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TÍTULO: Phytophthora: Características, diagnóstico y daños que provoca en algunos cultivos tropicales. Medidas de control.

Autor: Yamilé Echemendia Medina.

Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical.

INTRODUCCIÓN. Anualmente son considerables los gastos económicos que se producen a escala internacional por concepto de pérdidas en diversos cultivos debido al ataque de diferentes plagas y enfermedades, así como también por el uso de productos químicos destinados a prevenirlas y controlarlas. Es importante resaltar el papel que ocupan las enfermedades fungosas dentro del conjunto de afecciones que producen daños en las plantaciones, debido fundamentalmente a su diversidad y a lo difícil que resulta su control (15). Un problema fitosanitario bien reconocido lo constituyen las enfermedades causadas por los hongos del género Phytophthora, entre las cuales se destacan: en los cítricos, la podredumbre del cuello de la raíz y parte basal del tallo, la gomosis y el aguado o podredumbre marrón de los frutos, producidas fundamentalmente por P. citrophthora y P. parasitica; en el aguacatero, la pudrición de las raíces causada por P. cinnamomi y el cáncer del tronco producido al menos por tres especies de Phytophthora (P. cinnamomi, P. heveae y P. citricola); P. palmivora es la causa de la pudrición de las yemas en el cocotero, lo cual es un problema común en muchas áreas donde se practica este cultivo (Oeste de la India, América Central, Asia y las Filipinas); en el caso de la guayaba P. parasitica provoca la pudrición de los frutos, aunque también han sido aisladas P. heveae (India) y P. citricola (Hawaii); en el mango han sido reportadas dos especies de Phytophthora como agentes causales de enfermedades, como es el caso de P. heveae (India) y P. palmivora (Ivory Coast), siendo también esta última la responsable de considerables daños en el cultivo de la papaya, en varias áreas tropicales (Hawaii, Australia, Costa Rica y México) conjuntamente con P. cinnamomi (reportada en Perú) (52). Numerosos han sido las investigaciones encaminadas al estudio de las características de estas especies, su morfología y fisiología, su ubicación taxonómica, su epidemiología y medidas de control y sin embargo actualmente los hongos del género Phytophthora continúan siendo un problema fitosanitario en muchos de los cultivos tropicales anteriormente mencionados. Lo anteriormente expuesto justifica nuestro interés en desarrollar esta revisión bibliográfica la cual tiene el objetivo de resumir los antecedentes existentes en la investigación de estos patógenos y las enfermedades que provocan en algunos cultivos, sentando las bases que nos permitan proyectar investigaciones futuras, con el objetivo ampliar el conocimiento alcanzado sobre los mismos, así como el adecuado control y manejo de las enfermedades que provocan, y la posterior aplicación de los estudios que se realicen para fortalecer la agroindustria frutícola en Cuba. .

RESEÑA HISTÓRICA. El género Phytophthora (del griego Phyton: planta; phthora: destructor) fue creado por de Bary en 1876 con P. infestans de Bary como especie tipo. Este investigador reconoció a dicho hongo como causante del ¨blight¨ tardío en la patata, en Europa (1840), previamente identificado como Botrytis infestans Montagne y luego como Peronospora infestans (Montagne) Caspary (18). Los primeros reportes de la presencia de Phytophthora en Cuba fueron dados a conocer por Cook y Horne en 1908, quienes la observaron en limones franceses (Citrus limon Burn), bergamotos (Citrus limettioides Tan.), naranja china (Citrus sinesis Osb.), toronja (Citrus paradisi Macf.) y limón silvestre (Citrus aurantifolia Swing. Var. “Mexicana”) que fue señalado como muy susceptible(50). Posteriormente en 1915, Fawcett dio a conocer la presencia de Phytophthora citrophthora (Sm & Sm) Leonian en la Isla de Pinos, actualmente municipio especial Isla de la Juventud y en Santiago de las Vegas, sobre tangelo (Citrus paradisi Macf. x Citrus reticulata Blanco) y toronja respectivamente(50). En 1918 Jonhston y Bruner confirmaron la presencia de P. citrophthora (Sm & Sm) Leonian y localizaron, además, P. parasitica Dastur sobre plantas citricas afectadas por gomosis(50). Cook, en 1939 definió a P. parasitica Dastur como el agente causal de la pudrición del pie y la gomosis en las plantaciones citrícolas del país (3). Sin embargo, no fue hasta 1975 que Rodríguez y Cabrera mostraron la amplia distribución de Phytophthora en Cuba, afectando distintas especies y variedades de cítricos en las cuales provocaba lesiones de gomosis en el tronco, y pudrición del pie y las raíces, sin observar ataque a los frutos. En 1977, Rodríguez y cols. identifican las cepas aisladas en las diferentes zonas del país como P. parasitica Dastur, señalando su presencia en Guantánamo, Contramaestre, Banes, Sola, Ceballos, Morón, Arimao, Motembo, Jagüey Grande, Ceiba del Agua, Tapaste, Güira de Melena, Ciudad de La Habana, Municipio especial Isla de la Juventud, Herradura y Guane (50).

