INTERNATIONAL JOURNAL OF APPLIED AND FUNDAMENTAL RESEARCH №11,2018

108 BIOLOGICALSCIENCES УДК599.323.4:61:678

БИОРЕЗОРБИРУЕМЫЕ ТРУБЧАТЫЕ МАТРИЦЫ,  ПОЛУЧЕННЫЕ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРМОВАНИЯ  

ИЗ ПОЛИ(L-ЛАКТИДА), В МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ КРЫСЫ1,3Попрядухин П.В., 2,3Попов Г.И., 2,3Юкина Г.Ю., 1,3Добровольская И.П.,  

1,3Иванькова Е.М., 1,3Юдин В.Е.1Институт высокомолекулярных соединений РАН, Санкт-Петербург, e-mail: pavel-pn@mail.ru;

2Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, Санкт-Петербург;

3Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого, Санкт-Петербург

Цельюработыявлялосьисследованиевзаимодействиябиорезорбируемыхтрубчатыхматрицнаосновеполи(L-лактида)соскелетноймышечнойтканьюкрысыдляоценкиперспективностидальнейшегоихис-пользованиявсоставетканеинженерныхпрепаратовврегенеративноймедицинеитканевойинженерииприпротезировании трубчатыхорганов.Методом электроформованияиз раствораполи(L-лактида)полученыбиорезорбируемыетрубчатыематрицы,состоящиеизмикроволоконсаморфнойструктуройполимера.Наосновеисходныхматрицпутемтермообработкиполученыматрицы,состоящиеизчастичнокристалличе-скогополимераслучшимимеханическимисвойствами.Обатипаматрицбылиимплантированывмышеч-нуютканькрысамна сроки6и15месяцев,методами гистологического анализапоказано,чтоматрицы,какисходные,такитермообработанные,имеютвысокуюстепеньбиосовместимостисмышечнойтканьюкрысы,невызываютвыраженнойвоспалительнойреакции,полностьюпрорастаютсоединительнойтканью,имеютдлительныесрокибиорезорбции,чтопозволяетклеткамизокружающихтканейполностьюзапол-нитьвесьсвободныйобъемматрицыисформироватьструктуруморфологическиифункциональноприбли-женнуюкнативной.Высокаябиологическаясовместимостьматрицопределяетвозможностьиспользованияихврегенеративноймедицинеитканевойинженериидляпротезированиятрубчатыхорганов.

Ключевые слова: биоматериалы, полимерные матрицы, поли(L-лактид), биорезорбция

BIORESORABLE TUBULAR MATRIXS RECEIVED BY ELECTROSPINNING  FROM POLY(L-LAKTIDA) IN RAT MUSCULAR TISSUE

1,3Popryadukhin P.V., 2,3Popov G.I., 2,3Yukina G.Yu., 1,3Dobrovolskaya I.P.,  1,3Ivankova E.M., 1,3Yudin V.E. 

1Institute of Macromolecular Compounds, Russian Academy of Sciences, Saint-Petersburg, e-mail: pavel-pn@mail.ru;

2Pavlov First Saint-Petersburg State Medical University, Saint-Petersburg;3Peter the Great Saint-Petersburg State Polytechnical University, Saint-Petersburg

Theaimoftheworkwastostudytheinteractionofbioresorbabletubularmatricesbasedonpoly(L-lactide)withratskeletalmuscletissuetoassesstheprospectsfortheirfurtheruseaspartoftissue-engineeringpreparationsinregenerativemedicineandtissueengineeringinprostheticsoftubularorgans.Byelectroformingfromasolutionofpoly(L-lactide),bioresorbabletubularmatricesconsistingofmicrofiberswithanamorphouspolymerstructureareobtained.Onthebasisoftheinitialmatricesbyheattreatment,matricesconsistingofapartiallycrystallinepolymerwiththebestmechanicalpropertieswereobtained.Bothtypesofmatriceswereimplantedintomuscletissueinratsforperiodsof6and15months;usinghistologicalanalysis,itwasshownthatbothinitialandheat-treatedmatriceshaveahighdegreeofbiocompatibilitywithratmuscletissue,donotcauseapronouncedinflammatoryreaction,fullygrowthroughconnectivetissue,havelongperiodsofbioresorption,whichallowscellsfromsurroundingtissuestocompletelyfill theentirefreevolumeof thematrixandformastructuremorphologicallyandfunctionallyclosetonatiNoah.Thehighbiologicalcompatibilityofmatricesdeterminesthepossibilityoftheiruseinregenerativemedicineandtissueengineeringforprostheticsoftubularorgans.

