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(Imai S et. al. Biol Pharm Bull 2006, Yoshikawa M et. al. unpublished data)
(Nature Medicine 2007)
1.
2.
3. SPECT (Nature Medicine 13, 504-509)
1. Yoshikawa M, Mukai Y, Okada Y, Yoshioka Y, Tsunoda S, Tsutsumi Y, Okada N, William CA, Doi Y, Nakagawa S, Ligand independent assembly of purified soluble Magic Roundabout (Robo4), a tumor-specific endotherial marker. Protein Expr Purif.,2008
2. Yoshikawa M, Motoshima K, Fujimoto K, Tai A, Kakuta H, Sasaki K : Pyridinium Cationic-dimer Antimalarials, unlike Chloroquine, affect selectively between the Schizont Stage and the Ring Stage of Plasmodium falciparum. Bioorg Med Chem.,2008..
3. Kamei K, Mukai Y, Kojima K, Yoshikawa T, Yoshikawa M, Kiyohara G, Yamamoto TA, Yoshioka Y, Okada N, Seino S, Nakagaawa S, Direct cell entry of gold/ion-oxide magnetic nanoparticles in adenovirus gene delivery., Biomaterials, 2008
Motoshima K, Hiwasa Y, Yoshikawa M, Fujimoto K, Tai A, Kakuta H, Sasaki K : Antimalarial Cation-dimers Synthesized in Two Steps from an Inexpensive Starting Material, Isonicotinic Acid. ChemMedChem., 2007
( 1 ) 1. Yoshikawa M, Mukai Y, Shibata H, Yoshioka Y, Abe Y, Nomura T, Taniai M, Ohta T, Tsunoda S, Kamada H, Nakagawa S, Tsutsumi
Y: The development of fully active receptor selective tumor necrosis factor mutants, 12th International TNF Conference, Spain, April 2009
5
( 2 ) (DC1)
Q
Dissociation from dsDNA and fluorescence dequenching
F
Q
F
Triplex formation with target dsDNA
Q F
Self-digestion triggered by triplex
1
F Q
2 (A B)
AB
B
A
CYPCYP CYP
CYP1A2 CYP2C9 CYP2C19 CYP2D6 CYP3A4 90% SNP
SNPSNP
CYPCYP CYP
CYP CYP
CYPSNP CYP
Kd KmCYP
CYPCYP
SPR; surface plasmon resonanceBiacore
CYP
20 mM NaBH40.5 mM NaBH4
CYP
CYP CO CYPCO 450 nm 420 nm CO
CYP CYP
400 nmCYP 400 nm Soret
400 nmCYP
CYP
CYPCYP
CYP2C9Kd
CYP 1A2 2C19 2D6 3A4 SNPCYP
Sayed M. S. Ali CYP2C19
CYPCYP
CYP
CYP
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1
平成 21年度大学院教育改革支援プログラム
提案型共同研究プログラム 報告書
抗体を利用した分子イメージングによる腫瘍血管発達研究
研究代表者 吉川 舞 大阪大学大学院薬学研究科 薬剤学分野 D1
研究要旨
本研究は、腫瘍血管表面上のマーカー分子をターゲティングでき、かつ細胞内へと効率的に取り込まれる細胞内
侵入抗体を単離し、それをイメージングプローブとして応用することにより、バックグラウンドの低い効率的な腫瘍
血管イメージングを達成しようとするものである。
A. 研究目的
近年の疾患プロテオミクス研究の進展に伴い、癌
をはじめとする難治性疾患の発症や悪化に関わる分
子が次々と同定されている。このような中、これら
の分子を標的にし、その働きを直接的に制御しよう
とする分子標的医薬に大きな期待が寄せられている。
しかし、分子標的医薬の効果は、各患者の標的分子
の発現量によって大きく異なり、特に標的分子陰性
の患者に対しては効果がほとんどなく、副作用のみ
を誘発してしまうおそれがある。そこで、分子の発
現状態を体外から可視化可能な技術、分子特異的イ
メージングが必要とされている。分子特異的イメー
ジングが実現すれば、あらかじめ治療効果を予測し
て治療薬を選択したり、病気の進行や治療効果をモ
ニタリングすることが可能になり、分子標的療法の
有用性を最大限に発揮することができるものと考え
られる。この点、著者らはとりわけ標的分子特異性
に優れ、強固な結合力を有するモノクローナル抗体、
中でも、抗原結合後、細胞内に移行する抗体である
細胞内侵入抗体に着目した。細胞内侵入抗体は標的
細胞に積極的に取りこまれ、通常の抗体と比較して
速やかに血中から消失するとの報告があり(Cancer Res. 2009)、著者は、細胞内侵入抗体をイメージングに用いれば、速やかに血中から標的分子発現細胞
内へ移行した抗体により、標的分子をより感度よく
イメージングできるものと考えた。また、細胞内侵
入抗体に、細胞内の酸性環境下でのみ蛍光を示す
pH感受性蛍光色素を標識しイメージングに利用すると、血液中を循環するものや非特異的に吸着した
ものによるバックグラウンドを最小限に抑え感度の
良いイメージングが達成可能であることが報告され
ている (Nat Med. 2009)。しかし、細胞内侵入抗体
はこのように優れたイメージング性能を秘めた素材
であるにも関わらず、その効率的な単離法が未だ確
立されておらず、単離に到るまでに多大な時間と労
力を要してしまう。そこで、本研究では、近年腫瘍
血管新生マーカーとして注目されている血管内皮増
殖因子受容体 2型、VEGFR2をモデル標的分子とし、独自のファージ表面提示法を駆使することで、迅速
かつ簡便に細胞内侵入抗体を探索しうる技術の確立
とその分子特異的イメージングへの応用を試みた。
B. 研究方法
B‐1.VEGFR2免疫抗体ライブラリの構築
BALB/c マウス (メス、6‐7 週齢、日本 SLC) に対し、
VEGFR2 組みかえ蛋白質(R&D Corporation, USA)と
Titer Max Gold (Sigma‐Aldrich Corporation, USA )を等
量混合し、エマルジョンとしたものを、抗原蛋白質量とし
て 25 g/mouse となるように、マウス頸部皮内、左脚筋肉内に数箇所に分けて投与した (1 次免疫 day 0)。2
週間後 (day 14) に同様の方法でエマルジョンを作製
し、追加免疫を行なった (2 次免疫)。その 1 週間後
(day 21) に尾静脈より採血し、後述する方法で血清中
の各抗原特異的な抗体価を測定した。以下、VEGFR2
特異的な抗体が誘導されたマウス脾臓中の遺伝子をも
とに、既に報告している方法 (Imai S. et al, Biol Pharm Bull. 2006)により抗体ライブラリの構築を行った。
B‐2. 抗 VEGFR2抗体提示ファージの濃縮
VEGFR2 組み換え蛋白質及び、抗 FLAG 抗体
(Sigma‐Aldrich corporation, Louis, MO) を
carbonate‐bicarbonate Buffer (Sigma‐Aldrich
corporation, Louis, MO) で希釈し、イムノプレート
（ Nalge Nunc International, Rochester, NY)に 0.1
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2
g/100 L/wellで添加し、一晩 4°Cで静置して固相化
した。PBS で洗浄後、4% Block Ace (DS pharma
Biomedical Co. Ltd.) 300 Lを各wellに添加し、37°C、
2時間のブロッキングを行った。抗 FLAG抗体を固相化
したwellを PBSで洗浄後、0.4% Block Ace (DS pharma
Biomedical Co. Ltd.)で希釈した 100 Lのファージ溶液
を添加し、室温で 1 時間静置した。次に 0.05%
Tween/TBSで 3回 washすることで非特異的なクローン
を除き、100 Lの 10 mM Glysine-HCl (pH2.0)を添加し
4°Cで 10分間静置することにより結合ファージを溶出し
た。溶出したファージは、直ちに 50 Lの 1 M Tris-HCl