CARACTERISTICAS GENERALES DEL GÉNERO Phytophthora. A.- Ubicación Taxonómica. El género Pythophthora pertenece a (45): División: Eumycota Subdivisión: Phycomycotina Clase: Oomycetes Orden: Peronosporales Subfamilia: Phythiae Género(s): Phythophthora y Pytium B.- Caracteres morfológicos generales de las especies de Pythophthora. B.1.- Micelio. Todas las especies del género poseen un micelio hialino, continuo, de paredes paralelas o irregularmente calibrado, donde pueden observarse abundantes gotas oleaginosas. El micelio es cenocítico, observándose solo raramente la presencia de algunos tabiques que normalmente se encuentran separando las partes viejas carentes de protoplasma (1,49). Existen algunas especies en las cuales, bajo ciertas condiciones de cultivo, el micelio se presenta toruloso, con protuberancias y vesículas como por ejemplo en P. cinnamomi, P. cactorum y P. cryptogea (1,49). En los medios de cultivo el micelio se presenta aéreo, el cual puede ser marcadamente radiado o ligeramente estrellado, presentándose los bordes de la colonia redondeados o sinuosos y sumergido en el medio siendo precisamente en este último en el que pueden diferenciarse las protuberancias y engrosamientos, más o menos notable (45). El micelio es capaz de vivir de forma saprófita sobre las partículas de materia orgánica del suelo en ausencia del huésped (13,16). Sin embargo según otros autores (51) existe una invasión muy pobre de la materia orgánica por parte del micelio, y el movimiento de este través del suelo es muy pequeño o nulo. Es importante señalar que en el cultivo in vitro se pueden originar variaciones del aspecto del micelio en algún sector de la colonia, las cuales pueden ser relevantes tanto macroscópica como microscópicamente en cuanto a la morfología, así como desde el punto de vista fisiológico y parasitario, debido a la posibilidad de producirse nuevas razas más virulentas (1).

Cuando las especies del género Pythophthora son cultivadas in vitro el desarrollo del micelio se ve condicionado por varios factores tales como la composición del medio, la temperatura, los nutrientes, la tensión de oxígeno y de CO2, el pH y en menor escala la luz (7,45). El tipo de medio ejerce una influencia muy importante en la velocidad de crecimiento, el cual se ve favorecido en aquellos ricos en hidratos de carbono. Es importante resaltar el papel que ocupa la temperatura entre los factores que limitan el crecimiento vegetativo, razones por las cuales constituye un parámetro de elevada relevancia en la taxonomía. El margen de temperatura en el cual está comprendido el desarrollo del micelio va desde 1 ºC de temperatura mínima hasta los 37 ºC como máxima temperatura de crecimiento activo, situándose entre los 20 – 28 ºC la temperatura óptima para la mayoría de las especies, teniendo en cuenta que este valor es específico para cada una de ellas (Anexo. 2) (1). En el caso del pH el rango permisible para el cultivo in vitro de estas especies se encuentra entre 3.5 y 10, siendo el crecimiento óptimo específico para la mayoría de las especies, encontrándose en un rango entre 4.5 y 5.5. Generalmente, los valores de pH que permiten el mejor desarrollo del micelio, también son favorables para la producción de esporangios, clamidosporas y oosporas (1).

B.2- Reproducción.

Las especies del género Phytophthora presentan dos tipos de reproducción: asexual (con la formación de clamidosporas y esporangios, que contienen las zoosporas) y sexual (mediante la formación de oosporas). Reproducción asexual. El esporangióforo no se diferencia normalmente de las hifas, aunque en algunas ocasiones este puede ser más ancho o delgado que éstas y puede presentar hinchamientos. La presencia de esporangios es común para todas las especies del género, son incoloros o de color amarillo tenue y de manera general se insertan terminalmente en el esporangióforo, aunque también pueden estar intercalados. El esporangio muchas veces presenta vacuolas y al microscopio se observa un aspecto granuloso en su interior.

Existen características del esporangio que son muy importantes para la taxonomía de las especies como su forma y tamaño, la presencia o no de la papila y sus dimensiones (Anexo. 1), la manera en que estos se producen, así como la mayor o menor facilidad de este para desprenderse del esporangióforo (esta última característica permite clasificarlos en caedizos: si se desprenden fácilmente del esporangióforo y no caedizos: si se desprende difícilmente) siendo también importante desde el punto de vista taxonómico la longitud del pedicelo que va unido al esporangio cuando este se desprende del esporangióforo (1, 52). Existen factores que afectan la producción y el desarrollo de los esporangios como son: la humedad, la tensión de oxígeno, la luz, la temperatura y la nutrición. La presencia de humedad es fundamental para la formación de esporangios, aunque la cantidad necesaria de la misma varía para cada especie. En la mayoría de las especies los esporangios se producen más abundantemente en presencia de luz, aunque el efecto de la misma es muy variable, llegando a estimularla en algunos caso e inhibiéndola en otros. El factor temperatura, que como se indicó anteriormente ejerce una gran influencia en el desarrollo vegetativo del hongo, también influye grandemente en el desarrollo y formación del esporangio. La temperatura óptima para la producción de esporangios es diferente y específica para cada especie, por lo que juega un papel destacado en la taxonomía, las mismas están comprendidas entre los 20 y los 28 ºC (1, 52). Las zoosporas se forman dentro del esporangio, para lo cual es necesaria la presencia de agua libre. La formación de estas puede estimularse in vitro cuando se incuba un cultivo con esporangios durante pocos minutos a temperaturas entre 5 y 10 ºC. La exposición más prolongada a estas temperaturas (10 – 15 minutos) provoca que las zoosporas sean liberadas, lo cual constituye la forma de germinación indirecta de estos hongos. Las especies de este género presentan además una forma de germinación directa, en la cual el tubo germinativo se origina, principalmente, a partir de la papila del esporangio, este a su vez puede dar lugar rápidamente al micelio o producir un nuevo esporangio, todo lo cual depende de las condiciones del medio de cultivo (1, 52). Las zoosporas son las estructuras primarias que causan una nueva infección de las raíces. Estas esporas pueden nadar cortas distancias en el suelo con elevada humedad, así como también pueden ser transportadas grandes distancias en el agua de irrigación o por las lluvias. Además de

