На правах рукописи

Белашова Ольга Владимировна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ТВОРОЖНОЙ МАССЫ

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ С

ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

SCUTELLARIA GALERICULATA L.И TRIFOLIUM PRATENSE L.

05.18.04 - технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств

05.18.07 – биотехнология пищевых продуктов и биологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

кандидата технических наук

Кемерово – 2020

1

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования «Кемеровский государственный университет» (ФГБОУ ВО «КемГУ»). Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Заушинцена Александра Васильевна

Официальные оппоненты: Ульрих Елена Викторовна, доктор технических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кузбасская государственная сельскохозяйственная академия», кафедра агробиотехнологий, профессор

Коновалов Сергей Александрович, кандидат технических наук, доцент, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Омский государственный аграрный университет имени П.А. Столыпина», кафедра продуктов питания и пищевой биотехнологии, заведующий кафедрой

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Уральский государственный экономический университет»

Защита диссертации состоится «23» октября 2020 года в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.088.10 при ФГБОУ ВО «Кемеровский государственный университет» по адресу 650056, г. Кемерово, б-р Строителей, 47, 2 лекц. ауд., тел.: (8-384-2) 39-05-37.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке и на официальном сайте ФГБОУ ВО «Кемеровский государственный университет» https://kemsu.ru/science/dissertation-councils/diss-212-088-10/protects/5617/

Отзывы на автореферат отправлять по адресу: 650000, г. Кемерово, ул. Красная,6.

Автореферат разослан «_____» ____________ 2020 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

И.С. Милентьева

2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время одним из главных трендов пищевой промышленности считается разработка биотехнологий инновационных функциональных продуктов и, прежде всего, на молочной основе.

Поиск новых, эффективных лечебно-профилактических пищевых добавок растительного происхождения – является еще одним актуальным направлением современной биотехнологии. В производстве биологически активных веществ растительного происхождения наблюдается недостаток сырьевых ресурсов при неуклонном росте их спроса. Альтернативным источником получения экологически безопасных биологически активных веществ является культура растительных клеток, полученных in vitro. Необходимо отметить ряд преимуществ использования каллусов: экологическая чистота производства культуры клеток, гарантированное производство биомассы культуры клеток независимо от сезона и погодных условий, отсутствие токсичных веществ, возможность оптимизации и стандартизации условий выращивания каллусов.

В связи с этим актуальным является поиск новых сырьевых источников и способов получения вторичных метаболитов из культуры растительных клеток видов, систематически близких к лекарственным растениям, используемых в фармации. К такой группе растений относятся шлемник обыкновенный (Scutellaria galericulata L.) и клевер луговой (Trifolium pratense L.). Клевер луговой находит применение в медицине как противосклеротическое и антиканцерогенное средство, обладает иммуномодулирующим действием. В практической медицине используется шлемник байкальский для нормализации артериального давления, как седативное средство. Использование творога как основы для создания обогащенных продуктов лечебно-профилактической направленности с использованием биологически активных веществ, экстрагированных из каллусной биомассы исследуемых видов, позволит максимально расширить ассортимент выпускаемой продукции функционального назначения.

В связи с вышеизложенным, направление исследований по разработке технологии обогащенного продукта на основе творожной массы, с использованием биологически активных веществ, выделенных из биомассы каллусных клеток Scutellaria galericulata L. и Trifolium pratense L. является актуальным.

Степень разработанности. Существенный вклад в развитии технологий производства творога, научные аспекты повышения его качества отражены в научных трудах З.С. Зобковой, Н.Н. Липатова (ст.), Н.Н. Липатова (мл.), В.Д. Харитонова и др. Современное состояние и перспективы развития биотехнологий функциональных и обогащенных пищевых продуктов представлены в исследованиях А.Г. Храмцова, Д.В. Харитонова, Л.А. Остроумова, И.А. Евдокимова, А.Н Петрова, Н.А. Тихомировой, В.И. Ганиной, И.А. Смирновой, И.С. Хамагаевой, Н.Б. Гавриловой, Л.В. Голубевой, Л.М. Захаровой, Г.Б. Гаврилова, Е.И. Решетник В.А. Демидовой и других российских учёных. Отдельные этапы работы выполнены в рамках соглашения № 075-02-2018-223 от 26.11.2018 (№075-15-2019-1362 от 14.06.2019) «Получение биологически активных веществ лекарственных растений эндемиков Сибири с использованием культур клеток и органов высших растений» (уникальный идентификатор проекта RFMEF157718X0285).

3

Цель и задачи исследований. Целью работы является разработка технологии творожной массы иммуномодулирующего действия, обогащенной экстрактами БАВ из биомассы каллусных культур шлемника обыкновенного (Scutellaria galericulata L.) и клевера лугового (Trifolium pratense L.).