(pH 8.0)で中和し、そのうち 100 Lを各抗原（Nef, Vif）
へと添加し、室温で 1 時間静置した。これを 0.05%
Tween/TBSで 3回 washすることで非特異的なクローン
を除き、100 Lの 10 mM Glysine-HCl (pH2.0)を添加し
4°Cで 10分間静置することにより結合ファージを溶出し
た。溶出されたファージは、直ちに 50 L の 1 M
Tris-HCl (pH 8.0)で中和した。ファージは大腸菌 TG1
株に感染させ、増殖させた後、ファージを産出し、再度
パンニング操作を行った。
B-3. 細胞内侵入抗体のスクリーニング
B-3-1. 毒素蛋白質融合蛋白質の誘導
抗VEGFR2抗体濃縮ライブラリ中のscFv遺伝子を制限
酵素NcoIとNotI(TOYOBO, Inc, Japan)で切り出し、同様
に処理しておいたpY07（pY03'-FLAGに毒素蛋白質遺
伝子を組み込んだもの）に、ligation kit Ver.2 (Takara,
Inc, Japan)を用いて組み込むことで、scFvライブラリと毒
素Xとの融合体を発現するプラスミドを構築した。これを
TG1に形質転換し、得られたコロニーを96穴プレートへ
ランダムにピックアップして50 g/mLアンピシリン、2%グ
ルコース含有 2YT培地 200 μL/well中でDeep well
maximizer (TAITEC, Inc, Japan)を用い、37°C、600 rpm
で一晩培養した。この一晩培養した培養液10 μLを、50
g/mLアンピシリン、2%グルコース含有2YT培地100 μL
を新たに添加したプレートに添加し、OD600= 0.4まで培
養した。次に、プレートごと、3,000 rpmで20分間遠心し
た後、上清を除き、1mM IPTG、50 g/mLアンピシリン
含有2YT培地200 Lを添加し、Deep well maximizer
(TAITEC, Inc, Japan)を用いて37°C、600 rpmで12時間
培養することにより、毒素X融合蛋白質を培養上清中へ
誘導した。再び3,000 rpmで20分間遠心し、上清を回収
して以降のスクリーニングに供した。
B-3-2. scFv-毒素蛋白質含有大腸菌培養上清の細胞
傷害スクリーニング
96穴プレートに 5.0 × 103cells/100 L/wellに希釈した
MS1細胞、を播種し、37°C、飽和蒸気圧、5%炭酸ガス
気相下で24時間培養した。次いで、毒素蛋白質融合蛋
白質を含む大腸菌培養上清をそれぞれ50 Lずつ加え、
37°C、飽和蒸気圧、5%炭酸ガス気相下で24時間培養
した。この際、ネガティブコントロールとしてpY02を遺伝
子形質転換したTG1培養上清を50 L、ポジティブコン
トロールとして終濃度1 mg/mLのシクロヘキシミドを細胞
上へと添加し、同様の条件で培養した。その後、生細胞
数計数キット（nacalai tesque, Inc, Japan）を用い、細胞生
存率（viability）を添付文書に基づき、wst-8 assayにより
測定した。なお、viabilityは終濃度1 mg/mLのシクロヘ
キシミドを加えた群を0%、pY02を形質転換したTG1の
培養上清を加えた群を100%として算出した。
B-3-3. 大腸菌培養上清を用いた ELISA
VEGFR2 組み換え蛋白質を carbonate-bicarbonate
Buffer (Sigma-Aldrich corporation, Louis, MO) で希釈
し、イムノプレート（Nalge Nunc International, Rochester,
NY)に 0.1 g/100 L/wellで添加し、一晩 4°Cで静置し
て固相化した。PBS で洗浄後、4% Block Ace (DS
pharma Biomedical Co. Ltd.) 300 Lを各 wellに添加し、
37°C、2 時間のブロッキングを行った。ここに、等量の
4% Block Ace (DS pharma Biomedical Co. Ltd.)と混合
し、1 時間 4°C 条件下静置することによりブロッキングし
た大腸菌培養上清を添加し、室温で一時間反応させた。
0.05% Tween TBS で 3 回洗浄したのち、0.4% Block
Ace (DS pharma Biomedical Co. Ltd.)で 50 ng/mLに希
釈した anti M13 antibody (GE Healthcare, UK Ltd.)と室
温で１時間反応させた。さらに 0.05% Tween/PBS で三
回洗浄し、基質溶液 TMBZ (Bio-Rad Laboratories, Inc,
San Diego, CA)を加えて発色させた。10-15 分後、2 N
硫酸で反応を停止し、吸光度（測定波長 450 nm、対照
波長 655 nm)をマイクロプレートリーダー（Molecular
devices analytical technologies, Inc, sunnyvale, CA)で測
定した。
B-4. 細胞内侵入抗体による分子特異的イメージング
CypHer5E-scFv及びCy5.5-scFvはそれぞれ、50 gの
CypHer5E-NHS (GE Healthcare, UK Ltd.), Cy5.5-NHS
(GE Healthcare, UK Ltd.) を PBS:0.5 M Sodium
carbonate Buffer = 1:8溶液に溶解し、全量 100Lとした
ものに 1 mg/mLに調整した scFvリコンビナント蛋白質溶
液 100 Lを混合し、室温で一時間インキュベートするこ
とにより作製した。次に反応液を CypHer5E-scFv を
Sephadex column G-25 (GE Healthcare, UK Ltd.)に添
加し、PBS:0.5 M Sodium carbonate Buffer = 1:8溶液
で 100 L ずつ溶出することにより遊離の CypHer5E と
CypHer5E-scFv を分離精製した。各フラクションについ
て蛋白質濃度を OD280 の吸収から、蛍光色素量を
OD500 の吸収から算出し、両ピークが一致したフラクショ
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3
ンを CypHer5E-scFv を含むものとして回収した。作製し
た CypHer5E-scFv及び Cy5.5-sc}Fvは 8穴チャンバー
スライド (Nunc)に予め 1 x 104 cells/100 L/wellで播種
した MS1細胞上に終濃度 5 g/100 L/well となるよう
に添加し、37°C、暗所、5%炭酸ガス飽和蒸気圧下で 6
時間培養した。これを、PBSで3回洗浄したあと、4% パ
ラホルムアルデヒド（PFA）を用いて固定し、Biozero
BZ-8000 (KYENCE corporation, Inc. Japan)を用い BZ
filter Texas Red (KYENCE corporation, Inc. Japan)によ
り赤色蛍光を観察した。
C．研究結果
C-1. VEGFR2免疫ファージ抗体ライブラリの構築
マウスに VEGFR2 リコンビナント蛋白質を免疫し、、抗
体価の上昇が観察されたマウスの脾臓中の遺伝子情報
をもとに scFv 遺伝子ライブラリの構築を試みた。まず、
免疫マウス脾臓中の mRNA から cDNA を合成し、これ
をテンプレートに独自のプライマーセットを用いて抗体
遺伝子の VL、VH 遺伝子断片を各々増幅した。また、
各々この両遺伝子を assembly PCR により連結し、scFv
遺伝子ライブラリとした。さらに、本 scFv 遺伝子断片を
制限酵素処理し、pY03'にライゲーションした後、大腸菌
TG1 株にエレクトロポレーション法により形質転換したと
ころ、その効率は、3 x 108 CFUであった。大腸菌は、1
つの菌体に 1 種類のプラスミドしか保持し得ないという
事実から、この形質転換効率はライブラリサイズに概算
される。従って、本結果は、今回作製したライブラリが、
実に 3 億種類もの抗体遺伝子で構成されていることを
示している。
C-2. ライブラリ中の VEGFR2高親和性抗体の濃縮
細胞内侵入抗体を単離するにあたり、まずは抗原結合
性に着目して作製したライブラリの中から、VEGFR2 高
親和性を有するクローンの濃縮を試みた。濃縮は、ファ
ージライブラリを固相化抗原へと添加し、抗原に結合す
るもののみを大腸菌へと感染・増幅する、パンニングと
呼ばれる手法を繰り返すことにより行った。作製した
VEGFR2 免疫ファージ抗体ライブラリをマウス抗原
VEGFR2 組み換え蛋白質に対し 4 回パンニングを行っ
たところ、VEGFR2 高親和性抗体提示ファージの濃縮
の指標を示す output/input ratioが、パンニングを重ねる
に従い、約 100 倍にも上昇した。本結果は、パンニング
によって、VEGFR2 特異的な抗体を提示するファージ
が濃縮されていることを示唆している。
C-3. 細胞内侵入抗体のスクリーニング
著者らは、毒素蛋白質 X(以下、毒素 X)をファージ表
面提示法と融合的に用いることで抗原結合性と細胞内
侵入活性の双方を同時にスクリーニング可能な方法を
考案した。この毒素 X はそれ単独では細胞傷害性を持
たず、細胞内に取り込まれたときのみ細胞傷害性を示
すことができる。従って、ライブラリ中のクローンを毒素 X
との融合蛋白質として誘導し、その細胞傷害性を評価
すれば、抗体が細胞内侵入活性を有している場合のみ、
毒素 X による細胞傷害性が発揮される。そこで、まず、
