m e d i u m ( S h a h e t a l . ,1 9 7 6 ) , a s m o d i f i e d b y McKee e t a l . ( 1 9 8 5 ) , a n d u s e d t o i n -o c u l a t e t h e c h e m o s t a t ( B r a d s h a w e t a l . , 1 9 8 9 ) .C h e m o s t a t g r o w t h c o n d i t i o n s . T h e m i x e d c u l t u r e w a s g r o w ni n a n LH 5 0 0 s e r i e s I I m o d u l a r c h e m o s t a t ( L H E n g i n e e r i n g ,S t o k e P o g e s , E n g l a n d ) , w i t h a w o r k i n g v o l u m e o f 5 0 0 m L ,o p e r a t e d a t 3 7 0 C u n d e r a g a s p h a s e o f 5 ( v / v ) C O 2 i n n i t r o -g e n , a t a d i l u t i o n r a t e o f 0 . 1 / h ( t h i s c o r r e s p o n d s t o a m e a nc o m m u n i t y g e n e r a t i o n t i m e o f 6 . 9 h ) . T h e g r o w t h m e d i u m w a sm o d i f i e d BM ( M c K e e e t a l . , 1 9 8 5 ) , d i l u t e d 1 / 5 i n d i s t i l l e dw a t e r , s u p p l e m e n t e d w i t h 2 . 5 g / L h o g g a s t r i c m u c i n ( S i g m a ,P o o l e , E n g l a n d ) , a n d a d j u s t e d t o pH 7 . 5 p r i o r t o b e i n g a u t o -c l a v e d . M e t a b o l i s m o f t h e o l i g o s a c c h a r i d e s i d e - c h a i n s o f t h em u c i n p r o v i d e s c a r b o h y d r a t e s f o r b a c t e r i a l g r o w t h ( G l e n i s t e re t a l . , 1 9 8 8 ) . T h i s h a s t h e a d v a n t a g e o f g r o w i n g b a c t e r i a u n d e rn u t r i t i o n a l c o n d i t i o n s r e s e m b l i n g t h o s e f o u n d i n t h e m o u t h ,w h i l e t h e l o w c o n c e n t r a t i o n o f f r e e s u g a r s w a s i d e a l f o r t h es t u d y o f t h e e f f e c t s o f p u l s e d c a r b o h y d r a t e s . A l t h o u g h c a r b o -h y d r a t e s a r e p r e s e n t i n s o m e o f t h e m e d i u m c o m p o n e n t s , t h el e v e l o f f r e e s u g a r w a s l e s s t h a n 0 . 0 5 ( w / v ) .P u l s i n g e x p e r i m e n t s . -Two c h e m o s t a t s w e r e s e t u p a s d e -s c r i b e d a b o v e . C u l t u r e s w e r e a l l o w e d t o e s t a b l i s h f o r t e n m e a ng e n e r a t i o n t i m e s b e f o r e t h e c o m m u n i t y w a s c o n s i d e r e d t o b ei n s t e a d y - s t a t e , a n d t h e p r o p o r t i o n s o f b a c t e r i a i n t h e c u l t u r ew e r e d e t e r m i n e d ( s e e b e l o w ) . E a c h c h e m o s t a t w a s p u l s e d d a i l yw i t h 2 8 m m o l / L g l u c o s e ( f i n a l c o n c e n t r a t i o n ) o n t e n c o n s e c -u t i v e d a y s . O n e c h e m o s t a t w a s m a i n t a i n e d a t pH 7 . 0 t h r o u g h -o u t b y t h e a u t o m a t i c a d d i t i o n o f 2 m o l / L NaOH. T h i s e n a b l e du s t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f g l u c o s e a v a i l a b i l i t y p e r s e o n t h ep r o p o r t i o n s o f b a c t e r i a . I n t h e o t h e r c h e m o s t a t , pH c o n t r o l w a sd i s c o n t i n u e d a f t e r e a c h p u l s e a n d t h e pH a l l o w e d t o f i n d i t sown l e v e l o v e r a s i x - h o u r p e r i o d ; t h e pH w a s t h e n r e t u r n e d t oa n d m a i n t a i n e d a t 7 . 0 u n t i l t h e n e x t g l u c o s e p u l s e 1 8 h l a t e r .

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CARBOHYDRA TE PULSES ON MICROBIAL COMMUNITIESn i s s i m u l a t e d t h e e f f e c t o f r e p e a t e d e x p o s u r e t o c a r b o h y d r a t e sa n d t h e i n e v i t a b l e a c c o m p a n y i n g pH c h a n g e . T h e c h a n g e i np H w a s m o n i t o r e d c o n t i n u o u s l y b y m e a n s o f a BBC M a s t e rc o m p u t e r ( T e c h n o m a t i c , L o n d o n ) .V i a b l e c o u n t s . - V i a b l e c o u n t s w e r e p e r f o r m e d b e f o r e a n ds i x h a f t e r e a c h g l u c o s e p u l s e , a n d a g a i n 2 4 h a f t e r t h e f i n a lp u l s e . V i a b l e c o u n t s w e r e c a r r i e d o u t o n a r a n g e o f s e l e c t i v ea n d n o n - s e l e c t i v e m e d i a , a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( M c K e e e t