esta forma de dispersión las especies de Phytophthora pueden dispersarse en la naturaleza por el aire o siendo transportadas por la actividad de los humanos y algunos invertebrados (32). Los miembros de este género producen además clamidosporas, las cuales constituyen un órgano de conservación y supervivencia (9). Generalmente son de forma redondeada con una pared bien definida (más de 2 micras de espesor), siendo comúnmente intercalares aunque también pueden encontrarse en el extremo terminal de la hifa. Al principio las clamidosporas son hialinas, tornándose de un color amarillo o ligeramente marrón con la edad. Es importante señalar que no se forman en todas las especies, por lo cual su presencia es importante para la taxonomía de las mismas (1,45). Las clamidosporas pueden germinar dando lugar a numerosos tubos germinativos o a la producción de esporangios, lo cual dependerá de la cantidad de nutrientes presentes en el medio de cultivo (Anexo. 3). En cuanto a la influencia de la temperatura se plantea que un rango entre 18 – 30 ºC es óptimo para que ocurra la germinación de las clamidosporas, aunque también se ha producido germinación entre 9 –12 ºC y a 33 ºC. El pH óptimo para que ocurra este proceso está comprendido entre 5 y 7, aunque a valores de pH de 3 y 9 también se ha producido germinación de las clamidosporas (1, 52). Además es importante mencionar que las clamidosporas que persisten en el suelo constituyen también unidades infectivas (13). Reproducción sexual. Los órganos sexuales constituyen el elemento taxonómico más constantes y por tanto son de gran valor en la clasificación de las especies. No todas las especies los producen o se muestran inconstantes en cuanto a su formación, por lo que en algunos casos se requieren medios de cultivo especiales. Incluso en la naturaleza existen casos, como por ejemplo P. citrphthora, donde no se ha observado la producción de estos órganos de reproducción (1,45).

Oogonio (Órgano sexual femenino): Es de forma esférica o ligeramente ahusada, usualmente se encuentra en el ápice de una hifa, aunque también puede aparecer intercalado, separado del resto de la hifa por un grueso tabique. En cultivos jóvenes es hialino pero posteriomente, con el envejecimiento, se torna amarillo o

ligeramente marrón. En la mayoría de las especies es suave y puede presentar ligeras protuberancias o berrugas en algunos casos (1,52).

Anteridio (Órgano sexual masculino): Presenta una forma variable, puede ser esférico, oval, en forma de clavo o cilíndrico. Observándose de manera habitual solitario, hialino y con una pared externa delgada. Su disposición respecto al oogonio puede ser anfígino o paragino, o ambas a la vez, siendo importante tener en cuenta esta disposición para realizar la clasificación taxonómica de las especies (1, 52).

Oospora:

Siempre se presenta de manera individual, ocupando relativamente toda la cavidad del oogonio. Es de forma esférica, lisa o moderadamente verrugosa, y su coloración puede ser hialina o ligeramente amarillo oscuro. El medio de cultivo ejerce una influencia considerable en la formación de la oospora, según Grente (1961), los medios naturales ricos, tales como el maíz y la avena, son los más favorables. No produciéndose en medios líquidos. Es importante señalar también que existen ciertas sustancias que favorecen su formación, como son los extractos de plantas, ciertas vitaminas y algunos esteroles. Entre otros factores que también influyen en la formación de la oospora podemos citar la tensión de oxígeno y CO2 , la presencia de luz, la temperatura cuyo óptimo está entre 20- 22 ºC, así como también los cultivos asociados de diferentes especies y razas que facilitan la producción de oosporas entre las especies heterotálicas (especies auto estériles) . Dentro de las especies heterotálicas se encuentran: P.cinnamomi P. palmivora P. citrophthora P. parasitica P. arecae P. cambivora P. capsici P. colocasiae

P. cryptogea P. drechsleri P. infestan P. meadii P. mexicana La formación de la oospora es el resultado de la fertilización de una oosfera uninucleada, la cual tiene lugar de diferentes formas según la posición del anteridio. Una vez que se ha formado la oospora esta entra en un período de reposo en el cual se distinguen dos estados: Latencia constitutiva y Latencia exógena. Una vez terminado este período la oospora germina dando lugar a un tubo germinativo, que a su vez deriva en la formación de un esporangio, o con la formación del talo micelial (1, 45). Es importante mencionar que todos los procesos de reproducción, ya sean sexual o asexual, juegan un papel fundamental en el ciclo de vida del hongo (Anexo. 4). SÍNTOMAS DE LAS ENFERMEDADES PROVOCADAS POR Phytophthora spp EN ALGUNOS CULTIVOS TROPICALES. MEDIDAS DE CONTROL. Cítricos: Dentro de las especies de Phytophthora que provocan enfermedades en los cítricos se encuentran: P. citrophthora, P. parasitica y en un porciento menor de las infecciones se han aislado P. hibernalis, P. syringae y P. citricola. (37, 38, 46, 52). Además existen reportes (en la Florida, la India y Sur América, entre otros países) donde se ha aislado P. palmivora como patógeno de los cítricos (34). Las enfermedades que estas especies producen en los cítricos se conocen como (34, 46, 52): 1. Gomosis. 2. Podredumbre del cuello de la raíz y parte basal del tallo. 3. Aguado o podredumbre marrón de los frutos. Pudiendo causar además ″Damping off” y ″Blight” en plántulas de semillero (46, 52).