Keywords: biomaterials, polymer matrix, poly (L-lactide), bioresorption

Длявосстановленияутраченныхструк-турыифункцийоргановитканейсовремен-наярегенеративнаямедицина,транспланто-логия и тканевая инженерия предполагаетприменение тканеинженерных препаратов,состоящихизматрицы,заселеннойстволо-выми или соматическими клетками, либоиспользованиематрицизбиологическиак-тивных материалов без предварительногозаселения их клетками. Насыщение таких

препаратов клетками реципиента проис-ходит из окружающих тканей уже послеих имплантации в живой организм. Вка-честве основы для получения матриц, какправило, используются биосовместимые,биорезорбируемыеполимеры,такиекакпо-лилактид,поликапролактон,полигликолид,полигидроксиалканоаты,хитозан,коллаген,альгинат.Матрицаможетиметьразличнуюструктуру: в виде пористой или непори-

МЕЖДУНАРОДНЫЙЖУРНАЛПРИКЛАДНЫХ ИФУНДАМЕНТАЛЬНЫХИССЛЕДОВАНИЙ №11,2018

109 БИОЛОГИЧЕСКИЕНАУКИ стой пленки, губки, нетканого материала,а также в виде трубки или волокна [1–3].Разнообразие полимеров и получаемых наих основе матриц,широта их применениявразличныхорганахитканяхприразлич-ныхпатологиях ставит перед исследовате-лямивопросостепенибиосовместимости,функциональности интегрируемых в орга-низмбиоинженерныхпрепаратов,скоростиимеханизмеихбиорезорбции.Заболеваниятрубчатыхорганов,такихкаккровеносныесосуды, трахея, бронхи, пищевод, различ-ные отделы кишечника, мочеточник и мо-чеиспускательный канал, встречаются до-статочно часто. Всвязи с этим получениетрубчатых тканеинженерных препаратовдля протезирования трубчатых органовприобретаетособуюактуальность.

Одним из наиболее перспективныхспособов получения матриц для последу-ющего создания тканеинженерных препа-ратов является метод электроформованиянано-имикроволокон[4,5].Методзаклю-чается в подаче раствора полимера черезподающий электрод-фильеру в электриче-ское поле, где струя раствора распадаетсянамикро-инаноструи,которыесвысокойскоростьюоседаютнаприемномэлектродев виде микро- или нановолокон в зависи-мостиотсвойствраствораирастворенногов нем полимера. Врезультате получаютсянетканые волоконные 3D структуры с си-стемой открытых пор[6]. Такое строениенепрепятствуетмиграцииклетокиз окру-жающих тканей во весь объем матрицыи способствует достаточно интенсивномуобмену питательными веществами и газа-ми между заселяемой клетками матрицейи окружающими ее нативными тканями.При использовании приемного электро-да в виде вращающегося металлическогостержня, на его поверхности формируетсятрубчатая нетканая волоконная структура,котораявдальнейшемможетбытьисполь-зована в качествематрицыприразработкетканеинженерногопрепаратадлятрубчатыхорганов.

В свою очередь, одним из наиболееперспективных полимеров для полученияматриц является полилактид – алифати-ческий полиэфир, мономером которогоявляется молочная кислота, сырьем дляпроизводства молочной кислоты являютсявозобновляемые растительные источники.Полилактиды и сополимеры на их основеприменяются для производства биодегра-дируемой пищевой упаковки и одноразо-вой посуды, медицинских шовных нитей,стентов, штифтов и винтов для травмато-логии [7, 8]. Ворганизме полилактид раз-рушается до молочной кислоты, которая

является естественным метаболитом и ус-ваиваетсяокружающимиклетками[9].