a l . , 1 9 8 5 ) , e x c e p t t h a t TYCSB ( v a n P a l e n s t e i n H e l d e r m a n e ta l . , 1 9 8 3 ) a n d CFAT ( Z y l b e r a n d J o r d a n , 1 9 8 2 ) w e r e u s e d f o re n u m e r a t i o n o f S . m u t a n s a n d A . v i s c o s u s , r e s p e c t i v e l y .S e n s i t i v i t y o f b a c t e r i a l g r o w t h t o p H . - An a s s e s s m e n t w a sm a d e o f t h e s e n s i t i v i t y t o pH o f t h e g r o w t h i n p u r e c u l t u r e o fe a c h o f t h e n i n e o r g a n i s m s . E a c h o r g a n i s m w a s g r o w n i n d u -p l i c a t e i n 2 0 m L o f m o d i f i e d BM m e d i u m ( M c K e e e t a l . ,1 9 8 5 ) a t pH 7 . 0 , 5 . 0 , a n d 4 . 5 . T h e g r o w t h a f t e r 4 8 h o f a n -a e r o b i c i n c u b a t i o n a t 3 7 0 C w a s m e a s u r e d b y c h a n g e s i n o p t i c a ld e n s i t y a t 5 40 n m . T h e e x p e r i m e n t w a s r e p e a t e d t w i c e .A n a l y t i c a l p r o c e d u r e s . - G l u c o s e a n d a c i d i c e n d - p r o d u c t s o fm e t a b o l i s m w e r e d e t e r m i n e d i n u n i n o c u l a t e d m e d i u m a n d i nc u l t u r e s u p e r n a t a n t s . T h e d r y w e i g h t a n d t u r b i d i t y ( o p t i c a l d e n -s i t y a t 5 4 0 n m ) w e r e d e t e r m i n e d d a i l y . A l l m e t h o d s w e r e a sd e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( M a r s h e t a l . , 1 9 8 3 ) .R e s u l t s .

B a c t e r i a l c o m p o s i t i o n o f c u l t u r e s . -The p r o p o r t i o n s o f t h eb a c t e r i a b e f o r e a n d a f t e r t e n g l u c o s e p u l s e s , w i t h a n d w i t h o u tpH c o n t r o l , a r e s h o w n i n T a b l e 1 . V i a b l e c o u n t s o f i n d i v i d u a lo r g a n i s m s a n d o f t h e c o m m u n i t y i n g e n e r a l p r i o r t o b e i n gp u l s e d s h o w e d a h i g h d e g r e e o f s t a b i l i t y ( F i g s . 1 a n d 2 a - d ) .T h e p r e d o m i n a n t o r g a n i s m s w e r e S . m i t i o r , S . s a n g u i s , B .i n t e n n e d i u s , a n d F . n u c l e a t u m , w h e r e a s L . c a s e i a n d S . m u -t a n s c o n s t i t u t e d o n l y 0 . 1 a n d 0 . 3 o f t h e t o t a l c u l t i v a b l em i c r o f l o r a , r e s p e c t i v e l y .When t h i s s t a b l e c o m m u n i t y w a s p u l s e d d a i l y w i t h g l u c o s eo n t e n c o n s e c u t i v e o c c a s i o n s a t a c o n s t a n t pH 7 . 0 , t h e p r o -p o r t i o n s o f t h e n i n e o r g a n i s m s w e r e l a r g e l y u n a f f e c t e d . D u r i n gp u l s i n g , t h e t o t a l v i a b l e c o u n t o f t h e c o m m u n i t y i n c r e a s e d f r o ma p p r o x i m a t e l y 3 x 1 0 8 t o 8 x 1 0 8 c f u / m L ( F i g . 1 . T h e e x c e p -t i o n s w e r e t h a t t h e l e v e l s o f A . v i s c o s u s a n d V . d i s p a r i n -c r e a s e d , w h i l e t h e p r o p o r t i o n s o f F . n u c l e a t u m a n d B .i n t e r n e d i u s d e c r e a s e d ( T a b l e 1 , a l t h o u g h t h e a b s o l u t e n u m -b e r s o f t h e l a t t e r t w o o r g a n i s m s r e m a i n e d t h e s a m e ( F i g . 2 a ) .I n c o n t r a s t , t h e c o m p o s i t i o n o f t h e c o m m u n i t y w a s m a r k e d l ya l t e r e d w h e n p u l s e d w i t h g l u c o s e i n t h e a b s e n c e o f p H c o n t r o l .TABLE 1E FF ECT O F TEN DAILY PULSES OF 2 8 m m o l / L GLUCOSE O NT HE PERCENTAGE VIABLE COUNT O F BACTERIA I N A MIXED

CULTURE WITH AND WITHOU T p H CONTROLP e r c e n t a g e V i a b l e C o u n tA f t e r T e n P u l s e s :

W i t h pH W i t h o u tB a c t e r i u m P r e - p u l s i n g C o n t r o l ( p H 7 ) pH C o n t r o lS . m u t a n s 0 . 3 1 . 0 1 8 . 9S . s a n g u i s 2 8 . 3 2 5 . 0 0 . 2S . m i t i o r 1 5 . 2 1 6 . 9 1 . 3A . v i s c o s u s 0 . 1 1 3 . 1 2 . 3L . c a s e 0 . 1 0 . 2 3 6 . 1N . s u b f l a v a 0 . 0 9 0 . 0 1 ND*V . d i s p a r 9 . 8 2 8 . 7 4 1 . 4B . i n t e r m e d i u s 3 1 . 0 5 . 6 6 x 1 0 - 4F . n u c l e a t u o m 1 5 . 2 9 . 5 2 x 1 0 -

ND = n o t d e t e c t e d .