Для достижения поставленной цели сформулированы основные задачи исследований:

- исследовать БАВ в растительном сырье и в биомассе каллусных культур Scutellaria galericulata L. и Trifolium pratense L.;

- исследовать микроэлементный состав Scutellaria galericulata L. и Trifolium pratense L. в растительном сырье и в биомассе каллусных культур;

- определить антимикробные и антиоксидантные и свойства экстрактов БАВ из биомассы каллусных культур Scutellaria galericulata L. и Trifolium pratense L.;

- подобрать оптимальные параметры получения творожной массы иммуномодулирующего действия, обогащенной экстрактами БАВ из биомассы каллусных культур Scutellaria galericulata L. и Trifolium pratense L.;

- провести комплексные исследования показателей качества и биологической ценности творожной массы иммуномодулирующего действия, обогащенной экстрактами БАВ из биомассы каллусных культур Scutellaria galericulata L. и Trifolium pratense L.;

- разработать технологическую схему получения творожной массы иммуномодулирующего действия, обогащенной экстрактами БАВ из биомассы каллусных культур Scutellaria galericulata L. и Trifolium pratense L.;

- разработать техническую документацию на творожную массу иммуномодулирующего действия, обогащенную экстрактами БАВ из биомассы каллусных культур Scutellaria galericulata L. и Trifolium pratense L., провести промышленную апробацию.

Научная новизна. Научно обоснована и подтверждена перспективность использования биологически активных веществ, выделенных из каллусов шлемника обыкновенного и клевера лугового в технологии обогащенной творожной массы. Впервые проведено фитохимическое исследование биомассы каллусных клеток шлемника обыкновенного и клевера лугового, установлен качественный и количественный состав флавоноидов. Методами ВЭЖХ из экстрактов каллусов исследуемых видов растений идентифицированы флавоноиды: апигенин, лютеолин, байкалин, байкалеин, вогонин, даидзеин, формононетин, прунетин, биоханин А.

Определено содержание микроэлементов в растительном сырье шлемника обыкновенного и клевера лугового, заготовленных на территории Кузбасса и в биомассе каллусных клеток этих видов растений.

Уточнен характер антимикробного действия в отношении 15 тест-культур палочковидной микрофлоры, кокковой микрофлоры и на грибы рода Candida spp. для соединений байкалин, апигенин и лютеолин, относящихся к одной классификационной группе веществ – флавоны. Исследованы антиоксидантные свойства экстрактов БАВ из каллусов шлемника обыкновенного и клевера лугового. На основе результатов исследования научно обоснованы параметры производства творожной массы, обогащенной экстрактами БАВ из биомассы каллусных культур шлемника обыкновенного и клевера лугового. Определена биологическая ценность и срок годности готового обогащенного продукта.

4

Практическая значимость работы. Установлено, что в составе биологически активных веществ Scutellaria galericulata L. и Trifolium pratense L. содержатся флавоны, обладающие широким спектром физиологической активности. На основании экспериментально-аналитических результатов исследований разработана рецептура и технологическая схема производства творожной массы, обогащенной экстрактами биологически активных веществ из биомассы каллусных клеток Scutellaria galericulata L. и Trifolium pratense L. «Творожная сказка». Представлен проект технической документации (ТУ 10.51.56.151-001-02068309-2019, ТИ к ТУ 10.51.56.151-001-02068309-2019) для ее производства (Приложение 3). Проведена промышленная апробация технологии производства творожной массы «Творожная сказка» на предприятиях ООО «МКЯ» и КФХ ИП «Зенюк М.А.». Подана заявка на Патент на изобретения РФ «Способ получения творожной массы, обогащенной концентратами шлемника обыкновенного и клевера лугового» - заявл. 03.06.2020; регистрац. № 2020119274.

Методология и методы исследований. Методология выполнения диссертационного исследования включает теоретическую, экспериментальную и практическую направленности. На основании изучения научно-технической и патентной информации, законодательных и нормативных документов в области здорового питания, качества и безопасности продуктов питания сформулированы цель работы и научные задачи.

В исследованиях использовались общепринятые и стандартные методы: органолептические, физико-химические, биохимические, в том числе высокоэффективная жидкостная хроматография и рентгенофлуоресцентный анализ, микробиологические методы. Математическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием программы Statistic 7.0. В соответствии с поставленными задачами получены научные и практические результаты, проведена оценка качественных показателей обогащенной творожной массы. Также представлены результаты промышленной апробации готового обогащенного продукта – творожной массы «Творожная сказка».

Основные положения, выносимые на защиту: - содержание флавоноидов и тяжелых металлов в растительном сырье и в

культуре каллусных клеток шлемника обыкновенного (Scutellaria galericulata L.) и клевера лугового (Trifolium pratense L.);

- антиоксидантная и антимикробная активность биологически активных веществ, экстрагированных из каллусов шлемника обыкновенного и клевера лугового в отношении палочковидной микрофлоры, кокковой микрофлоры и грибов рода Candida spp;

- разработка рецептуры и технологии производства творожной массы, обогащенной флавоноидами из биомассы каллусов шлемника обыкновенного (Scutellaria galericulata L.) и клевера лугового (Trifolium pratense L.);

- показатели качества и биологической ценности творожной массы; обогащенной экстрактами БАВ из биомассы каллусных культур шлемника обыкновенного (Scutellaria galericulata L.) и клевера лугового (Trifolium pratense L.).