Целью работы  являлось исследованиевзаимодействиябиорезорбируемойтрубча-тойматрицынаосновеполи(L-лактида)или(L-ПЛА),полученнойметодомэлектрофор-мования, со скелетной мышечной тканьюкрысы для оценки перспективности даль-нейшегоееиспользованиявсоставеткане-инженерных препаратов в регенеративноймедицине и тканевой инженерии при про-тезированиитрубчатыхорганов.

Материалы и методы исследованияДля получения матриц использовался L-ПЛА

«PurasorbPL-10»производствафирмыCorbionPurac(Нидерланды).L-ПЛАрастворяливхлороформе,рас-творполимераконцентрацией15%(мас.)налабора-торной установке Nanon-01A (Япония) с помощьюинжекторного насоса подавали через электрод-фи-льерувэлектрическоеполе(напряженностью16кВ),расстояние между электродами составляло 150 мм,осаждение волокон происходило на вращающийсясоскоростью1500об/минцилиндрическийэлектроддиаметром 1,1 мм. Полученные трубчатые образцыимеливнутреннийдиаметр1,1ммитолщинустенки320мкм.

Электронно-микроскопические исследованияобразцов проводили на сканирующем электронноммикроскопеSupra 55VP (CarlZeiss, Германия) в ре-жимерегистрации вторичных электронов, с предва-рительным нанесением тонкого слоя платины. Об-разцыпослеэкспозициивживотныхпредварительнофиксировалисьв10%нейтральномформалине.

Исследованиеструктурыполимераматрицыпро-изводилосьметодомрентгеноструктурногоанализанаустановкеWAXD,BrukerD8DISCOVER(Германия).

Температурыстеклования,плавленияикристал-лизацииПЛАопределялисьспомощьюдифференци-альнойсканирующейкалориметрии(ДСК)DSC204F1Phoenix,Netzsch(Германия),ватмосфереаргона.

Эксперименты in vivo проводили на самцах бе-лых крыс Wistar в соответствии с правилами про-ведения работ с использованием эксперименталь-ных животных (принципы Европейской конвенции,Страсбург, 1986 г., иХельсинкская декларацияВсе-мирной медицинской ассоциации о гуманном об-ращении с животными 1996 г.). Вес подопытныхживотныхсоставлял180–200 г, возраст–3мес, ко-личество–10шт.Животныхоперировалиподобщейанестезией(растворыZoletil100–0,1млиRometarum 20мг/мл–0,0125млна0,1кгмассыживотного,ин-траперитонеально).Матрицы длиной 4 мм помеща-ливширочайшуюмышцуспины(musculus latissimus dorsi)крысысобеихсторон:соднойстороныисход-наяматрица,асдругойтермообработанная.Былоис-пользованопо5животныхнакаждыйсрокэкспери-мента.ПослеимплантациираныпослойноушивалиатравматическимиигламиснитьюProlen4-0.Посленаложениянаружныхшвовкрыссодержаливинди-видуальныхклетках,животныеполучалисвободныйдоступ к воде и стандартную диету. Все животныебыли активны, негативного влияния имплантацииматериалов не выявлено, о чем свидетельствовалиобщеесостояниеиотсутствиевоспалительныхпро-цессоввзонеимплантации.

INTERNATIONAL JOURNAL OF APPLIED AND FUNDAMENTAL RESEARCH №11,2018

110 BIOLOGICALSCIENCES

Для морфологического исследования через 6и15месяцевфрагментымышечнойтканисматрица-ми фиксировали в 10% нейтральномформалине нафосфатномбуфере(рН7.4)неменее24ч.Используястандартную гистологическую методику со спирта-ми возрастающей концентрации,материал заливаливпарафиновыеблоки.Срезытолщиной5мкмгото-вилиспомощьюмикротомаAccu-CutSRT200(Saku-ra, Япония) и окрашивали гематоксилином Майераи эозином (Bio-Optica, Италия). Визуализацию со-единительной ткани проводили по методуМаллори(БиоВитрум). Препараты изучали в поле световогомикроскопаDM-750(Leica,Германия)сиспользова-ниемокуляра10×,объективов4,10,40,100×.Записьцифровыхизображенийвыполнялиспомощьюфото-камерыICC50(Leica,Германия).