I n t h e p e r i o d ( 6 h ) w i t h o u t pH c o n t r o l a f t e r e a c h s u c c e s s i v eg l u c o s e p u l s e , t h e t o t a l v i a b l e c o u n t o f t h e c o m m u n i t y f e l lf r o m 3 x 1 0 8 c f u / m L t o 5 x 1 0 7 c f u / m L . O r g a n i s m s t h a t h a dp r e d o m i n a t e d a t pH 7 . 0 w e r e r e d u c e d b o t h i n a b s o l u t e n u m b e r sa n d a s a p r o p o r t i o n o f t h e t o t a l c u l t i v a b l e m i c r o f l o r a ( T a b l e 1 ;F i g s . 2 a , b ) . A f t e r t e n p u l s e s o f g l u c o s e , t h e c o u n t s o f F .n u c l e a t u m a n d B . i n t e r m e d i u s ( F i g . 2 a ) w e r e r e d u c e d b y a p -p r o x i m a t e l y s e v e n o r d e r s o f m a g n i t u d e a n d t h a t o f S . s a n g u i sb y t h r e e o r d e r s o f m a g n i t u d e ( F i g . 2 b ) , w h i l e N . s u b f l a v a w a sn o t d e t e c t e d a f t e r t h e s i x t h p u l s e . C o n v e r s e l y , S . m u t a n s ( F i g .2 c ) , L . c a s e i ( F i g . 2 d ) , a n d V . d i s p a r w e r e i n c r e a s e d i n b o t ha b s o l u t e n u m b e r s a n d , e v e n m o r e m a r k e d l y , a s a p e r c e n t a g eo f t h e t o t a l v i a b l e c o u n t ( T a b l e 1 ) , c o m p r i s i n g 1 8 . 9 , 3 6 . 1 ,a n d 4 1 . 4 , r e s p e c t i v e l y , o f t h e c o m m u n i t y a f t e r t e n g l u c o s ep u l s e s . T h e i n c r e a s e s i n S . m u t a n s ( F i g . 2 c ) a n d d e c r e a s e s i nB . i n t e r m e d i u s ( F i g . 2 a ) , S . s a n g u i s ( F i g . 2 b ) , a n d F . n u c l e a -t u r m w e r e a m p l i f i e d w i t h e a c h s u c c e s s i v e p u l s e . T h e r a t i o o fS . m u t a n s i S . s a n g u i s a f t e r t e n g l u c o s e p u l s e s c h a n g e d f r o m0 . 0 4 i n t h e c o m m u n i t y m a i n t a i n e d a t pH 7 t o > I 0 0 . 0 w h e npH c o n t r o l w a s d i s c o n t i n u e d .T h e c h a n g e i n b a c t e r i a l p r o p o r t i o n s a f t e r c u l t u r e s w e r e p u l s e dw i t h g l u c o s e w i t h o u t pH c o n t r o l r e f l e c t e d , t o s o m e e x t e n t , t h ea b i l i t y o f s p e c i e s t o g r o w a t l o w pH ( T a b l e 2 ) . L . c a s e a n dV . d i s p a r g r e w w e l l a t a c o n s t a n t pH 5 . 0 i n p u r e c u l t u r e ;s i m i l a r l y , S . m u t a n s g r e w b e t t e r t h a n S . s a n g u i s a t a c o n s t a n tpH 4 . 5 . O r g a n i s m s t h a t g r e w p o o r l y , o r n o t a t a l l , d u r i n gp u l s i n g w i t h o u t pH c o n t r o l ( e . g . , N . s u b f l a v a , F . n u c l e a t u m )a l s o g r e w p o o r l y i n p u r e c u l t u r e a t pH 5 . 0 a n d 4 . 5 ( T a b l e s 1a n d 2 ) .M e t a b o l i s m o f c u l t u r e s . - D i f f e r e n c e s i n t h e p a t t e r n o f m e t -a b o l i c e n d - p r o d u c t s w e r e a l s o d e t e c t e d b e t w e e n t h e c o m m u -n i t i e s p u l s e d w i t h g l u c o s e , w i t h a n d w i t h o u t pH c o n t r o l . I n t h ec u l t u r e m a i n t a i n e d a t p H 7 . 0 t h r o u g h o u t , t h e p r e d o m i n a n t a c i d i cm e t a b o l i c p r o d u c t s w e r e a c e t a t e a n d p r o p i o n a t e ; g l u c o s e a n dl a c t a t e w e r e d e t e c t e d o n l y i n l o w c o n c e n t r a t i o n s ( < 1 m m o l / L )s i x h a f t e r e a c h p u l s e ( T a b l e 3 . I n c o n t r a s t , i n t h e c u l t u r ew i t h o u t pH c o n t r o l , a m a j o r p r o d u c t w a s l a c t a t e ; a f t e r s o m el a t e r p u l s e s , o n l y a p p r o x i m a t e l y 60 o f t h e g l u c o s e w a s u t i -l i z e d w i t h i n t h e s i x - h o u r p e r i o d w i t h o u t pH c o n t r o l ( T a b l e 3 ) .I n t h e c h e m o s t a t p u l s e d w i t h o u t pH c o n t r o l , t h e r a t e a n d

1 0 1 P r e - p u l s e

9 --IE

L I -U 8 -0

7 -

P U L S E1 0v v 9 v 7 v v 9 a w v

-3 5 1 0D A YF i g . 1 -The t o t a l l o g , , , v i a b l e c o u n t ( c f u / m L ) o f t h e m i c r o b i a l com-m u n i t y w h e n p u l s e d o n t e n c o n s e c u t i v e d a y s ( v ) w i t h 2 8 m m o l / L g l u c o s e .T h e c o m m u n i t y was e i t h e r m a i n t a i n e d t h r o u g h o u t a t p H 7 L I , o r t h e p Hw a s a l l o w e d t o f a l l f o r s i x h f o l l o w i n g e a c h p u l s e ( X ) b e f o r e b e i n g r e t u r n e dt o n e u t r a l i t y f o r 1 8 h p r i o r t o t h e n e x t p u l s e . V i a b l e c o u n t s p r i o r t o p u l s i n ga r e a l s o s h o w n .

6

V o l . 6 8 N o . 9 1 2 9 9

T v V I v I V V I

I

8/12/2019 03 Bradshaw Et Al Food PH Bacteria

3/5

1 3 0 0 Ia )

9 P r e - p u l s e8

7

j 6 -5 -32t n0 4-

1-3C)

J D e n t R e s S e p t e m b e r 1 9 8 9P u l s e 1 0

b )9-

8 -

- J E 7 -I

500-J

5

4 - 1DAY -3

P r e - p u l s e IS

P u l s e1 01 7 9 I F e7 V 9 1

S . s a n g u i s

0 5 1 0D A Y

d P u l s e

1 0

P r e - p u l s e P u l s e

1 0D A Y D A YF i g . 2 - L o g , ) v i a b l e c o u n t ( c f u / m L ) o f a B . i n t e r m e d i u s , b S . s a n g u i s , c S . m u t a n s , a n d d L . c a s e i w i t h i n a m i c r o b i a l c o m m u n i t y w h e n p u l s e do n t e n c o n s e c u t i v e d a y s ( V ) w i t h 2 8 m m o l / L g l u c o s e . T h e c o m m u n i t y w a s e i t h e r m a i n t a i n e d a t p H 7 ( D ) t h r o u g h o u t , o r t h e p H wa s a l l o w e d t o f a l l f o rs i x h f o l l o w i n g e a c h p u l s e ( X ) b e f o r e b e i n g r e t u r n e d t o n e u t r a l i t y f o r 1 8 h p r i o r t o t h e n e x t p u l s e . V i a b l e c o u n t s p r i o r t o p u l s i n g a r c a l s o s h o w n .