Todas las especies de citricos son más o menos susceptibles a estas enfermedades. La tolerancia o resistencia de las plantas al ataque de estos hongos se debe fundamentalmente a factores genéticos, aunque es importante la influencia que ejercen muchos otros factores como: la edad, la composición química y el vigor de los tejidos de la planta, la temperatura ambiental, la humedad relativa, las cantidades aportadas de agua y nutrientes minerales u orgánicos, así como la textura del terreno (47).

Gomosis: En un inicio la enfermedad se manifiesta en la base del tronco donde aparece una abundante exudación de goma en la superficie de la corteza, la cual toma un color oscuro. Los tejidos internos mueren hasta el leño, el cual en algunos casos aparece de color marrón debido a las infiltraciones de una delgada capa de goma. Las zonas infectadas pueden tener una amplitud y una forma variable, observándose que progresan más rápidamente en sentido longitudinal que lateral. Los tejidos muertos de la corteza se secan gradualmente, por lo que al poco tiempo la corteza aparece deprimida y resquebrajada, mientras que en el área límite de la lesión los tejidos se observan sanos, formándose un típico chancro. La exudación de goma depende de varios factores, tales como el tipo de suelo, las condiciones ambientales, la especie de cítrico y del proceso infectivo (37 ,46, 52).

Podredumbre del cuello de la raíz y parte basal del tallo:

Produce la deshidratación y muerte de la corteza, sin que ocurra la exudación de goma. La lesión frecuentemente es visible junto a la superficie del suelo, pudiéndose observar a unos centímetros por debajo de este que la corteza aparece podrida igual que la de las raíces principales. Cuando las afectaciones en la base del tallo son considerables las plantas enfermas comienzan a mostrar en su parte aérea los efectos de la alteración. Se observan hojas de color verde pálido, encontrándose a menudo los nervios con una coloración amarillenta; las brotaciones son escasas, con los limbos de las hojas reducidos confiriéndole a la planta un aspecto general de tristeza foliar. La producción de frutos también se ve afectada, siendo escasa y con frutos de menor tamaño que lo normal (37, 46, 52).

Aguado de los frutos: Como resultado de la infección de los frutos cítricos por especies de Phytophthora aparecen manchas pardas, más o menos circulares y firmes (semejantes al cuero en apariencia y consistencia), además de la presencia de un olor aromático característico (8, 37, 52). En condiciones de elevada humedad atmosférica el hongo esporula en la superficie de las manchas formando un moho blanquecino que puede observarse a simple vista. Los frutos afectados generalmente se desprenden en un estado prematuro (37). Las especies de Phytophthora que causan la pudrición parda de los frutos son las mismas que producen gomosis y podredumbre de las raíces en los cítricos. Sin embargo P. citrophthora es la que más frecuentemente se asocia con esta enfermedad, lo cual puede explicarse debido a que esta especie produce esporas más rápido y abundantemente en los frutos infectados que P. parasitica (8).

Control y manejo de estas enfermedades: Los métodos de lucha contra el ataque de Phytophthora se dividen en dos: los métodos indirectos y los métodos directos (46). Métodos indirectos: Consisten en colocar a las plantas en las mejores condiciones de cultivo para que estas puedan resistir los ataques de los hongos. Entre estos métodos podemos mencionar: v Utilizar como porta-injerto la especie de cítricos que posee mayor

resistencia o tolerancia a estos hongos. Entre los que podemos citar el naranjo trifoliado (Poncirus trifoliata), los híbridos del naranjo trifoliado (citrange Troyer y Citrange Carrizo), híbridos de pomelo y mandarina y el naranjo agrio.

v Injertar la variedad comercial, normalmente sensible a esta enfermedad, a una altura del suelo no menor de los 30 cm, con el objetivo de impedir que el agua que se acumula en las parcelas (procedente de la lluvia o del riego) tenga contacto con esta parte del árbol, y así evitar que las zoosporas puedan fijarse en la corteza.

v Facilitar un adecuado drenaje del suelo eliminando los encharcamientos.

v Evitar que debido a las prácticas culturales se produzcan heridas, ya que estas constituyen una puerta de entrada para estos patógenos (37, 47).

Métodos directos: Se basan en la aplicación de productos químicos para detener el desarrollo del hongo. Dentro de estos métodos se encuentran: v Aplicación directa en la base del tronco de una suspención de un

fungicida o de una mezcla de fungicidas, ya sea mediante la utilización de un pulverizador o con un pincel. Esta técnica generalmente se aconseja en plantaciones jóvenes como una medida preventiva, aunque también se utiliza en el caso de ataques pequeños o al comienzo de su desarrollo. Una variante de esta técnica consiste en aplicar, en lugar de un fungicida, un mástico alquitranado, el cual limita la tensión de oxígeno que llega al hongo, evitando de esta manera que continúe su crecimiento (haciendo 2 ó 3 aplicaciones al año).

v Raspado de la goma y de los tejidos deshidratados, aplicando luego una suspención concentrada de uno o de una mezcla de fungicidas.

v Eliminación completa de todo el tejido de la corteza afectada mediante cirugía y aplicar posteriormente el fungicida seguido de un mástico alquitranado (Técnica de Fawcett) (37, 47).