Результаты исследования  и их обсуждение

Нарис.1приведенымикрофотографиитрубчатых матриц, полученных из раство-ра L-ПЛА методом электроформования,изкоторыхвидно,чтоматрицыимеютпо-ристую структуру с открытой системойпор,соединенныхдругсдругомивнешней

средой каналами. Такая структура позво-ляет питательным веществам, продуктамжизнедеятельности клеток, раствореннымгазам свободно циркулировать в объемематрицы, а размерпор10–50мкм способ-ствует свободной миграции клеток. Вну-тренний диаметр полученных матриц со-ставляет1,1мм, толщинастенки320мкм,волокна не имеют преимущественнойориентации, между ними располагаютсяпоры (рис.1,а,б). Данные рентгенострук-турного анализа и ДСК показали, что по-лимер вмикроволокнахматрицыобладаетаморфной структурой. При имплантациитакихматрицвживойорганизмврядеслу-чаевможетнаблюдатьсяихдеформацияподдавлениемокружающихтканей,нарушениецелостности стенки, ее расслоение в ме-стахконтактасшовнойнитью.Этосвязановпервуюочередьсмеханическимихаракте-ристикамиматриц,чтобылопоказанонамиранее[10]. Для улучшения механическиххарактеристик часть матриц подвергаласьтермообработке в фиксированном на при-

а) б)

в) г)

Рис. 1. Электронные микрофотографии исходной (а, б) и термообработанной матрицы (в, г)

МЕЖДУНАРОДНЫЙЖУРНАЛПРИКЛАДНЫХ ИФУНДАМЕНТАЛЬНЫХИССЛЕДОВАНИЙ №11,2018

111 БИОЛОГИЧЕСКИЕНАУКИ емном электроде состоянии при T=70°Cвтечение1часа,приэтомпроисходилача-стичная кристаллизация полимера – около44%,поданнымДСКирентгеноструктур-ногоанализа.Приэтомнаблюдаласьусадкаволокон с уменьшением толщины стенкиматрицыдо 250мкми уплотнениемволо-коннойструктуры,внутреннийдиаметрприэтомоставалсянеизменным(рис.1,в,г).

В экспериментах на животных исполь-зовались исходные и термообработанныематрицы.Через6месяцевэкспозициивмы-шечнойтканимакроскопическивокругобеихматрицопределяютсяумеренновыраженныесоединительнотканныекапсулы,равномерноихпокрывающие, рубцовыепроцессывме-стеимплантацииневыражены.

Морфологическийанализисходнойма-трицыпоказал,чтоеёвнутреннийпросветне определяется ввиду смыкания стенок

(рис.2,а), соединительнотканная капсулавокруг матрицы без признаков воспали-тельной реакции. Стенка матрицы заселе-наклеткамисоединительнойткани,междуволокнамивыявляютсявосновномфибро-бласты,макрофаги,единичныелейкоциты,по периферии матрицы встречаются не-многочисленные гигантскиемногоядерныеклетки инородных тел. Сформированныезрелыеколлагеновыеволокнарасполагают-сямеждуволокнамиL-ПЛАвовсейстенкематрицы. Оформленные пучки коллагено-выхволоконразделяютматрицунапласты,вовнешнихслояхматрицыпучковколлаге-новых волокон большеи они расслаиваютматрицу на большее количество пластов.Наблюдаютсяпервыепризнакиначалабио-резорбции: поперечные трещины микро-волокон и слабовыраженная их пористаяструктуранасрезе(рис.1,б).