e x t e n t o f a c i d p r o d u c t i o n c h a n g e d w i t h s u c c e s s i v e g l u c o s e p u l s e s( F i g . 3 ) . T h e t i m e f o r t h e pH t o f a l l t o 5 . 0 a f t e r e a c h g l u c o s ep u l s e w a s 3 . 3 h a f t e r t h e f i r s t p u l s e , b u t b y t h e f i n a l p u l s e t h es a m e f a l l t o o k o n l y 4 5 m i n ( F i g . 3 . S i m i l a r l y , t h e h y d r o g e n -i o n c o n c e n t r a t i o n o f t h e c u l t u r e a f t e r s i x h o f g l u c o s e m e t a b -o l i s m r o s e f r o m 1 8 p w m o l / L ( p H 4 . 8 ) a f t e r p u l s e 1 t o 1 4 8 p m o l /L ( p H 3 . 8 ) a f t e r t h e f i n a l p u l s e ( F i g . 3 ) .D i s c u s s i o n .M i c r o b i a l c o m m u n i t i e s a t a s i t e a r e n o r m a l l y c h a r a c t e r i z e db y a d e g r e e o f s t a b i l i t y d e s p i t e e x p o s u r e t o r e g u l a r p e r t u r b a -t i o n s o f t h e e n v i r o n m e n t . T h i s s t a b i l i t y , w h i c h i s t e r m e d m i -c r o b i a l h o m e o s t a s i s ( A l e x a n d e r , 1 9 7 1 ) , s t e m s n o t f r o m a n yi n d i f f e r e n c e a m o n g t h e c o m p o n e n t s o f t h e m i c r o f l o r a b u t r a t h e rf r o m a d y n a m i c b a l a n c e b e t w e e n a n d a m o n g t h e i n d i v i d u a ls p e c i e s ; t h i s b a l a n c e i s m a i n t a i n e d b y m e a n s o f a s e r i e s o fm i c r o b i a l i n t e r a c t i o n s , i n c l u d i n g s y n e r g i s m a n d a n t a g o n i s m( S a n d e r s a n d S a n d e r s , 1 9 8 4 ) . H o w e v e r , i n t h e m o u t h , t h e s eh o m e o s t a t i c m e c h a n i s m s i n d e n t a l p l a q u e c a n b e d i s r u p t e d b yd i e t a r y s t r e s s e s ( M a r s h , 1 9 8 9 ) . S e v e r a l s t u d i e s o n t h e e f f e c t

o f d i e t o n t h e c o m p o s i t i o n o f t h e h u m a n o r a l m i c r o f l o r a h a v es h o w n t h a t t h e f r e q u e n t i n t a k e o f f e r m e n t a b l e c a r b o h y d r a t e sl e a d s t o a n i n c r e a s e i n t h e p r o p o r t i o n s o f S . m u t a n s a t t h ee x p e n s e o f S . s a n g u i s ) a n d L a c t o b a c i l l u s s p e c i e s ( d e S t o p p e -l a a r e t a l . , 1 9 7 0 ; D e n n i s e t a l . , 1 9 7 5 ; S t a a t e t a l . , 1 9 7 5 ; M i n a be t a l . , 1 9 8 5 ) . L i k e w i s e , S . m u t a n s c o u l d s u r p a s s e i t h e r S .s a n g u i s o r S . m i l l e d i w h e n a s u c r o s e - s u p p l e m e n t e d b a s a l d i e tw a s g i v e n t o b i - i n f e c t e d g n o t o b i o t i c r a t s , w h e r e a s t h e r e v e r s ew a s t h e c a s e w i t h b a s a l d i e t a l o n e , o r w i t h t h e b a s a l d i e t s u p -p l e m e n t e d w i t h a r g i n i n e ( v a n d e r H o e v e n e t a l . , 1 9 8 5 b ) . S i m -i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d b y B e i g h t o n a n d H a y d a y ( 1 9 8 6 ) w i t hm a c a q u e m o n k e y s f e d a h i g h - o r l o w - s u c r o s e d i e t . H o w e v e r ,i t w a s n o t p o s s i b l e f o r u s t o d e t e r m i n e f r o m a n y o f t h e s e s t u d i e sw h e t h e r t h e s e b a c t e r i a l p o p u l a t i o n s h i f t s w e r e c a u s e d b y t h eh i g h e r a f f i n i t y o f c e r t a i n o r g a n i s m s f o r c a r b o h y d r a t e s o r b yt h e g r e a t e r s e n s i t i v i t y o f c e r t a i n s p e c i e s t o t h e l o w p H g e n e r -a t e d f r o m t h e m e t a b o l i s m o f s u c h c a r b o h y d r a t e s . T h e o n l ym e a n s b y w h i c h t h e s e t w o f a c t o r s c a n b e s e p a r a t e d i s t h e u s eo f i n v i t r o m o d e l s . T h e c h e m o s t a t h a s b e e n s h o w n t o b e o fp a r t i c u l a r v a l u e i n s u c h m o d e l i n g s t u d i e s , b e c a u s e i n d i v i d u a lf a c t o r s c a n b e c o n t r o l l e d a n d c a u s e - a n d - e f f e c t r e l a t i o n s h i p s e s -