VEGFR2 高親和性抗体を濃縮したライブラリ中の scFv
遺伝子をライブラリごと一挙に毒素 X 融合蛋白質発現
用ベクターに組み替えた。次に、それを大腸菌 TG1 株
に形質転換して 96穴プレート上でモノクローン化したの
ちに、その培養上清中に scFv-毒素Xを誘導した。細胞
内侵入抗体にはこの培養上清をそのまま用い、結合性
を ELISAで、細胞内侵入活性をVEGFR2発現MS1細
胞に対する細胞障害性試験により評価した。今回、320
クローンについて評価したところ、98 クローンが ELISA
でVEGFR2親和性を示し、そのうち、17クローンはMS1
細胞に対する細胞傷害性も示すことが明らかとなった。
これは、この 17 クローンが抗原結合性と細胞内侵入活
性を兼ね備えた細胞内侵入抗体であることを示している。
なお、この 17 クローンと細胞内侵入活性はないものの、
抗原結合性を示した残りの 81 クローンについて、それ
ぞれシークエンス解析を行ったところ、細胞内侵入抗体
2 種類と、細胞内非侵入抗体 23 種類を同定することが
できた。
C-4. 細胞内侵入抗体、非侵入抗体の特性評価
C-4-1.抗体蛋白質の作製とその抗原結合性評価
C-3 項で単離した細胞内侵入抗体と非侵入抗体につ
いてより詳細に特性を評価すべく、それぞれを代表して
V2-01, V2-02を選択し、その scFv リコンビナント蛋白質
を大腸菌を用いた方法により作製した。作製した蛋白質
は SDS-PAGE により高純度であることを確認したのちに、
その抗原結合性を BIACore を用い、SPR 法により評価
した。その結果、V2-01とV2-02はKd値にして 1 nM程
度のほぼ同等の抗原結合性を示した。また、この抗原
結合性はVEGFR2に対する中和抗体として世界的によ
く知られている IgG型の抗体DC101 とほぼ同等であり、
非常に強い結合性を有していることが判明した。
C-4-2.細胞内侵入抗体の細胞内移行量の定量
蛍光色素 Cy5.5 で標識した V2-01scFv 及び
V2-02scFv を VEGFR2 発現細胞 MS1 細胞へと作用さ
せ、PBS で 3 回洗浄したのちに、①そのまま、あるいは
②トリプシン消化した後に、フローサイトメトリー解析する
ことで、それぞれ、①細胞表面及び細胞内に存在する
抗体量、②細胞内に存在する抗体量、を定量した。そ
の結果、①では、V2-01、V2-02 ともにその蛍光強度が
大きくシフトした。一方、②においては V2-02 の蛍光強
[テキストを入力してください]
4
度はアイソタイプコントロールとほぼ同程度まで低下した
のに対し、V2-01 においては顕著な低下は見られなか
った。このことは V2-01 はその多くが細胞内に侵入して
いることを示している。また、蛍光強度の平均値MFIより
これを数値化したところ、細胞内に侵入する抗体量は
V2-02 では細胞表面に結合した抗体のわずか 2%足ら
ずであるのに対し、V2-01 では実に 33％もの抗体が細
胞内に侵入していることが明らかとなった。
C-5. 細胞内侵入抗体による分子特異的イメージング
細胞内侵入抗体 V2-01 と細胞内エンドソームの酸性
条件下でのみ蛍光を示す pH感受性色素 CypHer を用
い、分子特異的イメージングを試みた。CypHer で標識
した V2-01 を VEGFR2 発現 MS1 細胞上へと添加し、
2hr 後蛍光顕微鏡観察を行ったところ、ほぼすべての細
胞で CypHer の赤色蛍光が観察された。なお、この時コ
ントロールとして用いた CypHer標識細胞内非侵入抗体
V2-02 では蛍光はほとんど観察されなかった。また、同
様にコントロールとして通常の蛍光色素 Cy5.5 で標識し
た V2-01及び V2-02を用い、細胞表面に結合した抗体
を可視化すると、両群で蛍光が観察された。このことは
V2-01 が確かに抗原依存的に細胞内に取り込まれるこ
とにより分子特異的イメージングを達成しうる抗体である
ことを示している。
D．考 察
本研究では、VEGFR2 に対する免疫ファージ抗体ラ
イブラリを構築し、その中から、ファージ表面提示法と毒
素Xを融合的に用いた手法により細胞内非侵入抗体の
単離を試みた結果、2 種類の細胞内侵入抗体を、23 種
類の細胞内非侵入抗体をわずか、2 ヶ月足らずで単離
することができた。このことは、今回著者らが確立したス
クリーニング法が、非常に多様な抗体クローンの中から、
数少ない細胞内侵入抗体を効率的に単離可能な方法
論であることを示している。また、単離した細胞内侵入
抗体及び非侵入抗体を用いた特性評価により、両抗体
はほぼ同等の抗原結合性を示すにも関わらず、細胞内
侵入活性が全く異なることが明らかとなった。このことは
細胞内侵入活性は抗原結合性と相関しないことを示し
ており、抗原結合性のみを評価できる通常のファージ表
面提示法と異なり、抗原結合性と細胞内侵入活性の双
方を同時に評価可能な著者らのスクリーニング法の有
用性が裏付けられた。さらに、本研究では分子特異的イ
メージングの一環として細胞内侵入抗体 V2-01 と細胞
内エンドソームの酸性環境下でのみ蛍光を示す pH 感
受性色素 CypHer を用い、VEGFR2 発現 MS1 細胞に
対するイメージングを試みた。その結果、V2-01 は細胞
表面の抗原を認識し、細胞内に移行することにより、検
出に十分な蛍光を示したことから、分子特異的イメージ
ングに十分に応用可能な抗体であると考えられる。今後
は、本研究で単離した抗体を用い、in vivoでのバックグ
ラウンドの低いイメージングが達成可能であるか評価し
ていく予定である。また、本研究で確立したスクリーニン
グ法を用い、VEGFR2 と同様、腫瘍血管上に発現する
任意の抗原に対する細胞内侵入抗体を単離することで、
腫瘍血管の発達過程でそれら腫瘍血管マーカーがど
のように発現変動するか解析し、腫瘍血管研究、さらに
は腫瘍血管を標的とした癌治療研究に貢献していきた
いと考えている。
E．結論
1) 細胞内侵入抗体を迅速、簡便、かつ的確に単離可
能な手法を構築することができた。
2) 細胞表面に結合した抗体のうち、33％もの抗体が 2
時間以内に細胞内へと取り込まれる細胞内侵入抗体の
単離に成功した。
3) in vitroではあるが、単離した細胞内侵入抗体を用い
た分子特異的イメージングを達成することができた。
F．研究発表
・学会発表
1) 吉川 舞、向 洋平、久保 貴、吉岡靖雄、岡田直貴、堤康央、角田慎一、中川晋作 immuno‐conjugate製
剤の開発に適う細胞内侵入抗体の効率的創製法の確
立日本薬剤学会第 24年会、2009年 5月、静岡
2) 吉川 舞、向 洋平、吉岡靖雄、岡田直貴、堤 康央、角田慎一、中川晋作High‐throughput screening
method of “Cell‐internalizing monoclonal
antibodies”, potent anti‐tumor drug delivery carriers、
第68回日本癌学会学術総会、2009年10月、横浜
3) 吉川 舞、向 洋平、吉岡靖雄、岡田直貴、堤康央、角田慎一、中川晋作Antibody‐drug conjugateの開発に
適う細胞内侵入抗体の効率的探索法、第8回ファーマ
・バイオフォーラム、2009年11月、名古屋
1
平成 21年度大学院教育改革支援プログラム
提案型共同研究プロジェクト 報告書
高感度生体情報分析技術としての SNP分析 及び損傷塩基イメージング法の開発
研究代表者：伊藤浩介（大阪大学大学院薬学研究科 生物有機化学分野 博士前期課程 1年）
研究要旨
ヒトゲノムが解読された今、この重要な生体情報を医療や生物学的な研究に活用することが求められてお
り、個人差の要因として重要な一塩基多型 (SNP) や変異の原因となる DNA損傷は特に注目されている。SNP
や損傷塩基の生物学的機能の解明には、それらの配列特異的な分析法が必要である。このような要求に応え
るべく、簡便な SNP分析法及び損傷塩基イメージング法の開発を指向した研究を行った。
A. 研究目的
ヒトゲノムが解読された今、この重要な生体情報
を有効に活用することが求められており、個人差の
要因として重要な一塩基多型 (SNP) や変異の原因
となる DNA 損傷は特に注目されている。ゲノム情
報の有効活用には SNP 分析を広く一般に適用した
り損傷塩基の生物学的機能を解明したりすることが
必要である。これらの実現には、迅速かつ簡便で配
列特異的な DNA 分析法が不可欠であるが、現在の
DNA 分析法はポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 法に大
きく依存しており、分析対象 DNA の増幅には比較
的長時間を要し、操作も煩雑であることから、SNP
分析を広く応用しようとする試みは大きく制限され
ている。また、損傷塩基を PCRによって増幅するこ
とは困難であるため、PCR法は損傷塩基の分析には
適さない。本研究では、こうした問題を一挙に解決
する手法として、PCR を用いない簡便な DNA 分析
法を開発することを目的とした。
当研究室ではこれまでに 5’-amino-2’,4’-BNA1-3) が、
酸性条件下で三重鎖形成時に速やかに P-N結合が切
断されることを明らかとしてきた。この性質は蛍光
共鳴エネルギー移動 (FRET) と組み合わせること
で、簡便で配列特異的な二重鎖 DNA の分析を可能
とする。また、5’-amino-2’,4’-BNA の隣接残基の化
学修飾により、三重鎖形成時の P-N結合切断活性を
向上させ、分析時間を大幅に短縮することに成功し
てきた。他方、当研究室では、代表的な損傷塩基で
ある 7,8-ジヒドロ-8-オキソグアニン (8-oxoG) に注