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы прошли апробацию и были предметом обсуждения на научно-практических конференциях международного и национального уровня: 4-ой ежегодной конференции

5

с международным участием «Фармация и общественное здоровье» (г. Екатеринбург, 2011); II Международной научно-практической конференции «Гармонизация подходов к фармацевтической разработке» (г. Москва, 2019); XV (XLVII) Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Образование, наука, инновации: вклад молодых исследователей» (г. Кемерово, 2020).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано печатных 10 работ, в том числе, 4 статьи в изданиях из перечня ВАК и 2 статьи в международном издании, включенного в базы цитирования Scopus и Web of Science («Foods and Raw Materials», «International Journal of Pharmaceutical Research»), Подана заявка на Патент на изобретения РФ.

Объем и структура диссертационной работы. Диссертационная работа состоит из 4 глав, заключения, списка литературы и приложений. Материалы исследования изложены на 174 страницах машинописного текста. В тексте приведено 30 таблиц и 25 рисунков. Библиографический указатель включает 153 источника литературы, из них зарубежной - 53.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Во введении дано обоснование актуальности работы, определены цель и научные задачи, представлена научная и практическая значимость работы, сформулированы основные положения, выносимые на защиту.

В первой главе представлены результаты аналитической работы по изучению научно-практических трудов и патентной информации по вопросу «Анализ современных аспектов использования биологически активных веществ из растений Scutellaria L. и Trifolium L. в технологии пищевых продуктов». Определено направление собственных исследований.

Во второй главе «Методология и методы исследований» представлены описаны объекты и методы исследований, которые проводились в лабораториях: кафедры бионанотехнологии «Кемеровского государственного университета», кафедры фармации «Кемеровского государственного медицинского университета», кафедры микробиологии, иммунологии и вирусологии «Кемеровского государственного медицинского университета»; в научно-образовательном центре «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» КемГУ; в научно-образовательном центре «Кемеровский государственный медицинский университет», в «Химико-аналитической лаборатории «ГеоБиоЭкоЛаб» (г. Кемерово); на молочных предприятиях ООО «МКЯ» и КФХ ИП «Зенюк М.А.». Все экспериментальные исследования проводились в пятикратной повторности с последующей обработкой полученных данных методами математической статистики и анализа. Организационная схема проведения исследования представлена на рисунке 1.

В третьей главе «Результаты и их анализ» представлены все этапы исследований БАВ в растительном сырье и в каллусных биомассах шлемника обыкновенного и клевера лугового, микроэлементный состав в растительном сырье и в биомассе каллусных культур шлемника обыкновенного и клевера лугового, антиоксидантная и антимикробная активность экстрактов БАВ из каллусов шлемника обыкновенного и клевера лугового, разработки рецептуры и технологии производства творожной массы иммуномодулирующего действия, обогащенной экстрактами биологически активных веществ из каллусных биомасс шлемника обыкновенного и клевера лугового.

6

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ТВОРОЖНОЙ МАССЫ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ КАЛЛУСОВ

ШЛЕМНИКА ОБЫКНОВЕННОГО И КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО

Анализ научно-практических трудов и патентной информации отечественных и зарубежных ученых, обоснование направлений собственных исследований, формулировка цели и научных задач.

Исследование БАВ в растительном сырье и в биомассе каллусных культур шлемника

обыкновенного (Scutellaria galericulata L.)и клевера лугового (Trifolium pratense L.)

-содержание стигмастерина, лютеолина, апигенина, байкалина, байкалеина, хризина, вогонина, скутеллареина, глицитеина,даидзеина, генистеина, формононетина, прунетина, биоханина А

Определение активности экстрактов БАВ из каллусов шлемника обыкновенного (Scutellaria galericulata L.) и клевера

лугового (Trifolium pratense L).

-Антимикробная активность по отношению к палочковидной микрофлоре, кокковой микрофлоре, грибам Candida spp.-Антиоксидантная активность

Комплексное исследование показателей качества и биологической ценности

обогащенной творожной массы

III этап Практическая реализация результатов исследования

Исследование микроэлементного состава шлемника обыкновенного (Scutellaria

galericulata L.) и клевера лугового (Trifoliumpratense L).

-содержание в растительном сырье-содержание в биомассе каллусных культур

Разработка технологии производства творожной массы, обогащенной экстрактами БАВ из каллусов шлемника обыкновенного

(Scutellaria galericulata L.) и клевера лугового (Trifolium pratense L). Оценка экономической эффективности

производства обогащенной творожной массы

Апробация в производственных условияхРазработка и утверждение нормативной

документации

Подбор оптимальных параметров получения творожной массы, обогащенной

экстрактами БАВ из каллусов шлемника обыкновенного (Scutellaria galericulata L.) и

клевера лугового (Trifolium pratense L).

-физико-химические показатели-органолептические показатели-рецептуры-экспертные оценки качества

Исследование творожной массы «Творожная сказка» в процессе хранения

Качественный и количественный состав БАВ в творожной массе «Творожная сказка»

I этап Теоретические исследования

II этап Экспериментальные исследования

Рисунок 1- Организационная схема проведения исследования.