BRADSHAW e t a z l

l

8/12/2019 03 Bradshaw Et Al Food PH Bacteria

4/5

CARBOHYDRATE PULSES O N MICROBIAL COMMUNITIES

i 5 0 4

1 2 0

~~~~~~~~~~~~~> - 0 9 00 ~ ~ ~ A. 216 0

P U L S EF i g . 3-The e f f e c t o f t e n d a i l y p u l s e s o f 2 8 m m o l / L g l u c o s e o n a c i dp r o d u c t i o n b y a c o m m u n i t y o f o r a l b a c t e r i a . A c i d p r o d u c t i o n w a s e x -p r e s s e d b o t h a s t h e h y d r o g e n - i o n c o n c e n t r a t i o n g e n e r a t e d a f t e r s i x h o f

g l u c o s e m e t a b o l i s m ( U ) a n d a s t h e t i m e i n h o u r s f o r t h e c u l t u r e t o r e a c hpH 5 . 0 a f t e r e a c h g l u c o s e p u l s e ( A ) .

t a b l i s h e d . T h u s , v a n d e r H o e v e n e t a l . ( 1 9 8 5 a ) s t u d i e d t h ec o m p e t i t i o n b e t w e e n S . m u t a n s a n d S . s a n g u i s a n d b e t w e e n S .m u t a n s a n d S . m i l l e r i w h e n g r o w n i n a d e f i n e d m e d i u m i n ac h e m o s t a t a t pH 7 . 0 . T h e s e a u t h o r s c o n c l u d e d t h a t S . s a n g u i sa n d S . m i l l e r i w e r e a b l e t o s u r p a s s S . m u t a n s b e c a u s e o f t h eg r e a t e r a f f i n i t y o f t h e f o r m e r t w o o r g a n i s m s f o r g l u c o s e . S i m -i l a r l y , i n a m o r e c o m p l e x m i x e d - c u l t u r e s y s t e m , S . s a n g u i sa n d S . m i t i o r p r e d o m i n a t e d o v e r b o t h S . m u t a n s ( n o w S . s o -b r i n u s ) a n d L . c a s e a t pH 7 . 0 u n d e r g l u c o s e - l i m i t e d c o n d i -t i o n s , b u t t h e l a t t e r t w o s p e c i e s ( t o g e t h e r w i t h V . d i s p a r ) b e c a m ep r e d o m i n a n t w h e n t h e pH w a s a l l o w e d t o f a l l t o 4 . 1 ( M c -D e r m i d e t a l . , 1 9 8 6 ) . A l t h o u g h t h e l a t t e r e x p e r i m e n t d i d s e p -a r a t e t h e pH e f f e c t o f c a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s m f r o mc a r b o h y d r a t e a v a i l a b i l i t y p e r s e o n b a c t e r i a l p o p u l a t i o n s h i f t s ,t h e f a c t t h a t g l u c o s e w a s a d d e d c o n t i n u o u s l y t h r o u g h o u t t h ee x p e r i m e n t a n d t h a t t h e pH w a s a l l o w e d t o r e m a i n l o w f o r at w o - w e e k p e r i o d m e a n t t h a t t h e e x p e r i m e n t a l d e s i g n w a s u n -r e a l i s t i c , w h e n c o m p a r e d w i t h t h e i n v i v o s i t u a t i o n .I n t h e p r e s e n t e x p e r i m e n t , b a c t e r i a w e r e g r o w n o n a m i x t u r eo f m u c i n ( g l y c o p r o t e i n s ) , a m i n o a c i d s , a n d p e p t i d e s , t h e o l i -g o s a c c h a r i d e s i d e - c h a i n s o f m u c i n b e i n g t h e m a i n s o u r c e o fc a r b o h y d r a t e s f o r t h e c e l l s . T h i s i s a n a l o g o u s t o t h e g r o w t h o fb a c t e r i a i n p l a q u e ( B e i g h t o n e t a l . , 1 9 8 6 ) , w h e r e d i e t a r y c a r -b o h y d r a t e s h a v e b e e n s h o w n n o t t o a f f e c t t h e r a t e o f g r o w t ho f o r g a n i s m s , b u t t o c h a n g e m e t a b o l i c p r o d u c t s f r o m a h e t e r o -t o a h o m o f e r m e n t a t i v e p a t t e r n . T h e u n i n o c u l a t e d m e d i u m i nt h i s s t u d y h a d n e g l i g i b l e c o n c e n t r a t i o n s o f f r e e c a r b o h y d r a t e sa n d t h e r e f o r e w a s i d e a l f o r t h e s t u d y o f t h e e f f e c t s o f p u l s e so f s u g a r s .A n a l y s i s o f t h e d a t a s u g g e s t s t h a t t h e o b s e r v e d s h i f t s i n t h ep r o p o r t i o n s o f t h e p l a q u e m i c r o f l o r a i n v i v o a r e n o t c a u s e d b yt h e m e r e a v a i l a b i l i t y o f f e r m e n t a b l e c a r b o h y d r a t e s . T h e r e w a sl i t t l e o r n o c h a n g e i n t h e l e v e l s o f S . m u t a n s o r L . c a s e i w h e nt h e m i x e d c u l t u r e w a s p u l s e d w i t h g l u c o s e o n t e n o c c a s i o n s ,w h e n t h e p H w a s m a i n t a i n e d a t 7 . T h e s e t w o s p e c i e s w e r et h e r e f o r e u n a b l e t o s u r p a s s o t h e r m e m b e r s o f t h e m i c r o f l o r au n d e r t h e s e c o n d i t i o n s . T h e i n c r e a s e i n V . d i s p a r c a n b e a t -t r i b u t e d t o t h e t e m p o r a r i l y e l e v a t e d c o n c e n t r a t i o n o f l a c t a t ef o l l o w i n g e a c h p u l s e . T h e o n l y o t h e r o r g a n i s m t o i n c r e a s e