目し、これを配列特異的に認識可能な人工核酸であ
る 2,6-ジアミノピリジン誘導体を塩基部にもつ
2’,4’-BNA4) を開発した。今回これらのツールを組み
合わせることにより SNP 分析法並びに損傷塩基の
配列特異的なイメージング法の開発を指向した研究
を行った。
B. 研究方法
(1) プローブの合成
標準的なホスホロアミダイト法に従って DNA 合
成機 (Applied Biosystems, ExpediteTM 8909) を用い
て行った。合成はすべて 0.2 molスケールで行い、
トリチルオフで終了した。活性化剤は 1H-テトラゾ
ールを用いた。縮合時間に関しては、チミジン
(Proligo) 及び 2’-デオキシ-5-メチルシチジンアミダ
イト (Proligo 及び Glen Research) は 90 秒、
TAMRA-dT アミダイト (Glen Research) は 6 分、
5’-amino-2’,4’-BNA アミダイト及び P-N 結合を構築
する縮合はそれぞれ 10 分、BHQ-2-dT アミダイト
(Glen Research) と 2,6-ジアミノピリジン誘導体を塩
基部に有する 2’,4’-BNA アミダイトの縮合時間をそ
れぞれ 15分とした。蛍光標識していないプローブは
2
28%アンモニア水で室温下 90 分処理し、カラム担
体からの切り出し及びリン酸エステル部の脱保護を
行い、引き続き 55 ℃で 12時間処理することで、塩
基部の脱保護を行った。蛍光標識したプローブに関
しては、50 mM炭酸カリウム / 無水メタノール溶液
中で室温下 4時間処理することでカラム担体からの
切り出しと塩基部及びリン酸エステル部の脱保護を
行った。脱保護されたプローブはゲルろ過カラム
(General Electric Company, NAPTM 10 column) と逆相
HPLC により精製した。MALDI-TOF-MS (Bruker
Daltonics, AutoflexII) によって分子量を測定し、目的
のプローブであることを確認した。
(2) SNP認識能の評価
156 mM KCl及び 3.72 Mのプローブと標的二重
鎖を含む 1.1 mMリン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.0)
47 Lを 40°Cに保ち、100 mM クエン酸ナトリウム
-HCl緩衝液 (pH 4.0) 5.3 Lを加え、反応を開始した。
一定時間経過後、反応液から 10 L を分取し、100
mM グリシン-NaOH緩衝液 (pH 9.0) 160 Lに加え
中和した。このうちの 80 Lを逆相 HPLC (Shimadzu
Prominence) により分析し、残存しているプローブ
の割合を算出した。
(3) 蛍光による SNP検出
156 mM KCl、1.1 mM MgCl2及び 3.72 Mのプロー
ブと標的二重鎖を含む 1.1 mM リン酸ナトリウム緩
衝液 (pH 7.0) 38 Lを 40°Cに保ち、100 mM クエン
酸ナトリウム-HCl緩衝液 (pH 4.0) 4.2 Lを加え、反
応を開始した。一定時間経過後、反応液から 10 L
を分取し、100 mM グリシン-NaOH緩衝液 (pH 9.0)
160 Lに加え中和した。この全量を蛍光マイクロプ
レートリーダー (Molecular Devices, Gemini XPS) に
より分析した。尚、励起波長を 554 nmとし、検出波
長を 592 nmとした。
(4) 8-OxoG認識能の評価
156 mM KCl、1.1 mM MgCl2及び 3.72 Mのプロー
ブと標的二重鎖を含む 1.1 mM リン酸ナトリウム緩
衝液 (pH 7.0) 47 Lを 40°Cに保ち、100 mM クエン
酸ナトリウム-HCl緩衝液 (pH 4.0) 5.3 Lを加え、反
応を開始した。一定時間経過後、反応液から 10 L
を分取し、100 mM グリシン-NaOH緩衝液 (pH 9.0)
160 Lに加え中和した。このうちの 60–80 Lを逆
相 HPLC (Shimadzu Prominence) により分析し、残存
しているプローブの割合を算出した。
C. 研究結果
(1) 分析対象 SNPの探索
当該分析法は三重鎖形成を基盤とするため、現在
のところ認識可能な配列に制限があることから、分
析対象とする SNPの探索を行った。アメリカ国立生
物工学情報センター (NCBI) の SNP データベース
よりヒト SNPの情報をダウンロードし、機能性 SNP
の選別を行うPupaSuite5) を用いてセレクションを行
い、分析対象とする SNPを決定した。
(2) プローブの合成
DNA 自動合成機を用い、分析対象 SNP の変異型
を検出するプローブを合成し、逆相 HPLCを用いて
精製した後、MALDI-TOF-MSによって分子量を測定
し、目的のプローブが合成できたことを確認した。
(3) SNP認識能の評価
SNP認識能を評価するため、プローブと変異型の
DNA 又は野生型の DNA を含む水溶液を 40°C に保
った後、酸性緩衝液を加え、反応を開始した。一定
時間経過後、中和し、HPLC によって残存している
プローブの割合を分析した。その結果、変異型の
DNA を加えたときに高選択的にプローブの切断が
進行した (Fig. 1)。
(4) 蛍光による SNP検出
蛍光標識した SNP 分析プローブの認識能を評価
するため、プローブと変異型の DNA 又は野生型の
DNAを含む水溶液を 10°C下 10分静置した後、40°C
に保ち、酸性緩衝液を加えることで反応を開始した。
一定時間経過後、中和し、蛍光マイクロプレートリ
ーダーによって蛍光強度を測定した。その結果、反
応時間わずか数分で変異型 DNA を加えたときに高
3
選択的に蛍光シグナルの増大が認められた (Fig. 2)。
(5) 8-OxoG認識能の評価
8-OxoG 認識能を評価するため、プローブと
8-oxoG/C塩基対をもつDNAを含む水溶液を 40°Cに
保った後、酸性緩衝液を加え、反応を開始した。一
定時間経過後、中和し、HPLC によって残存してい
るプローブの割合を分析した。その結果、8-oxoG/C
塩基対を認識してプローブの切断が進行した (Fig.
3)。
D. 考察
5’-Amino-2’,4’-BNA を導入したプローブは、配列
特異的に三重鎖を形成することで標的とする遺伝子
型を設計した通り高選択的に認識し、切断された。
蛍光標識した場合、蛍光基や消光基の嵩高さに伴っ
て配列認識能が低下することも予想されたが、今回
評価を行った蛍光標識プローブにおいては、高い配
列認識能が維持された。また、8-oxoGの配列特異的
なイメージングを指向し合成した 8-oxoG 認識プロ
ーブでは 8-oxoG 選択性を示した一方、反応性の低
下が認められた。当研究室におけるこれまでの研究
で、2,6-ジアミノピリジン誘導体を塩基部に有する
2’,4’-BNAが生理的条件下 8-oxoGを高選択的に認識
できることを明らかとしているが、今回 P-N結合の
切断反応を利用するため、酸性条件で反応を行った
ことにより認識様式に変化が生じた可能性がある。
E. 結論
1) 5’-Amino-2’,4’-BNAを導入したプローブが SNPを
高選択的に認識できることを明らかとした。
2) 蛍光シグナルを利用し、簡便に SNPを検出でき
ることを明らかとした。
3) 2,6-ジアミノピリジン誘導体を塩基部に有する
2’,4’-BNAを導入したプローブは8-oxoGを認識し
て切断されることを明らかとした。
F. 研究発表
1) 伊藤浩介、戸水真治、根来佳憲、折田文子、兒玉
哲也、今西 武、小比賀 聡．三重鎖形成を基盤と
した迅速かつ簡便な SNP分析法．遺伝子・デリバ
リー研究会第 9回シンポジウム，2009年 7月，大
阪．奨励賞受賞
2) 伊藤浩介．高感度生体情報分析技術としての SNP
分析及び損傷塩基イメージング法の開発．第 3回
創薬とイメージングに関するシンポジウム，2010
年 3月，大阪．
G. 添付図表
Fig. 1 プローブの SNP認識能の評価．
標的二重鎖 (赤：変異型、青：野生型) 存在下プロ
ーブの切断反応の経時変化を HPLCで追跡した．反
応条件：140 mM KCl, 1.0 mM リン酸ナトリウムバッ
ファー (pH 7.0), 3.35 M 標的二重鎖及びプローブ,
40°C．エラーバーは標準偏差を示す (n = 3)．
Fig. 2 蛍光標識プローブによる SNP認識能評価．
標的二重鎖 (赤：変異型、青：野生型、橙：コント
ロールとして H2O) 存在下プローブの切断に伴う蛍
光シグナルを評価．反応条件：140 mM KCl, 10 mM
MgCl2, 1.0 mM リン酸ナトリウムバッファー (pH
7.0), 3.35 M 標的二重鎖及びプローブ, 40°C．エラ
ーバーは標準偏差を示す (n = 3)．
4
Fig. 3 8-OxoG認識能評価．
標的二重鎖 (赤：8-OxoG/C 塩基対を有する二重鎖
DNA、青：コントロールとして H2O) 存在下プロー
ブの切断反応の経時変化を HPLCで追跡した．反応
条件：140 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1.0 mM リン酸ナ
トリウムバッファー (pH 7.0), 3.35 M 標的二重鎖
及びプローブ, 40°C．エラーバーは標準偏差を示す
(n = 3)．
H. 引用文献
1) Obika S., Nakagawa O., Hiroto A., Hari Y. and
Imanishi T., Chem. Commun., 2003, 2202-2203.