Son varios los fungicidas existentes en el mercado que pueden ser empleados en estas técnicas. La actividad de los mismos se define como exoterápica pudiendo mencionar (37, 47): - Oxicloruro de cobre y caldo bordelés. - Ditiocarbamatos (Zineb; Mancozeb; Maneb; Metiran; etc.). - Ofetalimídicos (Captan; Folped; Captafol; etc.). Es importante señalar que la actividad de estos productos se dirige fundamentalmente a impedir la germinación de las zoosporas que llegan a la corteza y su efectividad sobre el micelio que se ha introducido en el interior de la misma es relativamente pobre. Con disponibilidad en el mercado, existen productos fungicidas que son absorbidos en cantidad suficiente a través de las raíces y las hojas, y una vez en el sistema vascular de la planta son trasladados por los vasos llegando a los tejidos. Esto ha hecho posible desarrollar una lucha curativa inhibiendo el desarrollo de la parte vegetativa del hongo. El movimiento de estos fungicidas en el interior de la planta puede ser en dos direcciones: a.- En sentido ascendente o acrópeto (desde las raíces hasta las hojas, a través del xilema conjuntamente con la savia bruta). b.- En sentido descendente o basípeto (desde las hojas a las raíces, a través del floema, mezclado con la savia elaborada).

El momento de aplicación de estos productos es cuando las plantas están en crecimiento activo y siempre al comienzo de la infección y antes de que los chancros y exudados gomosos se hagan bien patentes. Dentro de este grupo se encuentran el fosetil aluminio (Aliett), con actividad ambimóvil, el Metalaxil y el Cyprofuran con actividad ascendente (2, 3, 23). Aguacateros: El aguacate es un cultivo tropical o subtropical nativo de las Américas. Son cuatro las especies de Phytophthora que causan enfermedaes en este cultivo: P. cinnamomi, P. citricola, P. palmivora, P. heveae, provocando la pudrición de las raíces, el cáncer del tronco en California, el declinamiento de las plantas de semillero, y cáncer del tronco en Guatemala, respectivamente (52). Pudrición de las raíces: P. cinnamomi fue descrito por primera vez en 1922 por Rands, en plantas de canela y desde entonces ha sido encontrado aproximadamente en 70 países de las regiones tropicales y subtropicales, causando enfermedades en diferentes cultivos. La incedencia de este patógeno sobre el aguacate se describió por primera vez en 1927, en Puerto Rico, y actualmente podemos encontrarlo como agente causal de la pudrición de las raíces del aguacate en casi todas las áreas del mundo donde se practica este cultivo (por ejemplo: Estados Unidos, México, América Central y América del Sur , el Caribe, Australia, Nueva Zelandia, África, Israel, España, Marruecos, etc.)(52). La incidencia de esta enfermedad en las plantaciones provoca grandes pérdidas en la industria del aguacate y constituye un problema serio en la mayoría de las regiones tropicales donde se practica este cultivo. La pudrición de las raíces por P. cinnamomi provoca un declinamiento progresivo del árbol, en el cual se observan hojas más pequeñas que lo normal, usualmente de color verde pálido o amarillentas y a menudo marchitas. Las ramas mueren regresivamente producto del avance de la enfermedad y los frutos son de corteza brillante. Como consecuencia de esta enfermedad el árbol muestra un aspecto general de marchitez y la copa del mismo se va desfoliando, llegando a secarse completamente en estados avanzados de la enfermedad. Como resultado la fructificación va decayendo, aunque a veces se puede producir

una fructificación excesiva, con frutos de pequeño tamaño que no llegan a engordar. Producto del ataque del hongo las raíces alimenticias (o raíces absorbentes) mueren, observándose ennegrecidas y quebradizas, siendo posible no encontrarlas en estados avanzados de la infección, sin embargo la infección raramente se extiende hacia las raíces principales (13). Esta enfermedad puede producirse bajo un amplio rango de temperaturas del suelo que va desde 21 hasta 30 ºC, produciéndose muy poca o ninguna infección a 33 ºC y muy poca a temperaturas entre los 9-10 ºC (8, 13, 31, 52). Se presenta mayormente en los suelos con un drenaje deficiente, siendo la presencia del hongo y el exceso de humedad los dos factores que potencian el rápido desarrollo de la enfermedad (11,12). En el caso de la pudrición de las raíces del aguacatero las zoosporas son atraídas por las raíces mediante un proceso de quimiotáctico, luego germinan y penetran las raíces iniciándose la pudrición de las mismas. Cáncer del tronco: Al menos tres especies de Phytophthora provocan cáncer del tronco en el aguacate: P.cinnamomi, P.heveae y P.citrícola. Esta enfermedad se caracteriza por la aparición de una zona decolorada en la parte baja del tronco y la exudación de grandes cantidades de un polvo blanco (un azúcar hepta-carbonado común en el aguacate) (31, 52). Control de la enfermedad: Virtualmente es imposible erradicar P. cinnamomi una vez que este se ha instalado en el suelo plantado. Sin embargo los cultivadores de aguacate emplean un conjunto de medidas practicas para reducir el daño a las raíces y lograr evitar el declinamiento del árbol. Algunos autores plantean que el control sobre P. cinnamomi puede lograrse aplicando un conjunto de medidas que forman parte de un programa integral el cual abarca la prevención, las buenas practicas culturales, medidas de control biológico, el control químico y el uso de patrones resistentes. Dentro de estas medidas se encuentran plantar en suelos con un adecuado drenaje interno, producir patrones libres de la enfermedad en semilleros certificados y prevenir el movimiento de suelo o de agua de las áreas infectadas hacia las áreas con un crecimiento saludable.