TABLE 2S E N S I T I V I T Y T O pH O F T HE GROWTH O F T HE NINEBACTERIAL S P E C I E SP e r c e n t a g e G r o w t h * i n P u r e C u l t u r e a t :

B a c t e r i u m pH 5 . 0 pH 4 . 5S . m u t a n s 4 6 . 4 1 7 . 2S . s a n g u i s 5 7 . 1 1 . 0 . m i t i o r 6 7 . 1 6 5 . 1A . v i s c o s u s 8 . 5 1 6 . 2L . c a s e i 9 6 . 2 9 9 . 6N . s u b f l a v a 3 . 1 0V . d i s p a r 7 3 . 2 8 . 9B . i n t e r m e d i u s 3 0 . 9 1 2 . 9F . n u c l e a t u m 3 . 3 2 . 4

* T h e v a l u e s a r e e x p r e s s e d a s t h e p e r c e n t a g e o f t h e g r o w t h a c h i e v e d i nBM b r o t h a t pH 7 . G r o w t h w a s m e a s u r e d a s t h e c h a n g e i n o p t i c a l d e n s i t yo f t h e c u l t u r e a t 5 4 0 nm.TABLE 3CONCENTRATIONS ( m m o l / L ) OF GLUCOSE AND METABOLICEND-PRODUCTS I N CULTURE SUPERNATANTS O F MIXEDCULTURES P ULSED W I T H 2 8 m m o l / L GLUCOSE, EITHER WITHO R WITHOUT pH CONTROL

W i t h pHC o n t r o l ( p H 7 ) W i t h o u t pHC o n t r o lA n a l y s a t e M e a n R a n g e * M e a n R a n g eA c e t a t e 1 5 1 2 - 2 0 8 3 - 2 0P r o p i o n a t e 1 5 1 0 - 2 0 1 2 3 - 1 5L a c t a t e < 1 < 1 1 0 1 - 5 5G l u c o s e < 1 < 1 - 1 . 4 4 < 1 - 1 1

* T h e r a n g e r e f l e c t s t h e c o n c e n t r a t i o n c h a n g e s b e t w e e n g l u c o s e p u l s e s1 t o 1 0 . S u p e r n a t a n t s w e r e t a k e n f o r a n a l y s i s 6 h a f t e r e a c h g l u c o s e p u l s e .

f o l l o w i n g t h e g l u c o s e p u l s e s w a s A . v i s c o s u s , s u g g e s t i n g t h a tt h i s o r g a n i s m c o u l d s u r p a s s o t h e r s a c c h a r o l y t i c s p e c i e s d u r i n gg l u c o s e p u l s e s a t pH 7 . A l t h o u g h t h e p r o p o r t i o n s o f B . i n t e r -m e d i u s a n d F . n u c l e a t u m w e r e r e d u c e d a f t e r t h e p u l s i n g , t h e i ra b s o l u t e n u m b e r s r e m a i n e d s t e a d y . T h i s i s n o t s u r p r i s i n g , s i n c eb o t h s p e c i e s a r e a s a c c h a r o l y t i c o r o n l y w e a k l y f e r m e n t a t i v e ,a l t h o u g h F . n u c l e a t u m c a n u s e g l u c o s e f o r a n a b o l i c p u r p o s e s( G h a r b i a a n d S h a h , 1 9 8 8 ) . R a t h e r , t h e s h i f t i n b a c t e r i a l p o p -u l a t i o n s a p p e a r s t o b e m e d i a t e d v i a t h e pH g e n e r a t e d f r o mc a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s m . W i t h e a c h p u l s e , t h e t e r m i n a l pHf e l l f u r t h e r a n d t h e r a t e o f a c i d p r o d u c t i o n i n c r e a s e d , a n d t h i sw a s a s s o c i a t e d w i t h a n e n r i c h m e n t o f S . m u t a n s , L . c a s e , a n dV . d i s p a r , e n a b l i n g t h e m t o b e c o m e t h e p r e d o m i n a n t s p e c i e s .I n t e r e s t i n g l y , t h e s e t h r e e s p e c i e s h a v e b e e n a s s o c i a t e d w i t hb o t h n u r s i n g c a r i e s ( M i l n e s a n d B o w d e n , 1 9 8 5 ) a n d s i t e s w i t hp r o g r e s s i v e c a r i e s ( B o y a r a n d B o w d e n , 1 9 8 5 ) . I n p u r e c u l t u r es t u d i e s , t h e s e s p e c i e s w e r e l e s s s e n s i t i v e t o g r o w t h a t c o n s t a n tl o w pH v a l u e s t h a n s o m e o f t h e o t h e r s p e c i e s w h o s e c o u n t sw e r e s e v e r e l y r e d u c e d i n t h e p u l s i n g e x p e r i m e n t s . H o w e v e r ,s o m e s p e c i e s t h a t g r e w w e l l i n p u r e c u l t u r e a t a c o n s t a n t l o wpH e . g . , S . m i t i o r , B . i n t e n n e d i u s ) w e r e i n h i b i t e d d u r i n g t h ep u l s i n g e x p e r i m e n t w i t h o u t p H c o n t r o l . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e yw e r e l e s s c o m p e t i t i v e p e r h a p s i n t e r m s o f t h e i r m e t a b o l i s mo r r a t e o f r e s p o n s e u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s o f f l u c t u a t i n g pH t h a n o t h e r s p e c i e s w i t h a s i m i l a r o v e r a l l t o l e r a n c e o f l o wp H . I t f o l l o w s t h a t i f t h e pH c h a n g e f o l l o w i n g c a r b o h y d r a t em e t a b o l i s m c o u l d b e r e d u c e d , t h e n t h e e n r i c h m e n t o f c a r i o -g e n i c s p e c i e s c o u l d b e r e t a r d e d . S i n c e t h e m o d e l s y s t e m d e -s c r i b e d h e r e i s q u a n t i t a t i v e a n d r e p r o d u c i b l e , i t w o u l d b e am e t h o d b y w h i c h s u c h a n i n t e r f e r e n c e o f a c i d p r o d u c t i o n b yi n h i b i t o r s o r s u g a r s u b s t i t u t e s c o u l d b e m o n i t o r e d a n d t h e r e -s p o n s e o f t h e o r a l m i c r o f l o r a f o l l o w e d .