а) б)

в) г)

Рис. 2. Гистологические срезы и электронные микрофотографии матриц через 6 мес после имплантации в мышечную ткань крысы, исходной (а, б)

и термообработанной (в, г), а, в – окраска гематоксилином и эозином, об. ×10

INTERNATIONAL JOURNAL OF APPLIED AND FUNDAMENTAL RESEARCH №11,2018

112 BIOLOGICALSCIENCES

Морфологический анализ термообра-ботаннойматрицывыявил,чточерез6ме-сяцев пребывания в мышечной ткани ма-трица сохраняет свой внутренний просвет(рис.2,в),в2случаяхиз5выявленонеко-тороеуплощение,врезультатечегопросветприобреловальнуюформу,всоединитель-нотканнойкапсулевокругматрицынеопре-деляется воспалительной реакции. Стенказаселенафибробластами,макрофагами,попериферии с наружной стороны матрицывыявляютсяединичныегигантскиемного-ядерные клетки инородных тел. Зрелыеколлагеновые волокна пронизывают всютолщу стенки матрицы, пучков коллаге-новых волокон не формируется, разделе-ниестенкиматрицынапластыотсутству-ет. Также наблюдаются признаки началабиорезорбции в виде поперечных трещинмикроволокон, их пористая структура,выраженность этих признаков выше, чемуисходныхматриц(рис.2,г).

Приэксплантациичерез15месяцев ис-ходной и термообработанной матриц во-

кругобеихмакроскопическиопределяютсяумеренновыраженныесоединительноткан-ные капсулы, равномерно покрывающиематрицы, рубцовые процессы в месте им-плантации не выражены, Морфологиче-скаякартинанаданномсрокеэкспериментав целом схожа с таковой через 6 месяцевэкспозиции.

Морфологическийанализисходнойма-трицы показал отсутствие воспалительнойреакции в соединительнотканной капсулевокруг матрицы. Внутренний просвет неопределяется, значимыхизмененийформыиразмеровнепроизошло(рис.3,а).Стенкаматрицыполностьюзаселенафибробласта-ми,макрофагамииединичнымигигантски-ми многоядерными клетками инородныхтел,располагающимисяпопериферии.Во-локна коллагена пронизывают всю стенкуматрицы, преобладая с наружной и вну-треннейстороны.Пучкиколлагеновыхво-локонболеетолстыепосравнениюстако-выми на предыдущем сроке экспериментаи располагаются неупорядоченно друг от-

а) б)

в) г)

Рис. 3. Электронные микрофотографии матриц через 15 мес после имплантации в мышечную ткань крысы, исходной (а, б) и термообработанной (в, г)

МЕЖДУНАРОДНЫЙЖУРНАЛПРИКЛАДНЫХ ИФУНДАМЕНТАЛЬНЫХИССЛЕДОВАНИЙ №11,2018

113 БИОЛОГИЧЕСКИЕНАУКИ носительно друга, разделяя стенку матри-цынапласты.Признакибиорезорбциивы-раженызначительнее,чемчерез6месяцевэкспозиции,микроволокнаболеефрагмен-тированныеиболеепористые(рис.3,б).

Морфологический анализ термообрабо-танной матрицы выявил отсутствие воспа-лительнойреакциивокружающейеесоеди-нительнотканной капсуле. Во всех случаяхнаблюдается уплощение матриц с полнымзакрытием просвета (рис.3,в). Визуальносоединительнотканных клеток в стенке ма-трицы больше, по сравнению с исходнойматрицейнааналогичномсрокеэксперимен-та. Выявляются в основном фибробласты,фиброциты, макрофаги и единичные ги-гантские многоядерные клетки инородныхтел. Стенкаматрицы полностью пронизанаколлагеновымиволокнами,нопоперифериистенки, как с внешней, так и с внутреннейстороныколлагеновыхволоконбольше.Од-накоразделениястенкиматрицынапластыне происходит. Наблюдаются выраженныепризнаки биорезорбции матрицы, большаячасть микроволокон резорбирована, остав-шиеся волокна определяются в виде им-прегнированных в соединительную тканьотдельных высокопористых фрагментов(рис.3,г). Большая скорость биорезорбциитермообработанных матриц, возможно, вы-звана неоднородностью полимерной струк-турымикроволокон,аименноналичиемкри-сталлическихиаморфныхобластей.