7

При исследовании БАВ шлемника обыкновенного и клевера лугового использовали их физико-химические свойства, сравнение со спектрами известных образцов свидетелей, что позволило идентифицировать некоторые соединения Содержание БАВ в экстрактах исследуемых видов определено методами ВЭЖХ и рассчитаны по площади пиков. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Результаты содержания БАВ в растительном сырье и каллусах шлемника

обыкновенного и клевера лугового ВЭЖХ БАВ из побегов Scutellaria galericulata L. № пика tR, мин мг/г

2 6,24 0,21±0,003 5 18,01 6,24±0,13 8 21,47 14,37±1,17 9 23,31 8,73±1,73

10 25,58 5,24±0,10 12 28,6 29,03±2,05 15 31,73 0,21±0,003

16 32,31 0,35±0,004

2-стигмастерин, 5- лютеолин, 8- апигенин, 9- лютеолина-7-глюкозид, 10- гидроксилютеолин, 12- байкалин, 15- хризин, 16- скутеллареин.

ВЭЖХ БАВ из корня Scutellaria galericulata L. № пика tR, мин мг/г

4 7,02 4,33±0,04 6 18,04 18,80±1,98 8 21,55 5,40±0,05

13 25,48 34,37±3,47 14 27,2 16,30±2,19 16 28,55 6,50±0,13 18 29,25 22,27±2,03

19 32,28 3,60 ± 0,04

4- стигмастерин, 6- лютеолин, 8- апигенин, 13- байкалин, 14- байкалеин, 16- хризин, 18- скутеллареин, 19- вогонин.

ВЭЖХ БАВ из каллуса Scutellaria galericulata L. № пика tR, мин мг/г

1 5,92 42,19±0,90

2 7,65 48,50±0,60

3 9,44 3,20±0,04

4 11,07 1,75±0,03

5 13,31 18,75±1,15

6 21,9 6,50±0,13

7 41,22 1,90±0,03

8

1-байкалин, 2-байкалеин, 3- лютеолин, 4- апигенин, 5-вогонин, 6-вогонин-7-О глюкозид, 7-3,5,7,2',6' пентагидрокси-флавон.

ВЭЖХ БАВ из побегов Trifolium pratense L. № пика tR, мин мг/г

1 4,73 1,24 ±0,08

2 4,88 1,47 ±0,05

3 5,56 2,93 ±0,90

4 5,86 2,79 ±0,95

5 6,43 7,42 ±0,15

6 7,47 1,14 ±0,02

7 8,32 0,21 ±0,003

11 11,86 0,22 ±0,003

13 13,55 0,84 ±0,02

1 – глицитеин, 2 – даидзеин, 3 – лютеолин, 4 – генистеин, 5 – формононетин, 6 – апигенин, 7 – ирилон, 11 – прунетин, 13 – биоханин А

ВЭЖХ БАВ из каллуса Trifolium pratense L. № пика tR, мин мг/г

1 4,91 3,17 ±0,04

2 5,39 2,96 ±0,90

3 6,11 6,89 ±0,15

7 8,76 1,89±0,03

8 12,73 0,18 ±0,003

9 13,49 0,95 ±0,02

1 – даидзеин, 2 – лютеолин, 3 – формононетин, 7-апигенин, 8 – прунетин, 9 – биоханин А В растительном сырье (побеги) шлемника обыкновенного методом ВЭЖХ

обнаружены апигенин, хризин, скутеллареин, стигмастерин, лютеолин, байкалин. Химические исследования корня шлемника обыкновенного подтверждают содержание этих же БАВ, что и в побегах. Химический состав биомассы клеток каллуса шлемника обыкновенного показал отсутствие таких БАВ, как апигенин, хризин, скутеллареин, стигмастерин, лютеолин, при этом помимо байкалина обнаружен вогонин.

Методом ВЭЖХ у клевера лугового установлено количественное и качественное содержание следующих БАВ: в каллусе - даидзеин, лютеолин, формононетин, апигенин, прунетин и биоханин А; в побегах дополнительно обнаружены глицитеин, гинестеин и ирилон.

Преобладание тех или иных флавоноидов влияет на фармакологические свойства сырья и особенности его применения в технологии продуктов лечебно-профилактического, функционального и специализированного назначения.

9

Постоянное воздействие техногенного загрязнения за счет промышленного сектора в Кузбассе обуславливает накопление различного рода токсикантов в растениях. Впервые проведен сравнительный анализ содержания элементов, которые участвуют в обменных реакциях растений и влияют на накопление БАВ флавоноидной группы растениями: Со, Сu, Ni, Pb, Cr, Zn, Mn в растительном сырье и в каллусах исследуемых видов, данные представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Содержание тяжелых металлов в образцах Scutellaria galericulata L. и

Trifolium pratense L. (средние данные мг/кг абсолютно сухого сырья) Объекты Образец Исследуемые элементы

Co Cu Ni Pb Cr Zn Mn 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Scutellaria galericulata L.

растительное сырье 2,01 5,25 8,34 4,91 0,12 8,01 21,2 каллус 1,05 1,26 3,35 0,48 0,06 1,33 1,40

Trifolium pratense L.