Un factor que debe ser cuidadosamente controlado es la irrigación del terreno plantado, tratando de evitar que el suelo se torne demasiado húmedo ya que esta enfermedad se ve favorecida en los suelos con un exceso de humedad. Pueden utilizarse productos fungicidas tales como el Ridomil (metalaxil) y el Alitte (fosetil Al), sin embargo el tratamiento químico es muy costoso. Trabajos previos sobre el uso de patrones resistentes al ataque del hongo indican que este podría ser el método más satisfactorio para controlar la pudrición de las raíces del aguacatero por P. cinnamomi. Estudios realizados en California reportan como relativamente resistentes a los patrones: Duke 6, Duke 7, G 22, G 6, Huntalis, Barr Duke y Thomas (9, 10, 31, 33, 48). Cocotero: La pudrición de la yema causada por especies del género Phytophthora. fue reportada por primera vez Grand Cayman en 1834 y descrita subsecuentemente en Cuba, India, Filipinas, Jamaica, África, Sri Lanka, etc (29) y constituye una de las enfermedades más devastadoras del cultivo del coco. Esta enfermedad es causada por Phytophthora palmivora Butl, sin embargo en algunos países se han encontrado otras especies de Phytophhtora como agente etiológico de dicha enfermedad, por ejemplo: P. faberi en Filipinas, P. heveae en Ivory Coast y La Polinesia Francesa, P. parasitica en Costa Rica y P. nicotianae en Indonesia (29, 30). El primer síntoma visible de esta enfermedad es la marchitez de la hoja más tierna sin abrir, tornándose parda y encorvada. Un tiempo después las hojas jóvenes más cercanas a la espiga comienzan a mostrar síntomas similares hasta que queda afectado todo el conjunto. Producto de la podredumbre del cogollo la hoja principal puede ser fácilmente removida de la yema produciéndose en este momento un fuerte olor característico y desagradable. La pudrición inicial de la yema causada por estos patógenos es firme y seca en estados tempranos, sin embargo rápidamente el tejido enfermo es invadido por bacterias y otros microorganismos tornándose blanda y humeda, en este momento resulta bastante difícil poder aislar P. palmivora. Los árboles más susceptibles son aquellos entre 15 y 45 años de edad. Entre otros factores que favorecen el desarrollo la infección por parte del

hongo y el desarrollo de la enfermedad se encuentran la alta humedad relativa y las lluvias, debido a que el hongo puede permanecer en un estado de dormancia en la base de la hoja durante el período de seca y una vez llagadas las lluvias es lavado hacia la yema. Dentro de las especies de palmas que son afectadas comúnmente por esta enfermedad se encuentran el cocotero (Cocos nucifera), la areca (Areca catechu) y la palmira (Borassus flabellifer) (28, 29, 30). Control de la enfermedad: El control sobre la pudrición de la yema es bastante difícil, se plantea que las medidas curativas solo pueden salvar a la planta cuando la enfermedad es diagnosticada en un estado temprano, o sea, justo cuando la espiga comienza a mostrarlos primeros síntomas de marchitez. Dentro de estas medidas se encuentra el tratamiento de las plantas con fungicidas tales como el Aliette, el Ridomil o el Ácido fosfórico en forma de injección del tronco y las raíces o la utilización del Fenil mercurio urea, en forma de polvo, aplicándolo en las axilas de las hojas. Sin dejar de mencionar que todos estos tratamientos son bastante caros. Por lo que algunos autores sugieren emplear mediadas que contribuyan a prevenir indirectamente la enfermedad, tales como mejorar el drenaje del suelo y el adecuado control de la maleza lo cual puede reducir la humedad relativa (28, 29).

TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO. El género Phytphthora ha sido históricamente uno de los grupos de hongos fitopatógenos cuyo aislamiento es muy difícil. Varios han sido los investigadores que han estudiado y desarrollado medios de cultivo selectivos para estos hongos. La base nutritiva que se utiliza en la preparación de estos medios debe ser preferiblemente medios naturales (Ej. chícharo, papa, harina de cereales, etc.) que permiten un crecimiento más rápido de Phytophthora, aunque también puede emplearse una base totalmente artificial, con la condición de que contenga tiamina. A esta base nutritiva, sea natural o artificial, se le adicionan inhibidores para eliminar las bacterias y hongos no deseados. Entre estos medios podemos citar: v Medio 3P (4).

Pimaricina 100 ppm Penicilina 50 ppm Polimixina 50 ppm

Este medio permite un aislamiento rápido de las Pythiaceaes a partir de tejido infectado, sin embargo no es útil para el aislamiento a partir del suelo. Es muy uitlizado para el aislamiento de P. parasitica, P. citrophthora y P. cryptogea. Otros autores plantean que la penicilina y la polimixina tienen actividad sobre Phytophthora, por lo que deben reemplearse por la vancomicina que no afecta a las Pythiaceaes (1). v Medio PV

Pimaricina 100 ppm Vancomicina 200 ppm

Sin embargo estos mismos autores plantean que la presencia de elevadas concentraciones de pimaricina, la cual tiene actividad inhibitoria sobre la germinación de las esporas, en los medios anteriormente mencionados, los hace poco efectivos para realizar aislamiento a partir del suelo. Por esta razón se han propuestos variantes en las cuales las dosis de pimaricina empleadas son menores:

a.- Pimaricina 2 ppm b.- Pimaricina 10 ppm Penicilina 80 U/mL Vancomivcina 200 ppm Polimixina 370 U/mL PCNB 100 ppm PCNB 10 ppm Como se ha planteado el aislamiento de las especies de Phytophthora a partir del suelo infectado es bastante difícil, debido fundamentalmente a la interferencia que ejercen otros hongos de crecimiento más acelerado, como es el caso de las especies del género Pythium. Para solucionar este problema Masago H. et al, 1977 idearon un medio selectivo para Phytophthora capaz de inhibir el crecimiento de las especies de Pythium. v Medio BNPRA + Hymexazol

PDA – Agar 1% Benomyl (50%) 10 µg/mL Nistatina (2000 U/mg) 25 µg/mL PCNB 25 µg/mL Rifampicina 10 µg/mL Ampicillin 500 µg/mL Hymexazol 25 ó 50 µg/mL