2) Obika S., Tomizu M., Negoro Y., Osaki T., Orita A.,
Ueyama Y., Nakagawa T. and Imanishi T.,
Nucleosides, Nucleotides, Nucleic Acids, 2007, 26,
893-896.
3) Obika S., Tomizu M., Negoro Y., Orita A.,
Nakagawa O., Imanishi T., ChemBioChem, 2007, 8,
1924-1928.
4) Miyoshi T., Kodama T., Obika S. and Imanishi T.,
Nucleic Acids Symp. Ser., 2008, 52, 305-306.
5) Reumers J., Conde L., Medina I., Maurer-Stroh S.,
Van Durme J., Dopazo J., Rousseau F. and
Schymkowitz J., Nucleic Acids Res., 2008, 36,
D825-D829.
1
平成 21年度大学院教育改革支援プログラム
提案型共同研究プログラム 報告書
動物用MRIを用いたラットにおける部分容積効果を考慮した脳血液量
ダイナミクスの測定
研究代表者 井上 泰吉 大阪大学大学院医学系研究科保健学専攻 医療技術科学分野 D2
研究要旨
動物用 MRI を用いた薬剤投与ラットにおける脳血液量ダイナミクスの測定に関しては詳細な検討が行われておらず、また部分容積効果補正の必要性の検討は我々の知る限りではなされていない。本研究では部分容積効
果補正を含めた脳血液量ダイナミクスの測定法の確立を目的とした。
A. 研究目的
脳血液量の変化は、中枢神経系の疾患の経過と密
接に関係している。たとえば、血管奇形や脳腫瘍の血
管新生、頭蓋内圧の増加などがあげられる。脳血液量
の変化を非侵襲的に測定する技術は、臨床や研究へ
の応用の可能性がある。本研究では、動物用MRI を用
いて、ラットの脳血液量のダイナミクスを測定することを
目的として実験を行った。また、脳血液量を求める過程
で、ラットの状矢状静脈洞の信号値に対する部分容積
効果(Partial Volume Effect: PVE)の補正の必要性につ
いて検討を行った。
B. 研究方法
(1) 使用機器
撮像には 1.5 T動物実験用MRI (MRmini SA1508,
DS Pharma Biomedical Co., Ltd., Osaka) を使用した。
撮像条件はファントム実験およびラット実験のいずれに
おいても、パルスシーケンス: 3D-FLASH, TR: 50 ms,
TE: 4.15 ms, FOV: 63×31.5×31.5 mm, matrix size:
256×128×32, voxel size: 0.25×0.25×0.98 mm, flip
angle: 36°であった。
(2) ファントム実験
PVE の回復係数(Recovery Coefficient: RC)を求
める目的でファントムを作成した。0.3, 0.4, 0.5, 0.8,
1.0, 2.0 mm径のテフロン製チューブを 2本ずつ用
意し、一方には蒸留水を封入して、もう一方にはラ
ットの血液中の濃度を想定した Gd-DTPA造影剤を
封入した。また PVE の影響を受けていない基準と
なる信号値を測定するために造影剤を封入した 5.0
mm径のチューブも用意した。これらのチューブを
蒸留水で満たした 30 mm径の円筒容器内に固定し
た。
作成したファントムの画像を取得し、5.0 mm 径
チューブの信号プロファイルを作成して、基準とす
る信号値を計測した。他の径のチューブに関しても
信号プロファイルを作成し、それぞれの径で造影剤
が封入されたチューブと蒸留水が封入されたチュー
ブの差分を求めて、テフロンチューブの信号の影響
を排除した信号プロファイルを得た。このプロファ
イルをガウス関数で近似して最大値と標準偏差
(Standard Deviation: SD) を求めた。本研究ではこ
の SD を径の指標として用いた。また、ガウス関数
の最大値を信号値とし、基準となる信号値との逆比
として RC を算出した。横軸を SD、縦軸に RC と
してプロットし、指数関数による近似を行って PVE
の補正に用いる RC曲線を推定した(Figure 1)。
2
(3) ラット実験
雄性 Sprague-Dawley ラット (n = 12) を使用し
た。麻酔薬として抱水クロラール (Sigma-Aldrich,
St. Louis, MO, USA) 400 mg/kg体重を腹腔内投与
し、痛み刺激に反応しない状態で実験を行った。
麻酔後、ラットの脳を７分毎に連続して 9回撮像した。
ラットの尾静脈から、1 回目の撮像後に Gd-DTPA 造影
剤を、3回目の撮像後にマンニトール(20% D-マンニ
トール, 興和化学産業株式会社, 大阪）もしくは生理
食塩水を投与した。造影剤の用量は 0.6 mM/kg体重と
した。マンニトールは脳血液量を変化させる目的で使用
し、投与量を変えて 3 つのグループを作成した(マン
ニトール 3.0 g/kg体重投与群(n = 3)、1.5 g/kg体重
投与群(n = 3)、0.75 g/kg体重投与群(n = 3))。
(4) 解析方法
平衡法を用いて脳組織を脳実質と血液の 2つのコン
パートメントモデルとして考えると単位体積あたりの脳血
液量αは造影前後の脳組織と血液の信号を用いて次
のように表すことができる。
SSSS
13
24
＝
ここで、S1, S3は造影前後の脳組織の信号を表し、S2,
S4は造影前後の血液の信号をそれぞれ表す。一般に、
脳血液量は脳組織 100 ml当たりの容積 [ml]で表わさ
れるため、脳血液量 (Cerebral Blood Volume: CBV)
ml/100ml脳組織 は以下のように求められる。
100 CBV
血液の信号を得る血管としては、ラットの上矢状静脈
洞を用いた。上矢状静脈洞の信号プロファイルを作成
してガウス関数で近似し、最大値と SDを求めた。この最
大値を血液の信号値とし、上記の計算をボクセルごとに
行って CBV 画像を得た。またファントム実験によって得
た RC 曲線によって血液の信号値の補正を行い、同様
に CBV画像を作成した。
C. 研究結果
静脈洞の信号値に対して PVEの補正をしなかった場
合とした場合の CBV 画像を示す(Figure 2)。いずれの
時相でも補正をした場合の方が CBV の値は低い傾向
があった。
また、脳実質部分に ROI を設定し、ボクセル毎の経
時的な CBV の平均値を測定すると(Figure 3)、Scan
number 9 (マンニトール投与 35分後)において、用量が
1.5, 3.0 g/kg体重の投与群で生理食塩水を投与した対
照群と比較してCBVの差が最大となり、3.0 [g/kg] 投与
群では対照群と有意な差(p<0.05)がみられた。
D. 考 察
マンニトールは浸透圧により組織から血液中に
水を吸水する作用を持つため、脳血液量が経時的
に増加することが予想される。Figure 3からマン
ニトール静注後、CBVが経時的に増加していく傾
向があること、また用量に依存して CBV の変化
量も増加することが示され、本研究の手法によっ
て脳血液量のダイナミクスの測定が可能である
ことが示唆された。また、ラットの上矢状静脈洞
をガウス近似したときの平均の SD は SD= 1.62
±0.23 pixelであり、このときの回復係数は RC =
1.21±0.07 であった。したがって、PVE の補正
が必要であると考えられた。
E. 結 論
本実験により、ラットの脳血液量のダイナミクスの測定
が可能なことが示された。また、CBV を求める過程で、
上矢状静脈洞の部分容積効果を補正する必要があるこ
とが示唆された。
F. 研究発表
・学会発表
1) 井上泰吉、亀井栄祐、日下部好紀、岡田晃治、山嵜洋一、村瀬研也．動物用 MRI を用いたラットに
おける部分容積効果を考慮した脳血液量ダイナミ
クスの測定，第 97 回日本医学物理学会学術大会，
平成 21年 4月 19日，横浜市
2) 井上泰吉、亀井栄祐、日下部好紀、岡田晃治、山嵜洋一、村瀬研也．動物用 MRI を用いたラットに
おける部分容積効果を考慮した脳血液量ダイナミ
クスの測定，第 48回日本生体医工学会大会， 平
成 21年 4月 23日，東京都
3
G. 添付図表
1
・平成 21年度大学院教育改革支援プログラム
提案型共同研究プログラム 報告書
CYP・薬物相互作用と銀ナノ粒子を利用した超高感度分析法の開発
研究代表者 金森 美果 大阪大学大学院薬学研究科 分子反応解析学分野 M１