V o l . 6 8 N o . 9 1 3 0 1

8/12/2019 03 Bradshaw Et Al Food PH Bacteria

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1 3 0 2 BRADSHAW e t a l .R E F E R E N C E S

ALEXANDER, M. ( 1 9 7 1 ) : M i c r o b i a l E c o l o g y , New Y o r k : J o h nW i l e y a n d S o n s , pp . 2 0 7 - 2 2 3 .BEIGHTON, D . a n d HAYDAY, H . ( 1 9 8 6 ) : The I n f l u e n c e o f t h eA v a i l a b i l i t y o f D i e t a r y F o o d on t h e G r o w t h o f S t r e pt o c o c c i on t h eM o l a r T e e t h o f M o n k e y s ( M a c a c a f a s c i c u l a r i s ) , A r c h O r a l B i o l3 1 : 4 4 9 - 4 5 4 .BEIGHTON, D . ; SMITH, K . ; a n d HAYDAY, H . ( 1 9 8 6 ) : T h e G r o w t ho f B a c t e r i a a n d t h e P r o d u c t i o n o f E x o g l y c o s i d i c E n z y m e s i n t h eD e n t a l P l a q u e o f M a c a q u e M o n k e y s , A r c h O r a l B i o l 3 1 : 8 2 9 - 8 3 5 .B O WD E N , G . H . a n d HARDIE, J . M . ( 1 9 7 1 ) : A n a e r o b i c O r g a n i s m sf r o m t h e H u m an M o u t h . I n : I s o l a t i o n o f A n a e r o b e s , D . A . S h a p -t o n a n d R . G . B o a r d , E d s . , L o n d o n : Academic P r e s s , pp . 1 7 7 -2 0 5 .BOWDEN, G . H . ; HARDIE, J . M . ; FILLERY, E . D . ; MARSH, P . D . ;a n d SLACK, G . L . ( 1 9 7 8 ) : M i c r o b i a l A n a l y s e s R e l a t e d t o C a r i e sS u s c e p t i b i l i t y . I n : P r o c e e d i n g s , Methods o f C a r i e s P r e v e n t i o n ,B . G . B i b b y a n d R . J . S h e r n , E d s . , ( S p S u p p ) M i c r o b i o l o g y Ab -s t r a c t s , L o n d o n : I n f o r m a t i o n R e t r i e v a l L t d , pp . 8 3 - 9 7 .BOYAR, R . M . a n d BOWDEN, G . H . ( 1 9 8 5 ) : T h e M i c r o f l o r a A s s o -c i a t e d w i t h t h e P r o g r e s s i o n o f I n c i p i e n t L e s i o n s i n T e e t h o f C h i l -d r e n L i v i n g i n a W a t e r F l u o r i d a t e d A r e a , C a r i e s R e s l 9 : 2 9 8 - 3 0 6 .BRADSHAW, D . J . ; M c K E E, A . S . ; a n d MARSH, P . D . ( 1 9 8 9 ) : T h eU s e o f D e f i n e d I n o c ul a S t o r e d i n L i q ui d N i t r o g e n f o r Mixed C u l -t u r e C h e m o s t a t S t u d i e s , J M i c r o b i o l M e t h 9 : 1 2 3 - 1 2 8 .

DENNIS, D . A . ; GAWRONSKI, T . H . ; SUDO, S . Z . ; HARRIS, R . S . ;a n d FOLKE, L . E . A . 1 9 7 5 : V a r i a t i o n s i n M i c r o b i a l a n d B i o -c h e m i c a l C o m p o n e n t s o f F o u r - d a y P l a q u e D u r i n g a F o u r - w e e kC o n t r o l l e d D i e t P e r i o d , J D e n t R e s 5 4 : 7 1 6 - 7 2 2 .DE STOPPELAAR, J . D . ; VAN H O UTE, J . ; a n d BAC K E R DIRKS,0 1 9 7 0 : The E f f e c t o f C a r b o h y d r a t e R e s t r i c t i o n on t h e P r e s e n c eo f S t r e p t o c o c c u s m u t a n s , S t r e p t o c o c c u s sanguis a n d l o d o p h i l i cP o l y s a c c h a r i d e - p r o d u c i n g B a c t e r i a i n H u m an D e n t a l P l a q u e , C a r -i e s R e s 4 : 1 1 4 - 1 2 3 .GHARBIA, S . E . a n d SHAH, H.N. 1 9 8 8 : G l u c o s e U t i l i z a t i o n a n dG r o w t h R e s p o n s e t o P r o t e i n H y d r o l y s a t e s b y F u s o b a c t e r i u m S p e -c i e s , C u r r M i c r o b i o l 1 7 : 2 2 9 - 2 3 4 .GLENISTER, D . A . ; SALAMON, K . E . ; SMITH, K . ; BEIGHTON,D . ; a n d KEEVIL, C.W. ( 1 9 8 8 ) : E n h a n c e d G r o w t h o f C o m p l e xC o m m u n i t i e s o f D e n t a l P l a q u e B a c t e r i a i n M u c i n - l i m i t e d C o n t i n -uous C u l t u r e , M i c r o b i o l E c o l H e a l t h D i s 1 : 3 1 - 3 8 .

HARPER, D . S . a n d LOESCHE, W . J . 1 9 8 4 : G r o w t h a n d A c i d T o l -e r ance o f H u m an D e n t a l P l a q u e B a c t e r i a , A r c h O r a l B i o l 2 9 : 8 4 3 -8 4 8 .KEEVIL, C . W . ; WILLIAMSON, M . I . ; MARSH, P . D . ; a n d ELL-W O O D , D . C . ( 1 9 8 4 ) : E v i d e n c e t h a t G l u c o s e a n d S u c r o s e U p t a k ei n O r a l S t r e p t o c o c c i I n v o l v e s I n d e p e n d e n t P h o s p h o t r a n s f e r a s e a n dP r o t o n M o t i v e F o r c e - m e d i a t e d M e c h a n i s m s , A r c h O r a l B i o l 2 9 : 8 7 1 -8 7 8 .MARSH, P . D . ( 1 9 8 9 ) : H o s t D e f e n s e s a n d M i c r o b i a l H o m e o s t a s i s :R o l e o f M i c r o b i a l I n t e r a c t i o n s , J D e n t R e s ( i n p r e s s ) .