растительное сырье 0,98 0,74 16,78 5,00 0,21 9,24 30,4 почва 19 31 51 45 10 49 111 каллус 1,13 0,94 3,97 0,67 0,07 1,80 1,75

ПДК СанПиН 2.3.2.10733338-01 1.10.7. БАД на растительной основе

6,0 1,0

ПДК СанПиН 2.3.2.10733338-01 1.6.10. чай (черный, зеленый, плиточный)

10,0 1,0

Анализируя полученные данные, можно сделать вывод, что превышения

установленных нормативов ПДК и в траве, и в каллусах Scutellaria galericulata L. и Trifolium pratense L. ни в одной из анализируемых проб отмечено не было. Отсутствие антропогенной нагрузки окружающей среды в условиях биотехнологической лаборатории позволяет получать каллусы исследуемых растений в стерильных условиях круглогодично. Это дает преимущество в использовании каллусных образцов перед растительным сырьем в технологии обогащенных продуктов питания.

Следующим этапом исследования стало изучение противомикробного действия экстрактов БАВ из каллусов шлемника обыкновенного и клевера лугового с перспективой использования в рецептуре творожной массы иммуномодулирующего действия. Изучение антимикробной активности проводили в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи XIII издания.

В качестве тест-культур использовали палочковидные бактерии (Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Serracia marcescens, Escherichia coli, Morganella morganii, Hafnia alvei, Bacillus cereus), кокковую микрофлору (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecium), разные штаммы грибов рода Candida (Candida non-albicans №№ 136, 138, 142, 144).

Антибактериальный эффект на палочковидные тест-культуры демонстрируют такие флавоны, как байкалин и апигенин – 63% и 50 % соответственно. Лютеолин, напротив, показал отсутствие антибактериального действия в 75% на палочковидную микрофлору. Анализируя антибактериальный эффект на кокковую микрофлору можно отметить, что байкалин в 66% угнетает рост тест-культур, апигенин продолжает оказывать антибактериальный эффект в 33%. Флавон лютеолин на кокковой микрофлоре показал отсутствие антибактериального действия в 100% случаев.

10

Исследуемые экстракты БАВ из каллусов шлемника обыкновенного и клевера лугового продемонстрировали антибактериальный эффект байкалина и апигенина на грибы рода Candida spp. Лютеолин, напротив, продолжает не оказывать антимикробного действия, грибные тест-культуры продолжали увеличивать колонии в 100%.

Необходимо отметить, что исследуемые экстракты не подавляли рост представителя нормальной микрофлоры кишечника - Escherichia coli, тем самым, не нарушая эубиоза кишечника человека.

Исследована антиоксидантная активность экстрактов БАВ из каллусов шлемника обыкновенного и клевера лугового, результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Результаты АОА экстрактов биологически активных веществ из каллусов

шлемника обыкновенного и клевера лугового Метод определения АОА АОА экстрактов БАВ из каллусов

шлемник обыкновенный клевер луговой Спектрофотометрический метод DPPH

89,41±1,43 90,85±2,07

Экстракты БАВ из каллусов шлемника обыкновенного и клевера лугового

характеризуются высокими показателями антиоксидантной активности, что подтверждает их использование в разработке технологии обогащенного продукта на основе творожной массы для иммуномодулирующего действия.

Подбор оптимальных параметров получения творожной массы, обогащенной экстрактами БАВ из каллусов Scutellaria galericulata L. и Trifolium pratense L. начали с органолептической оценки вкуса, запаха, цвета, внешнего вида и консистенции, для этого использовали пятибалльную шкалу для каждого показателя. В результате дегустационной оценки образцов творожной массы с добавлением экстрактов БАВ от 1 до 3%, средний балл составил 4,7, что оценивается как «отлично», консистенция была однородная, в меру плотная, молочного цвета, равномерного по всей массе, легкого привкуса и запаха растительного экстракта.

При дальнейшем увеличении концентрации экстрактов БАВ в рецептурах творожная масса приобретает кремовый оттенок не равномерный по всей массе, выраженный привкус и запах растительного экстракта, средний балл по экспертной оценке снизился на 1 балл, в связи с чем, данные образцы не рекомендуются для дальнейших исследований.

С целью подбора оптимальной концентрации внесения экстрактов БАВ изучали динамику изменения физико-химические показателей творожной массы. Влияние массовой доли экстрактов БАВ из каллусов исследуемых растений на титруемую кислотность модельных образцов показано на рисунках 2. – 3.

Рисунок 2 – Зависимость титруемой кислотности от массовой доли вносимого экстракта БАВ из каллусов шлемника обыкновенного.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

1% 2% 3% 4%

Титр

уема

я ки

слот

ност

ь,

°Т

Массовая доля концентрата БАВ, %

11

Рисунок 3 – Зависимость титруемой кислотности от массовой доли вносимого экстракта БАВ из каллусов клевера лугового.

На следующем этапе анализировали полученные данные об изменении массовой доли влаги от массовой доли вносимого джема (рисунок 4).

Рисунок 4 - Изменение массовой доли влаги творожной массы в зависимости от массовой доли вносимого джема.

Таким образом, при внесении экстрактов БАВ из каллусов шлемника обыкновенного и клевера лугового в количестве 3% и вишневого джема 7% наблюдаются наилучшие характеристики цвета, вкуса, запаха и консистенции обогащенной творожной массы, значения титруемой кислотности находятся в пределах 149,7-150,9 ºТ, наблюдается высокая антиоксидантная активность, что свидетельствует о перспективности использования исследуемых экстрактов БАВ в разработке технологии обогащенной творожной массы иммуномодулирующего действия.