研究要旨
本研究では、銀ナノ粒子の表面プラズモンを利用して散乱光の変化を増強することにより、これまで以上に微
量かつ高感度に CYP と薬物との相互作用を検出できる分析法を開発する。具体的には、アルキルカルボン酸で表面加工した銀ナノ粒子に CYPを静電的に吸着させ、共鳴光散乱あるいは共鳴ラマン散乱を増強することにより測定系の微量・高感度化を達成する。
A. 研究目的
本申請課題は、銀ナノ粒子の表面プラズモンにより
増強された散乱光を用いて CYP と薬物との相互作用を
高感度に検出する方法を確立することにより、今日まで
測定に大量に必要とされた試料を微量に抑えることを
目的としている。現在、表面プラズモン共鳴は各種分析
手法に利用されており、タンパク質と薬物の結合を解析
する装置も市販され、Biacore という商品名で流通して
いる。本装置は金膜上に固定したタンパク質に裏側か
ら光を照射して表面プラズモンを発生させ、全反射光を
観測する。タンパク質と薬物が結合すると誘電率が変化
するため浸み出した近接場光が変化するが、それを屈
折率の変化（すなわち全反射角の変化）として捉えると
いう測定原理に基づく。しかしながらこの装置は高額で
ある一方、小分子である薬物の結合では誘電率の変化
が小さく、検出がきわめて困難であるという欠点を持つ。
そこで本申請課題では、サイズを考慮した銀ナノ粒
子と CYP の吸収波長がほぼ一致することに着目
し、脂肪酸で表面加工した銀ナノ粒子に CYP を静電
的に吸着させ、銀ナノ粒子の表面プラズモンとヘムの相
互作用を利用することとした。これにより、安価な試薬と
一般的な蛍光分光計のみを用い、さらには蛍光マイクロ
プレートリーダーを用いた測定系をも構築できる汎用性
に優れハイスループット化も容易な検出方法の確立を
目指した。本申請課題により、迅速・微量・高感度に薬
物結合性を調べられれば、医薬品の適正使用や創薬
の領域における CYPの問題点の解決に大きく貢献でき
るだけでなく、今日製薬企業等において無数とも言える
薬物候補をスクリーニングする過程での時間と費用を削
減できるという点で、これからの医薬品の開発に大きく
貢献できる。
B. 研究方法
(1) 野生型及び変異体 CYP2C9の調製
変異体CYP2C9 (T299A、E300Q、T301A) の遺伝子
は、当研究室の宇野により開発された発現用プラスミド
pBEX に挿入されたCYP2C9遺伝子を鋳型として、
QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)
を用いて作製した。野生型及び変異体CYP2C9遺伝子
を組み込んだpBEXをそれぞれ大腸菌株BL21-Gold
(DE3) (Strategene) に形質転換し、0.5 mM 5-アミノレブ
リン酸 (和光)、100 g/mL アンピシリンナトリウム (和
光)、0.5 mM ジクロフェナク (和光) を含むTB培地中
で30℃、145 rpmの条件下で48時間培養した。回収した
菌体をTMK Buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7.4)、14 mM
酢酸マグネシウム、60 mM 酢酸カリウム、20% グリセロ
ール) で再懸濁後に超音波破砕し、懸濁液を4 ℃、
37,000 rpmで1時間超遠心した。沈殿に界面活性剤
(0.5% n–Octyl––D–thioglucoside ( 同 仁 ) 、 0.3 ％
Nonidet P-40 (ナカライテスク)) を添加した100 mM
2
Buffer (100 mM リン酸カリウム (pH 7.4)、20% グリセロ
ール、0.1 mM EDTA) を加えて約12時間攪拌すること
でCYP2C9を膜から可溶化した。4℃、37,000 rpmの条
件で1時間超遠心した後に上清を回収し、透析 (100
mM Buffer) 及びカラム操作 (DEAE-Sepharose Fast
Flow カラム (GE Healthcare)、Octyl-Sepharose カラム
(GE Healthcare)、Hydroxy Apatite Bio-Gel HT カラム
(Bio-Rad)) により精製し、Amicon Ultra-15 50,000
MWCO (Millipore) を用いて濃縮を行った。
(2) 野生型及び変異体 CYP2C9の評価
野生型及び変異体 CYP2C9 の薬物代謝活性、薬物
親和性の評価には CYP2C9 の基質薬物であるジクロフ
ェナクを用いた。薬物代謝活性の評価は in vitro再構成
系 (100 mM Buffer、0.1 M CYP2C9、30 g/mL ホス
ファチジルコリン (SIGMA)、0.2 M Cytochrome b5
(SIGMA) 、 0.4M NADPH-Cytochrome P450
Reductase (SIGMA)、NADPH Generating System (1
mM NADP+、2.5 mM Glucose-6-Phosphate、2 U/mL
Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase) (BD Gentest)) を
用いて行った。各濃度のジクロフェナクを反応液に添加
し 37℃でインキュベーションした。適当な時間でメタノー
ルを添加し、遠心により不純物を取り除いた。HPLC
(Agilent 1100 series) により各基質濃度における基質減
少の時間変化を測定し、Vmaxと Kmを算出した。
薬物親和性の評価は平衡透析法で解離定数Kdを求
めることにより行った。CYP2C9 溶液、基質溶液ともに
100 mM Buffer中に 50 M となるように調製し、平衡透
析膜 (Equilibrium Dialyzer-96 (Harvard)) を用い、
25℃で 36 時間インキュベートすることにより平衡化を行
った。平衡到達後、得られたサンプルにメタノールを添
加することで CYP2C9 を変性させ、遠心により取り除い
た。HPLC によりサンプル溶液中の基質濃度を測定し、
その濃度比から解離定数 Kdを算出した。
ヘム周辺構造の評価は共鳴ラマン分光光度計
NR-1800 (Jasco) を用いた共鳴ラマンスペクトルの測定
により行った。CYP2C9を100 mM Buffer中に100 Mと
なるように調製し、出力100 mWのクリプトンイオンレー
ザー (406.7 nm line) (Coherent) を照射して測定を行っ
た。検出には超高感度冷却CCD検出器 (Andor) を用
いた。
(3) 銀ナノ粒子の調製
銀ナノ粒子の調製にはアルキルカルボン酸存在下で
の銀イオン還元による手法を用いた。アルキルカルボン
酸については Oleic acid、11-Mercaptoundecanoic acid
(11-MUA) の 2種類について検討した。Oleic acidを用
いた銀ナノ粒子の調製は以下のように行った。5 mmol/L
Sodium Oleate、10 mol/L NaBH4の水溶液に、氷冷下
0.5 mmol/L AgNO3を滴下し、1分間撹拌することにより
銀ナノ粒子 AgNP 1を得た。11-MUAを用いた銀ナノ粒
子の調製も同様に行った。5 mmol/L 11-MUA (Aldrich)、
10 mol/L NaBH4 の水溶液に、氷冷下 0.5 mmol/L
AgNO3 を滴下し 1分間撹拌することによりAgNP 2を得
た。またこの手法を改良したものとして、AgNO3 滴下時
に同時に threo-1,4- Dimercapto-2,3-butanediol (DTT)
を添加することにより AgNP 3を得た。
(4) 調製した銀ナノ粒子の確認
上述の手法で調製した銀ナノ粒子は紫外可視吸収
スペクトルにより確認した。スペクトルの測定には紫外可
視分光計 DU-800 (Beckman) を用いた。
C．研究結果
(1) CYP 2C9の野生型及び変異体の調製
大腸菌による大量発現系により本研究で用いる野生
型 CYP2C9 の発現・精製を行った。得られた CYP2C9
について紫外可視吸収スペクトルを用いて確認したとこ
ろ、CO 結合型において CYP に特徴的な 450 nmのシ
ャープな吸収極大を確認できた (Fig. 1)。また、本申請
課題が銀ナノ粒子の表面に固定した CYP を用いること
から、CYP2C9 において溶媒に面した方からヘムへとプ
ロトンを供給していると考えられるアミノ酸残基に着目し、
野生型の遺伝子をもとに T299A、E300Q、T301A の三
種の変異体の遺伝子を部位特異的変異によって作製し
た。これら三種の変異体も野生型と同様に調製し、野生