ЗаключениеПоказано, что трубчатые матрицы на

основе(L-ПЛА)какисходные,такитермо-обработанныеимеютвысокуюстепеньбио-совместимостисмышечнойтканьюкрысы,не вызывают выраженной воспалительнойреакции, полностью прорастают соедини-тельной тканью. Матрицы имеют длитель-ные сроки биорезорбции, что позволяетклеткамизокружающихтканейполностьюзаполнить весь свободный объем матрицыисформироватьструктуру,морфологическии функционально приближенную к натив-ной. Однако исходные матрицы обладают

слабо выраженными каркасными свойства-ми, что приводит к сдавливанию их окру-жающими тканями и закрытию функцио-нально значимого внутреннего просвета.Термообработанныематрицы,напротив,об-ладаютвыраженнымикаркаснымисвойства-ми,несклонныкрасслаиваниюстенкиимо-гутбытьрекомендованыдляиспользованиявсоставетканеинженерныхпрепаратоввре-генеративноймедицинеитканевойинжене-риидляпротезированиитрубчатыхорганов.

Работа выполнена при поддержке Россий-ского научного фонда, проект № 14-33-00003.

Список литературы

1.ДобровольскаяИ.П.,ЮдинВ.Е.,ПопрядухинП.В.,ИваньковаЕ.М.Полимерныематрицыдлятканевойинже-нерии.СПб.:Изд-воИздательско-полиграфическаяассоци-ацияуниверситетовРоссии,2016.224с.

2.Reis R.L., Neves N.M., Mano J.F., Gomes M.E.,MarquesA.P.,Azevedo H.S. Natural-based polymers for bio-medicalapplications.WoodheadPublishing,2008.832p.

3.AkilbekovaD.,ShaimerdenovaM.,AdilovS.,BerilloD.Biocompatible scaffolds based on natural polymers for regen-erativemedicine.Int.J.Biol.Macromol.2018.Vol.22.№114. P.324–333.

4.LannuttiJ.,RenekerD.,MaT.,TomaskoD.,FarsonD.Electrospinning for tissue engineering scaffolds. Mat. Sci.Eng:C,2007.Vol.27.№3.P.504–509.

5.HasanA.,MemicA.,AnnabiN.,HossainM.,PaulA.,DokmeciM.R., Dehghani F., KhademhosseiniA. Electrospunscaffolds for tissue engineering of vascular grafts.Acta Bio-mater.2014.Vol.10.№1.P.11–25.

6.Dobrovolskaya I.P., Popryadukhin P.V., Yudin V.E.,Ivan’kovaE.M.,ElokhovskiyV.Yu.,WeishauptovaZ.,BalikK.Structureandpropertiesofporousfilmsbasedonaliphaticco-polyamide developed for cellular technologies. J. Mater. Sci.Mater.Med.2015.Vol.26,№1.P.5381–5391.

7.LuoQ.,HuangC.,WangS.,MengJ.,LiZ.,ChangZ.,ZhuY.,HuaZ.Comparativestudyofdegradationbehaviorofbi-oresorbablecardiovascularscaffolds.Cardiovasc.Eng.Technol.2015.Vol.6.№1.P.71–79.

8.HamadK., KaseemM.,Yang H.W., Deri F., KoY.G.Propertiesandmedicalapplicationsofpolylacticacid:Areview.ExpressPolym.Lett.2015.Vol.9.№5.P.435–455.

9.Gunatillake P.A.,Adhikari R. Biodegradable syntheticpolymersfortissueengineering.Eur.Cell.Mater.2003.Vol.5.P.1–16.

10.PopryadukhinP.V.,PopovG.I.,YukinaG.Yu.,Dobro-volskayaI.P.,Ivan’kovaE.M.,VavilovV.N.,YudinV.E.Tissue-engineered vascular graft of small diameter based on electro-spunpolylactidemicrofibers.Int.J.Biomater.2017.ArticleID9034186.