Методом ВЭЖХ определен качественный и количественный состав БАВ в творожной массе «Творожная сказка».

Таблица 4- Результаты ВЭЖХ содержания БАВ в творожной массе «Творожная сказка»

Результат ВЭЖХ содержания БАВ в творожной массе «Творожная сказка»

№ пика

tR,

мин мг/г

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 мин

100

200

300

400

500

600

mAU

255нм

4.55

5.03

5.48

5.65

6.58

7.56

8.69

10.1

5

1 4,55 5,09±0,09

2 5,03 4,31±0,05

3 5,48 3,20±0,04

4 6,58 0,29±0,003

5 7,56 0,56±0,01

6 8,69 1,45±0,02

7 10,15 1,51±0,02

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

1% 2% 3%Титр

уема

я ки

слот

ност

ь,

°Т

Массовая доля концентрата БАВ, %

12

1 – байкалин, 2 – байкалеин, 3 – апигенин, 4 – даидзеин, 5 – биоханин А, 6– формононетин, 7 – лютеолин

Проведено комплексное исследование показателей качества и биологической

ценности творожной массы «Творожная сказка», обогащенной экстрактами БАВ из каллусов шлемника обыкновенного и клевера лугового. В соответствии с рекомендуемыми уровнями потребления пищевых и биологически активных веществ (МР 2.3.1.1915–04), 100 г обогащенной творожной массы удовлетворяют адекватный уровень потребления флавонов (апигенин, лютеолин) на 61 % и изофлавонов (даидзеин) на 0,58 %.

Творожная масса имеет следующие физико-химические показатели: массовая доля белка составляет 6,5±0,2%; массовая доля жира – 5,0±0,2%; массовая доля влаги – 38,9±0,02%; титруемая кислотность – 156,9±1,00°Т. Полученные данные органолептических, физико-химических, микробиологических и токсикологических показателей творожной массы соответствуют требованиям безопасности, установленным в техническом регламенте Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» ТР ТС 021/2011.

Хранение готового продукта осуществляли при температуре (4±2) °С и относительной влажности (80±5) % в герметичной упаковке в течение 15 суток. Определение исследуемых компонентов проводили каждые 3 суток хранения. Результаты представлены на рисунках 5 и 6.

Рисунок 5 – Изменение титруемой кислотности творожной массы «Творожная сказка» в процессе хранения.

Рисунок 6 – Изменение массовой доли влаги творожной массы «Творожная сказка» в процессе хранения.

Титруемая кислотность творожной массы «Творожная сказка» варьировала в

пределах 150,9-160,0 °Т (рисунок 5). На 12 сутки произошло снижение титруемой кислотности до 156,0 °Т. На 15 сутки титруемая кислотность составила 150,0 °Т. Показатель массовой доли влаги варьировал в пределах 39,9-36,5 % на протяжении всех 15 суток хранения (рисунок 6).

Микробиологические исследования осуществляли в соответствии с МУК 1847-04 - с санитарно-эпидемиологической оценкой обоснования сроков годности и условий хранения пищевых продуктов. В первые 9 суток хранения существенных изменений

145

150

155

160

165

0 3 6 9 12 15

Продолжительность хранения, сутки

Титр

уема

я ки

слот

ност

ь, °Т

3435363738394041

0 3 6 9 12 15

Мас

сова

я до

ля в

лаги

, %

Продолжительность хранения, сутки

13

органолептических и физико-химических показателей отмечено не было. На последующие 12 сутки хранения произошли изменения в запахе и вкусе – появление дрожжевого привкуса и запаха, а также уплотнялась консистенция творожной массы, становилась неоднородная, появилась крупинчатость.

Не значительное нарастание кислотности в первые 12 суток хранения свидетельствует о протекании процесса молочно - кислого брожения, а последующее снижение титруемой кислотности может быть связано с изменением микрофлоры - увеличением количества дрожжевых клеток, продукты метаболизма которых сдвигают кислотность в щелочную сторону, это подтверждается снижением органолептических показателей запаха и вкуса после 12 суток хранения.

В процессе хранения при температуре (4±2) °С бактерии группы кишечной палочки на протяжении всего периода хранения не были обнаружены в 0,1 г образцов. Это можно объяснить тем, что данная микрофлора погибает при температуре 65 °С, чему способствует выбранный режим термизации творожной массы «Творожная сказка». Низкая кислотность готового продукта вызывает гибель сальмонеллы, поэтому данные патогенные микроорганизмы не обнаружены на протяжении всего периода хранения.

Установлен срок хранения при температуре (4±2) °С и относительной влажности (80±5) % в герметичной упаковке в течение 10 суток.

В четвертой главе основываясь на теоретических и экспериментальных исследованиях, разрабатывали технологическую схему производства и техническую документацию творожной массы, обогащенной экстрактами биологически активных веществ из биомассы каллусных культур шлемника обыкновенного (Scutellaria galericulata L) и клевера лугового (Trifolium pratense.L.) «Творожная сказка». Рассчитаны экономические показатели продукта.