型との違いを検討するために薬物代謝活性を評価した
(Fig. 2)。その結果、全ての変異体において薬物代謝活
3
性の低下が認められ、特に E300Qにおいてその低下が
顕著であった。そこで、この活性低下の要因を検討する
ために薬物親和性の測定を行ったところ、得られた Kd
には活性測定で見られたほどの大きな変化はなかった
(Table 1)。また、ヘム周辺の構造変化も起きていないこ
とが共鳴ラマンスペクトルによって確認された (Fig. 3)。
以上の結果から、三つのアミノ酸残基（Thr299、Glu300、
Thr301）が溶媒側からのプロトンの供給に関与し、薬物
の代謝活性にとって重要であることが強く示唆された。
これら残基は、銀粒子との結合が予想される CYP の塩
基性残基クラスターとは反対側に位置することから、銀
粒子に固定化した CYPの向きを知る上で変異体のパラ
メーターはよい指標になると判断した。
(2) 銀ナノ粒子の調製
以上のように評価された CYP2C9 を銀ナノ粒子の表
面に固定化することを目標とし、銀ナノ粒子の調製を行
った。銀ナノ粒子はその粒子系によって吸収極大波長
が変化することが報告されている。本研究の目的を達成
するためには、銀ナノ粒子が CYP2C9 と同様 419 nm付
近に極大吸収波長を持つことが望ましいため、粒子径
を変化させ検討を行った。さらに、CYP2C9 を固定する
ために、粒子表面をアルキルカルボン酸で保護すること
により負に帯電させた。帯電した銀ナノ粒子は、静電的
な反発によって粒子同士の凝集が抑えられるため、安
定な単分散状態になると期待される。まず、表面保護剤
としてOleic acidを用いたAgNP 1について紫外可視吸
収スペクトルを測定したところ、406.5 nm に吸収極大が
観察された (Fig. 4)。これにより目標とする粒子径に近
い銀ナノ粒子が調製できたと思われる。しかし、この
AgNP 1を 100 mM Buffer中に添加すると懸濁したため、
銀ナノ粒子が中性の緩衝液中で電荷を失い分散性が
低下したと考えられた。そこで、緩衝液中での AgNP 1
の分散性を改善するため、表面保護剤を 11-MUAに変
更して検討を行った。CYP を銀膜上に固定するために
11-MUA を用いる方法が報告されており、ナノ粒子への
固定化の成功が期待された。得られたナノ粒子 AgNP 2
は 424 nmに吸収極大を持ち、CYP2C9の極大吸収波
長と非常に近いものとなった (Fig. 5)。しかしながら、生
成した AgNP 2は非常に不安定であり、424 nmの吸光
度が短時間で減少し、それと同時に 345 nmに新たな吸
収極大の出現が認められた。これは 11-MUA 同士がジ
スルフィド結合を形成し、表面の保護が外れたためであ
ると考えられた。そこで、ジスルフィド結合形成を抑制す
る目的で調製途中に DTTを添加したところ、421 nmに
吸収極大を持つ AgNP 3が得られた (Fig. 6)。さらに、
得られたAgNP 3では経時的な吸収スペクトルの変化が
認められなかった。これにより、11-MUA で表面が保護
された安定な銀ナノ粒子を得ることができたと判断した。
D．考察
本研究では、表面プラズモン共鳴に注目し、銀ナノ
粒子を利用して CYP と薬物との相互作用を検出するた
めの汎用性の高い手法を確立することを目的とした。得
られた銀ナノ粒子は本申請課題で目標とした吸収特性
を示した。また、銀ナノ粒子の表面を CYP の固定化に
必要なアルキルカルボン酸で保護することにも成功した。
今後、銀ナノ粒子上へ CYPを固定化し、共鳴光散乱お
よび共鳴ラマン散乱を測定することにより、本手法が微
量かつ高感度に CYP と薬物との相互作用を検出できる
分析法となり得ることを示してゆきたい。
E. 結論
1) 標的となる CYP2C9 について三種の変異体の調
製を行い、その評価を行った。
2) 共鳴効果を期待できる粒子径の銀ナノ粒子の調
製に成功した。
3) 銀ナノ粒子の表面にCYPを固定するためのコーテ
ィングをほどこすことにも成功した。
F．研究発表
・学会発表
1) 宇野公之、金森美果、大河万顕、香川雄輔、山下沢、青山浩. Amino Acid Residues Involved in the
Proton Relay System in Human CYP2C9, 第 20回
金属の関与する生体関連反応シンポジウム, 2010
年 6月, 徳島
G. 添付図表
4
Fig. 1. CO結合型野生型 CYP2C9の紫外可視吸収スペクトル
Fig. 2. 変異体および野生型 CYP2C9 におけるジクロフェナクの代謝
活性：野生型 (○)、T299A (□)、E300Q (●)、T301A (■)
Table 1. 野生型および各変異体におけるジクロフェナクの結
合親和性
Kd / M
野生型 30.4
T299A 49.8
E300Q 72.9
T301A 49.0
Fig. 3. 変異体および野生型 CYP2C9の共鳴ラマンスペクトル
野生型 (黒)、T299A (青)、E300Q (緑)、T301A (赤)
Fig. 4. AgNP 1の紫外可視吸収スペクトル
Fig. 5. AgNP 2の紫外可視吸収スペクトル
調製直後（赤）、調製 3時間後（黒）
Fig. 6. AgNP 3の紫外可視吸収スペクトル
水中（赤）、緩衝液中（青）
[テキストを入力してください]
1
平成 21年度大学院教育改革支援プログラム
提案型共同研究プログラム 報告書
イメージングによる脂肪族ケトン体の抗けいれん作用の評価
－けいれん発作時における脳エネルギー代謝のダイナミックな変化について―
研究代表者 沢田 義一 大阪大学大学院 医学系研究科 保健学専攻 M2
今本 奈津美 大阪大学大学院 医学系研究科 保健学専攻 M1
研究要旨
本研究では、脳エネルギー代謝のダイナミックな変化を捉えるための方法論として、糖代謝量の指標を短時間
の画像で解析できることを示した。また、MEK を投与する時間の違いによって抗けいれん作用および脳エネルギー代謝が変化するか否かを検討した。
A. 研究目的
ケトン食療法は難治性てんかんの治療法として臨床
的に有用性が確立されている。ケトン食摂取により、ア
セトン、アセト酢酸、β‐ヒドロキシ酪酸の 3 種類のケトン
体が生体内で産生されるが、中でもアセトンは、種々の
けいれんモデル動物において広範囲なスペクトルで抗
けいれん作用を有することが報告されている。その作用
機序としては血液脳関門を越えて脳のエネルギー基質
となるとの仮説が提唱されている。本研究室において、
メチルエチルケト ン (MEK) やジエチルケトン (DEK)
などの脂肪族ケトン体（前処置）が抗けいれん作用及び
神経保護作用を有することを見出した。上記の脂肪族
ケトン体は生体内で産生されず、かつ脳のエネルギー
基質となるとは想定しにくいため、脳エネルギー基質と
の変容以外の作用機序が強く示唆される。
また、本研究室においてはリチウムピロカルピン (LiP)
てんかんモデルラットにおけるグリア代謝の指標である
14C-酢酸の取り込みが、ピロカルピン投与後 120 分間と
いう短時間においてもダイナミックに変化することを見出
した。酢酸よりも一般的なエネルギー基質は糖であるの
で、糖代謝がピロカルピン投与後どのように変化してい
るかを探ることは重要である。しかし、グリア代謝の指標
が 14C-酢酸投与 5 分後の画像で得られるのに対し、糖
代謝量の指標は 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) や14C-deoxyglucose (DG) 投与 45分後の画像を解析する
ことが標準的な方法である。糖代謝量のダイナミックな
変化を捉えるには短時間の取り込み画像で定量的に解
析することが重要である。
本申請課題では、はじめに 18F-FDGや 14C-DG投与後、
短時間の画像が糖代謝量の指標として有用であるか否
かを検討した。次に、短時間の画像を用いて、MEK を
投与する時間の違いによる抗けいれん作用及び脳エネ
ルギー代謝の変化に関する検討（MEK Resistanceの有
無の検証）を行った。
B. 研究方法
(1) LiPてんかんモデル
雄性 Wistar 系ラット（日本 SLC、8 週齢）に LiCl (3
mEq/kg) を腹腔内投与し、20時間後に Pilocarpine (32
mg/kg) を皮下投与した。
(2) Patlak Plot解析による直線回帰性の検証
Patlak Plot 法は 18F-FDG の脳内動態から、糖代謝速
度をグラフの傾きとして捉える方法で、直線で回帰でき
れば糖代謝速度は一定であることが示される。Cp(t)を
入力関数とすると、X軸は