MARSH, P . D . ; HUNTER, J . R . ; BOWDEN, G . H . ; HAMILTON,I . R . ; McKEE, A . S . ; HARDIE, J . M . ; a n d ELLWOOD, D . C .( 1 9 8 3 ) : T h e I n f l u e n c e o f G r o w t h R a t e a n d N u t r i e n t L i m i t a t i o n o nt h e M i c r o b i a l C o m p o s i t i o n a n d B i o c h e m i c a l P r o p e r t i e s o f a M i x e dC u l t u r e o f O r a l B a c t e r i a Grown i n a C h e m o s t a t , J C e n M i c r o b i o l1 2 9 : 7 5 5 - 7 7 0 .McDERMID, A . S . ; McKEE, A . S . ; ELLWOOD, D . C . ; a n d MARSH,P . D . ( 1 9 8 6 ) : T h e E f f e c t o f L o w e r i n g t h e pH o n t h e C o m p o s i t i o na n d M e t a b o l i s m o f a C o m m u n i t y o f N i n e O r a l B a c t e r i a Grown i na C h e m o s t a t , J Ge n M i c r o b i o l 1 3 2 : 1 2 0 5 - 1 2 1 4 .McKEE, A . S . ; McDERMID, A . S . ; ELLWOOD, D . C . ; a n d MARSH,P . D . ( 1 9 8 5 ) : T h e E s t a b l i s h m e n t o f R e p r o d u c i b l e , C o m p l e x Com-m u n i t i e s o f O r a l B a c t e r i a i n t h e C h e m o s t a t U s i n g D e f i n e d I n o c u l a ,J A p p l e B a c t e r i o l 5 9 : 2 6 3 - 2 7 5 .MILNES, A . R . a n d BOWDEN, G . H . ( 1 9 8 5 ) : T h e M i c r o f l o r a A s -s o c i a t e d w i t h D e v e l o p i n g L e s i o n s o f N u r s i n g C a r i e s , C a r i e s R e s1 9 : 2 8 9 - 2 9 7 .MINAH, G . E . ; SOL O M ON, E . S . ; a n d CHU, K . ( 1 9 8 5 ) : T h e A s -s o c i a t i o n B e t w e e n D i e t a r y S u c r o s e C o n s u m p t i o n a n d M i c r o b i a lP o p u l a t i o n S h i f t s a t S i x O r a l S i t e s i n M a n , A r c h O r a l B i o l 3 0 :3 9 7 - 4 0 1 .SANDERS, W . E . a n d SANDERS, C . C . ( 1 9 8 4 ) : M o d i f i c a t i o n o f N o r -m a l F l o r a b y A n t i b i o t i c s : E f f e c t s o n I n d i v i d u a l s a n d t h e E n v i r o n -m e n t . I n : New D i m e n s i o n s i n A n t i m i c r o b i a l T h e r a p y , R . K . K o o ta n d M.A. S a n d e , E d s . , New Y o r k : C h u r c h i l l - L i v i n g s t o n e , p p .2 1 7 - 2 4 1 .SHAH, H . N . ; WILLIAMS, R . A . D . ; BOWDEN, G . H . ; a n d HAR-D I E , J . M . ( 1 9 7 6 ) : C o m p a r i s o n o f t h e B i o c h e m i c a l P r o p e r t i e s o fB a c t e r o i d e s m e l a n i n o g e n i c u s f r o m Human D e n t a l P l a q u e a n d O t h e rS i t e s , J A p p l B a c t e r i o l 4 1 : 4 7 3 - 4 9 2 .STAAT, R . H . ; GAWRONSKI, T . H . ; CRESSEY, D . E . ; H A R R I S ,R . S . ; a n d FOLKE, L . E . A . ( 1 9 7 5 ) : E f f e c t s o f D i e t a r y S u c r o s eL e v e l s o n t h e Q u a n t i t y a n d M i c r o b i a l C o m p o s i t i o n o f Human D e n -t a l P l a q u e , J D e n t R e s 5 4 : 8 7 2 - 8 8 0 .

VAN DE R HOEVEN, J . S . ; DE JONG, M . H . ; CAMP, P . J . M . ; a n dVAN DE N KIEBOOM, C . W . A . ( 1 9 8 5 a ) : C o m p e t i t i o n B e t w e e nO r a l S t r e p t o c o c c u s S p e c i e s i n t h e C h e m o s t a t U n d e r A l t e r n a t i n gC o n d i t i o n s o f G l u c o s e L i m i t a t i o n a n d E x c e s s , FE M S M i c r o b i o lE c o l 3 1 : 3 7 3 - 3 7 9 .VAN DE R HOEVEN, J . S . ; DE JONG, M . H . ; a n d ROGERS, A . H .( 1 9 8 5 b ) : E f f e c t o f U t i l i z a t i o n o f S u b s t r a t e s o n t h e C o m p o s i t i o n o f

D e n t a l P l a q u e , FEMS M i c r o b i o l E c o l 3 1 : 1 2 9 - 1 3 3 .VAN PALENSTEIN HELDERMAN, W . H . ; I J S S E L D I J K , M . ; a n dHUIS I N ' T VELD, J . H . J . ( 1 9 8 3 ) : A S e l e c t i v e M e d i u m f o r t h eT wo M a j o r S u b g r o u p s o f t h e B a c t e r i u m S t r e p t o c o c c u s m u t a n s I s o -l a t e d F r o m Human D e n t a l P l a q u e a n d S a l i v a , A r c h O r a l B i o l 2 8 : 5 9 9 -6 0 3 .ZYLBER, L . J . a n d JORDAN, H . V . ( 1 9 8 2 ) : D e v e l o p m e n t o f a S e -l e c t i v e Medium f o r D e t e c t i o n a n d E n u m e r a t i o n o f A c t i n o m y c e sv i s c o s u s a n d A c t i n o m y c e s n a e s l u n d i i i n D e n t a l P l a q u e , J C l i n M i -c r o b i o l 1 5 : 2 5 3 - 2 5 9 .

J D e n t R e s S e p t e m b e r 1 9 8 9