В таблице 5 представлены различные показатели исследуемой творожной массы. Таблица 5. - Органолептические, физико-химические и микробиологические

показатели творожной массы, обогащенной биологически активными веществами из каллусов шлемника обыкновенного (Scutellaria galericulata L.) и клевера лугового (Trifolium pratense L.)

Показатель Характеристика Вкус и запах Сладкий кисломолочный вкус, чистый

кисломолочный запах Консистенция Однородная в меру плотная, нежная, мягкая Цвет Белый цвет с приятным оттенком вносимого

джема, равномерный по всей массе Кислотность, оТ, в пределах 156,9 °Т Температура при выпуске с предприятия, оС, не более 4±2 Бактерии группы кишечной палочки не допускаются, в см3

0,01

Патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы, не допускаются, в см3

25

Технологический процесс получения творожной массы осуществляют согласно технологической схеме (рисунок 7).

14

Рисунок 7 - Технологическая схема получения творожной массы, обогащенной БАВ из биомассы каллусных клеток Scutellaria galericulata L. и Trifolium pratense L.

Расчет экономической эффективности производства творожной массы

«Творожная сказка» доказал значительную положительную величину чистой текущей стоимости проекта и индекса доходности. Оптово-отпускная цена упаковки опытного

15

продукта (250 г) составляет примерно 43 рубля, что позволяет рекомендовать ее для включения в «продуктовую корзину» массовому потребителю со средним достатком.

В соответствии с нормативной документацией, ТУ 10.51.56.151-001-02068309-2019, ТИ к ТУ 10.51.56.151-001-02068309-2019, проведена промышленная апробация творожной массы «Творожная сказка» в условиях филиала «Молочного комбината Ялуторовский» (г. Ялуторовск Тюменская область) и в Крестьянском фермерском хозяйстве индивидуального предпринимателя «Зенюк М.А.» (п.г.т. Краснобродский, Кемеровская область).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В соответствии с поставленной целью, в процессе экспериментальной и

аналитической работы были решены все поставленные в диссертационной работе задачи, а также сформулированы следующие выводы:

1. Изучен качественный и количественный состав вторичных метаболитов в растительном сырье и в биомассе каллусных культур шлемника обыкновенного (Scutellaria galericulata L.) и клевера лугового (Trifolium pratense L.). У шлемника обыкновенного идентифицировано восемь биологически активных веществ и в растительном сырье, и в каллусной культуре. У клевера лугового, соответственно, девять в растительном сырье и шесть в биомассе каллусных клеток. Флавоноидами, содержащимися в обоих растительных видах установлены лютеолин и апигенин. Качественный состав БАВ подтвердил перспективность использования экстрактов БАВ из каллусов шлемника обыкновенного и клевера лугового для получения обогащенной творожной массы иммуномодулирующего действия. 2. Исследован микроэлементный состав в биомассе каллусных культур и в растительном сырье шлемника обыкновенного и клевера лугового, собранных на территории Кемеровской области. Количественное содержание тяжелых металлов кобальта, меди, никеля, свинца, кадмия, цинка и марганца соответствует ПДК СанПиН 2.3.2.10733338-01, что дает основание использовать биомассы каллусов шлемника обыкновенного и клевера лугового в технологии получения обогащенной творожной массы. 3. Впервые исследована антимикробная активность байкалина, лютеолина и апигенина из биомассы каллусных клеток шлемника обыкновенного (Scutellaria galericulata L.) и клевера лугового (Trifolium pratense L.) по отношению к 15 тест-культурам палочковидной микрофлоры, кокковой микрофлоры и грибов рода Candida spp. Установлено выраженное антибактериальное действие байкалина и апигенина по отношению к грибам рода Candida spp. Байкалин также оказывал антибактериальный эффект на палочковидную микрофлору и бактериостатическое действие на кокковую микрофлору. Апигенин продемонстрировал бактериостатическое действие и на грамположительные и на грамотрицательные микроорганизмы. Образец, содержащий лютеолин, не влиял на рост численности ни одной тест-культуры. Все исследуемые экстракты не подавляли рост численности Escherichia coli, тем самым, не нарушая эубиоза кишечника человека. Получены высокие значения антиоксидантной активности экстрактов БАВ из каллусов шлемника обыкновенного и клевера лугового.