Además de los medios generales, anteriormente mencionados, utilizados para realizar el aislamiento de los hongos del género Phytophthora, existen trabajos realizados por algunos autores donde se reportan medios específicos para algunas de las especies del género (40): • Medios selectivos para P. cinnamomi Nistatina 100 U/mL PCNB 100 ppm Estreptomicina 50 ppm Rosa bengala 60 ppm Nistatina 50 ppm Vancomicina 100 ppm PCNB 10 ppm Varias son las técnicas que tradicionalmente se han empleado para el aislamiento de estos hongos, como son: 1. Realizar el aislamiento a partir de tejido infectado. Se toman partes del margen de la lesión las cuales se lavan con abundante agua destilada. Una vez secas se realiza una desinfección superficial mediante una solución de hipoclorito sódico al 0.5 %, de cloruro de

mercurio al 1 % o alcohol al 96 %, durante 5 minutos. Inmediatamente las muestras son lavadas nuevamente con agua destilada estéril y secadas con un papel de filtro previamente esterilizado. A continuación, con el bisturí flameado, se toman pequeñas porciones que correspondan al margen de la lesión, y que estén constituidas por una cantidad suficiente de tejido sano, las cuales se colocan en las placas Petri o en los tubos inclinados, que contengan los medios de cultivo selectivos y se incuban a una temperatura comprendida entre los 20-25 ºC. Es necesario aclarar que si el tejido afectado es el fruto la desinfección se realiza directamente sobre este, tomando luego con el bisturí flameado, partes del margen de la zona contaminada, las cuales se colocan directamente sobre los medios de cultivo selectivos (52). 2. Realizar el aislamiento a partir del suelo infectado. Se toman muestras de suelo que se colocan en un recipiente, dentro de las cuales se entierran hasta los dos tercios de su altura frutos (específicos para la especie de Phytophthora que se quiere aislar, por ejemplo un limón para Phytophthora spp de los cítricos, pimiento, aguacate, etc.)y se mantiene bien humedecida la tierra durante varios días (normalmente de 7-10 días). Transcurrido este tiempo a partir de los frutos que muestran afectación por una podredumbre oscura de consistencia dura, se toman porciones siguiendo la misma metodología mencionada en el punto 1. Esta técnica se conoce como ¨técnica del cebo¨ en la cual además de frutos pueden utilizarse como ¨cebo¨ partes de plantas o plántulas de semillero (33). En el caso específico de P. cinnamomi comúnmente se utilizan como ¨cebo¨ plántuilas de semillero de eucalipto, agujas de coníferas y leguminosas del género Lupinus (5). Para realizar el aislamiento a partir del suelo existen otras técnicas descritas conocidas como ¨método de plaqueo de diluciones de suelo¨ (soil dilution methods) y ¨determinación del punto final con diluciones seriadas¨ (serial dilution end-point methods) (43), las cuales constituyen además técnicas para estimar el número de propágulos del patógeno en el suelo (7). Además de las técnicas convencionales anteriormente descritas para el aislamiento y cuantificación de las especies de Phytophthora existen otras técnicas descritas más recientemente que hacen más sensibles y reproducibles estos ensayos.

Existe un sistema de ELISA basado en un anticuerpo monoclonal que ha sido empleado satisfactoriamente para detectar la presencia de Phytophthora en las raíces, este sistema se ha aplicado para la detección de zoosporas del hongo en el agua de irrigación así como de los niveles de Phytophhtora en el suelo, previo a que sea plantado. Demostrando ser altamente específico y sensible, por lo que constituye una herramienta útil que permite un diagnóstico más rápido que las técnicas convencionales de cultivo (38). Actualmente la aplicación de las técnicas moleculares de diagnóstico en la patología vegetal ha mejorado grandemente la capacidad de los investigadores para detectar dichos patógenos y obtener mayores conocimientos sobre su ecología y epidemiología. Por ejemplo la comparación de regiones ITS dentro de los patógenos fúngicos (aplicable a Phytophthora) ha probado ser muy útil para la taxonomía de las especies. Por ejemplo se han desarrollado sistemas de detección basados en la técnica del PCR específicos para hongos, así como también se han aplicado métodos basados en la combinación de las técnicas de ELISA y PCR para mejorar la sensibilidad en la detección de estos patógenos (25). Para P. cinnamomi se han desarrollado técnicas de cuantificación en las raíces de los árboles de aguacate mediante el uso de una sonda de DNA especie específica, lo cual permite medir, incluso, bajos niveles de este hongo presente en las raíces. Además esta sonda puede ser utilizada para la identificación de especies, ya que en experimentos realizados muestra una reactividad cruzada insignificante con otros organismos e incluso con otras especies de Phytophthora cercanamente relacionadas (21). CONTROL DE LAS ENFERMEDADES CAUSADAS POR Phytophthora MEDIANTE LA BÚSQUEDA DE RESISTENCIA EN EL HOSPEDERO. ASPECTOS GENERALES. Como se mencionó anteriormente dentro de las medidas de control establecidas para las enfermedades causadas por los hongos de este género juega un papel fundamental la utilización de portainjertos resistentes, destacandose dentro del conjunto de medidas a adoptar , ya que brinda grandes posibilidades para lograr un manejo adecuado de estas enfermedades (24). En la actualidad han sido notables los adelantos alcanzados en el estudio de la interacción parásito-hospedero, para las enfermedades provocadas por hongos y específicamente para los sistemas Phytophthora-hospedero, todo lo cual está encaminado a obtener patrones resistentes y medidas más efectivas para lograr el control de las enfermedades., basados