16

4. Определены оптимальные параметры получения творожной массы, обогащенной экстрактами биологически активных веществ из биомассы каллусов шлемника обыкновенного и клевера лугового. Внесение исследуемых экстрактов БАВ 3% и вишневого джема в количестве 7% способствует получению творожной массы с оптимальными органолептическими, физико-химическими, микробиологическими и токсикологическими показателями. 5. Проведено комплексное исследование показателей качества и биологической ценности творожной массы «Творожная сказка», обогащенной экстрактами БАВ из каллусов шлемника обыкновенного и клевера лугового. Готовый обогащенный продукт имеет следующие физико-химические показатели: массовая доля белка составляет 6,5±0,2%; массовая доля жира – 5,0±0,2%; массовая доля влаги – 38,9±0,02%; титруемая кислотность – 156,9±1,00°Т. В соответствии с рекомендуемыми уровнями потребления пищевых и биологически активных веществ (МР 2.3.1.1915–04), 100 г обогащенной творожной массы удовлетворяют адекватный уровень потребления флавонов (апигенин, лютеолин) на 61 % и изофлавонов (даидзеин) на 0,58 %. Установлен срок хранения творожной массы «Творожная сказка» при температуре (4±2) °С и относительной влажности (80±5) % в герметичной упаковке в течение 10 суток. 6. Разработана технологическая схема производства творожной массы «Творожная сказка», обогащенной экстрактами биологически активных веществ из каллусов Scutellaria galericulata L. и Trifolium pratense L. Иммуномодулирующее действие творожной массы «Творожная сказка» обосновано действием флавонов байкалин, лютеолин и апигенин. Расчет экономической эффективности производства творожной массы «Творожная сказка» доказал значительную положительную величину чистой текущей стоимости проекта и индекса доходности. Оптово-отпускная цена упаковки опытного продукта (250 г) составляет примерно 43 рубля, что позволяет рекомендовать ее для включения в «продуктовую корзину» массовому потребителю со средним достатком. 7. Разработан проект технической документации (ТИ ТУ 10.51.56.151-001-02068309-2019) на творожную массу «Творожная сказка», обогащенную экстрактами БАВ из каллусов шлемника обыкновенного и клевера лугового. Установлено, что творожная масса должна вырабатываться с соблюдением действующих санитарных правил и норм для предприятий молочной промышленности, утвержденных в установленном порядке. Проведена промышленная апробация творожной массы «Творожная сказка» в условиях филиала «Молочного комбината Ялуторовский» (г. Ялуторовск Тюменская область) и в Крестьянском фермерском хозяйстве индивидуального предпринимателя «Зенюк М.А.» (п.г.т. Краснобродский, Кемеровская область).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, рекомендованных ВАК

1. Белашова, О.В. Определение антибактериальной активности флавоноидов из каллуса Scutellaria galericulata L. для разработки функционального творожного продукта / О.В. Белашова, А.В. Заушинцена, Л.А. Леванова, Ю.В. Захарова, А.А. Марьин, Л.К. Асякина // Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий. - 2020. Т. 82. №1 (83). – С. 178-182.

17

2. Белашова, О.В. Сравнительно-морфологическое и анатомическое исследование стебля рода Trifolium L. / Белашова О.В. // Мир науки, культуры, образования: Международный научный журнал. – Горно-Алтайск,2011. - №6(31) часть II. – С. 402-403. 3. Белашова, О.В. Сравнительное анатомо-морфологическое исследование цветка видов рода Trifolium L. / О.В. Белашова, Д.Н. Шпанько // Фундаментальные исследования (научный журнал №1). – Москва: Академия Естествознания, 2012 г. С.143-147. 4. Белашова, О.В. Атлас-определитель рода Trifolium флоры Кемеровской области / О.В. Белашова, Д.Н. Шпанько // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований (научный журнал №6). – Москва: Академия Естествознания, 2012 г. С.7-8.

Статьи в журналах, рекомендованных Web of Science и Scopus 5. Zaushintsena A.V. Extracts of rhodiola rosea L. and Scutellaria galericulata L. in functional dairy products / А. Zaushintsena, Е. Bruhachev, О. Belashova, L. Asyakina, М. Kurbanova, А. Vesnina, N. Fotina // Food and Raw Materials. - 2020. T. 8. № 1. P. 163-170. 6. Dmitrieva A.I. Assessment of the content of heavy metals in medicinal plants of genus trifolium from the growing area on the example of the siberian federal district / A.I. Dmitrieva, O.V. Belashova, I.S. Melenteva, S.A. Ivanova, A.Yu. Prosekov // International Journal of Pharmaceutical Research. – 2020. Vol.12. Issue 4. P. 480-493.

Материалы международных и российских конгрессов, конференций 7. Белашова, О.В. Морфолого-диагностическое исследование Trifolium L. / О.В. Белашова, Д.Н. Шпанько // Фармация и общественное здоровье: материалы ежегодной научн. конференции. - Екатеринбург, УГМА,2011. - С.67-68. 8. Белашова, О.В. Количественное определение суммы флавоноидов в траве рода Trifolium L. на территории Кемеровской области / О.В. Белашова, О.В. Дорогина, Д.Н. Шпанько // Международный научно-исследовательский журнал. - Екатеринбург, 2015. -№11 (42) часть 3. – С. 74-78. 9. Белашова, О.В. Накопление тяжелых металлов растениями рода Trifolium L., произрастающими в Кузбассе / Белашова О.В. // В книге: Гармонизация подходов к фармацевтической разработке. Сборник тезисов II Международной научно-практической конференции. – Москва, 2019. - С. 76-79. 10. Белашова, О.В., Фотина Н.В. Культивирование биомассы каллусных клеток Scutellaria galericulata L. и Trifolium prаtense L. / О.В. Белашова, Н.В. Фотина // В сборнике: Междисциплинарные подходы в биологии, медицине и науках о Земле: теоретические и прикладные аспекты. Материалы XV (XLVII) Международной научной конференции. Электронный ресурс. - Кемерово, 2020. – С. 26-29.

Патент РФ 11. Патент на изобретения РФ «Способ получения творожной массы, обогащенной

концентратами шлемника обыкновенного и клевера лугового» заявл. 03.06.2020;

регистрац. № 2020119274.