en un mayor conocimiento sobre el desarrollo de los mecanismos de defensa en las plantas y la interacción con el parásito. Una de las principales razones por las cuales los patógenos fúngicos constituyen uno de los grupos que causan una variada gama de enfermedades en diversos cultivos es su habilidad de localizar y detectar superficies apropiadas en los hospederos y luego elaborar estructuras especializadas para desarrollar el proceso infeccioso. El evento inicial del ataque a la planta hospedera es la adhesión a la cúticula y el crecimiento directo del tubo germinativo en la superficie de la planta. Luego en el sitio de penetración se forma el apresorio el cual ejerce una marcada presión sobre la superficie del huésped. Posteriormente crece la hifa de penetración, la cual se diferencia a partir de la base del apresorio en contacto con la superficie del hospedero, la cual en muchos casos secreta una variedad de enzimas que degradan la pared y maceran los tejidos de la planta (ej. P. capsici y P. palmivora). Una vez que se ha producido la invasión del tejido por la hifa de penetración, para que se produzca el crecimiento activo del hongo se requiere el establecimiento de una relación parasítica continuada con el hospedero que le proporciones al hongo los nutrientes necesarios para su crecimiento en la planta (27, 39, 44). Ante el ataque de los patógenos las plantas desarrollan mecanismos naturales de resistencia, siendo importante además la influencia que ejercen los factores epidemilógicos y la predisposición de las plantas en la determinación de la infección. Los mecanismos de resistencia al ataque de Phytophthora se dividen en dos: aquellos que le confieren resistencia general (que es la resistencia de todas las especies de plantas a todos los patógenos, por ejemplo las reacciones de hipersensibilidad, la inducción de barreras estructurales y la produccioón ede fitoalexinas) y aquellos que confieren resistencia específica (aquella que es efectiva dentro de una especie de planta a ciertas razas de una única especie de Phytophthora y que usualmente es controlada por genes individuales de resistencia en el hospedero (7, 17). La búsqueda consiente de resistencia a las enfermedades causadas por Phytophthora comenzó tan pronto como sucedieron los serios problemas ocurridos en Europa (1845-1846) con la epidemia provocada por P. infestans en el cultivo de la patata. Existe abundante literatura publicada que demuestra que en los últimos años son considerables los trabajos realizados en la búsqueda de resistencia a varias especies de Phytophthora, por ejemplo el

mejoramiento del tomate para lograr la resistencia a P. infestans, en el cultivo de la fresa contra P. fragariae y en el cultivo del aguacate hacia P. cinnamomi, entre otras. Por ejemplo, actualmente con la aplicación de las técnicas de biología molecular, específicamente las técnicas de marcadores moleculares, se han identificado aproximadamente 19 genes dominantes simples (genes R) que le confieren a la patata resistencia a hongos, virus y nemátodos (14). La aplicación futura de los genes R identificados (más de 30 en diferentes especies de plantas) que le confieren a estas resistencia a una gama de patógenos puede incluir la transferencia entre géneros relacionados y la identificación o construcción de genes que condicionan a las plantas con una resistencia perdurable en el tiempo (19). Sin embargo, en muchos casos la resistencia conferida no persiste en el tiempo como consecuencia de que se producen cambios en las poblaciones del patógeno (24). En el caso de las poblaciones de Phytophthora se conoce que existen varios mecanismos de variabilidad dentro de las mismas, lo cual condiciona el desarrollo satisfactorio o insatisfactorio de los esfuerzos realizados para lograr la resistencia en las plantas a estos patógenos. Dentro de los mecanismos de variación de Phytophthora podemos mencionar la recombinación sexual basada en la existencia de dos tipos sexuales A1 y A2, por lo que este mecanismo es solo efectivo en aquellas áreas donde coexisten ambos tipos. La recombinación somática, como un mecanismo alternativo en aquellas áreas donde no está presente uno de los tipos sexuales. Es importante tener en cuenta que conociendo la identidad de las especies de los patógenos, sus poblaciones, su modo de reproducción y su comportamiento en el tiempo y en el espacio los fitopatólogos incrementan sus posibilidades de ejercer un mejor control de los mismos y de predecir su comportamiento en el futuro (7, 35).

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ANEXO. 1: Diferentes tipos de esporangios de las especies del género Phytophthora.

G. Descargando las zoosporas H. Elíptico I. Ovalado sin papilas J. Ovalado con papilas K. Cuerpo esférico y ápice agudo L. Múltiple

A. Irregular papilado B. Limoniforme C. Piriforme D. Trasovado E. Irregular con dos papilas F. Globoso

ANEXO. 2: Temperaturas cardinales de crecimiento de algunas especies del género Phytophthora.

Especie Temp. mínima Temp.óptima Temp.máxima P. parasitica 10 ºC 30-32 ºC 37 ºC P. citrophthora 5 ºC 26-27 ºC 32 ºC P. palmivora 11ºC 28-29 ºC 35 ºC P. citricola 3 ºC 25-28 ºC 31 ºC P. syringae 5 ºC 20 ºC 23 ºC P. hibernalis 5 ºC 20 ºC 23 ºC P. magasperma 2 ºC 25 ºC 30 ºC P cinnamomi 5 ºC 24-28 ºC 32-34 ºC P. drechsleri 5 ºC 28-31 ºC 36-37 ºC

ANEXO. 3: Clamidosporas de Phytophthora spp. Formas de germinación

A. Clamidosporas intercalares B. Clamidosporas terminales C. Clamidosporas envejecidas con vacuolas D. Clamidosporas en proceso de germinación

Anexo 4. Ciclo de vida de los hongos del género Phytophthora