[テキストを入力してください]
2
で表され、標準化された時間軸である。Y軸は
で表される。
(3) 投与時間の違いによるMEK抗けいれん作用評価
LiPモデルにおいて、Diazepam Resistanceが報告され
て い る 。 MEK Resistance を 検討す る た め に 、
Pilocarpine 投与 5 分後 (LIP+MEK-5min 群) と 60 分
後 (LiP+MEK-60min群) にMEK (8 mmol/kg) を腹腔
内投与し、行動指標である Racine’s score (Table. 1) を
用いて LiP群と比較検証した。
(4) 14C-DGによる糖代謝量評価
Control群 (Pilocarpineの代わりに生理食塩水を投与)、
LiP群、LiP+MEK-5min群、LiP+MEK-60min群におい
て、Pilocarpine投与 75分後に 14C-DG (185 kBq) を尾
静脈より投与し、10 分後に脳を摘出した。脳切片をイメ
ージングプレートに 1週間コンタクトし、オートラジオグラ
ムを得た。オートラジオグラム上に関心領域を設定し、
放射能濃度を定量解析した。放射能濃度を血糖値で補
正し、糖代謝量を算出した。
(5) 14C-酢酸によるグリア代謝評価
(4) と同様の 4 群において、Pilocarpine 投与 75 分後
に 14C-酢酸 (740 kBq) を尾静脈より投与し、5 分後に
脳を摘出した。(4) と同様に放射能濃度を定量解析し
た。
C．研究結果
(1) Patlak Plot解析による直線回帰性の検証
18F-FDGの脳内動態を Patlak Plot解析した結果、トレ
ーサ投与 1分後から 45分後まで直線で回帰することが
できた (Fig.1)。したがってトレーサ投与 5 分または 10
分の取り込み画像を糖代謝量の指標として使用できる
ことが判明した。
(2) 投与時間の違いによるMEK抗けいれん作用評価
LiP 群では Pilocarpine 投与後、約 30 分でステージ 3
以上のけいれんが見られ、120 分後まで継続した。
LiP+MEK-5min群では、MEKを前処置した場合と同様、
ステージ 2 以下に抑えられ、抗けいれん作用を有した。
一方、MEK+LiP-60min 群では、MEK 投与後いったん
ステージ 2 程度に抑制されたが、時間とともにけいれん
が現れた。Pilocarpine 投与後の経過時間によって、
MEKの効果には顕著な差が見られた。
(3) 14C-DGによる糖代謝量評価
LiP+MEK-5min群では、LiP群において見られた糖代
謝量の亢進はControl群と同程度まで抑制された。一方、
LiP+MEK-60min群における糖代謝量は、LiP群と同程
度の亢進が見られた。ただし、側坐核および体性感覚
皮質においては顕著な亢進が見られなかった (Fig.2)。
(3) 14C-酢酸によるグリア代謝評価
LiP+MEK-5min 群では、LiP 群において見られた 14C-酢酸の取り込み亢進はControl群よりやや高い程度
に抑制された。一方、LiP+MEK-60min 群においては、
LiP 群と比較してやや高い取り込みが見られた
(Fig.3)。
D．考 察
18F-FDGや 14C-DGの投与後、短時間の取り込み画像
が糖代謝量の指標となることが判明した。この結果を利
用し、LiPてんかんモデルにおける脳エネルギー代謝の
ダイナミックな変化を 18F-FDGと 14C-酢酸のダブルトレー
サ法により詳細に捉えることが今後の課題である。
Pilocarpine 投与後の経過時間によって、MEK の抗け
いれん作用および脳エネルギー代謝に顕著な差が見ら
れた。MEKはPilocarpine投与後、どれほどの経過時間
まで抗けいれん作用を有するのかを検討したい。14C-酢
酸の取り込みは、糖代謝量で同程度であった群に対し、
MEK を投与することによってやや高くなった。MEK を
投与することによって、グリア代謝が亢進し、放出された
[テキストを入力してください]
3
グルタミン酸を取り込むことによって抗けいれん作用を
有している可能性が示唆された。
E．結論
(1) 18F-FDGや 14C-DGの投与後、短時間の取り込み画
像が糖代謝量の指標となることが判明した。
(2) Pilocarpine投与後の経過時間によって、MEKの抗
けいれん作用および脳エネルギー代謝に顕著な差があ
ることが判明した。
F．研究発表
なし
G．添付図表
Fig.1 Patlak plot解析
Control 群および LiP 群における 18F-FDG の脳内動態
(t=1,5, 10, 20, 30, 45) を Patlak plot法で解析した。
Fig.2 14C-DGのオートラジオグラム
Pilocarpine 投与 75 分後に 14C-DG を投与し、その 10 分後
の取り込み画像。
Fig.3 14C-酢酸のオートラジオグラム
Pilocarpine投与 75分後に 14C-酢酸を投与し、その 5分後の
取り込み画像。
1
平成 21年度大学院教育改革支援プログラム
提案型共同研究プログラム 報告書
IR bSSFPによる T1, T2評価についての基礎検討
研究代表者 堀 祐樹 大阪大学大学院 医学系研究科 保健学専攻 M2
研究要旨
本研究は、MRI特有のパラメータである T1, T2を IR bSSFP法を用いることで、極めて短時間で測定することができたのでここに報告する。より精度良く評価できるようになれば、創薬研究や治療法の開発
だけでなく、臨床への利用が可能となるだろう。
A. 研究目的
T1, T2は組織の生理学的な情報を反映し、病態や
病変部位の特定に使われる。従来の spin echo法を
ベースとした T1, T2測定では、精度が良い一方で、
測定時間が非常に長いという問題があったため、今
回は In vivoでの T1, T2測定の時間短縮および、角
度向上を目的としている。これにより従来法では困
難であったダイナミックプロセスのモニタリングも
可能となり、創薬研究や治療法の開発への利用が期
待される。
B. 研究方法
(1) MRI測定
MRI測定には、9.4T、ボア径 89mm、縦型超伝導
磁石（Oxford Instruments）を備えた MRI 装置
（Unity-INOVA, Varian）を用いた。本実験には雄
性 ddYマウス (週齢 7-10 weeks, Japan SLC)を使
用した。自作の固定具によりマウス頭部を固定し、
イソフルランを 2%含んだ空気を供給しながらマウ
ス海馬の撮像を行った。従来法である spin echo法
により正確な T1, T2 測定を行った後、 IR
bSSFP(Inversion Recovery balanced Steady-State
Free Precession)法により撮像を行った。また IR
b-SSFP 法による測定は、CS による再構成を行い、
時間分解能を向上させた方法と CS による再構成を
行わない 2種類の方法を用いた。以下に IR bSSFP
法の撮像パラメータを示す。
<撮像パラメータ>
パルスシーケンス ： bSSFP sequence
TR / TE ： 2.8 / 1.4 ms
フリップ角 ： 50°
マトリクス数 ： 128×128
FOV ： 2.56×2.56 cm2
スライス厚 ： 1 mm
NEX ： 1
取得エコー数： 128本(full acquisition)
50本(CS reconstruction)
撮像枚数 ： 15枚
TI ： 70, 210, 350, 490, 630, 770, 910, 1050,
1190, 1330, 1470, 1610, 1750, 1890, 2030 ms
(2) T1, T2マップ作成
CS により再構成された 15 枚の画像を以下の P.
Schmitt 等により提案された式によりフィッティン
グを行い 1)、T1, T2マップを作成した。フィッティ
ングには、解析ソフト(MATLAB , The MathWorks)
を用いた。
2
C．研究結果
CS を用いた画像から得られた T1, T2を従来法で
ある spin echo法により得られた T1, T2および CS
を利用せずに取得した T1, T2 と比較した(Fig.1)。
Spin echo法による T1, T2測定は、長い待ち時間を
必要とするため、確度が高い一方測定するのに数時
間と非常に長い時間を要する。今回我々が提案した
測定手法は、約 2秒で T1, T2同時に測定することが
可能であり、この方法が極めて短時間で確度良く測
定可能な手法であることが分かる。
D．考察
T1測定では、IR bSSFP測定後 CSによる再構成
を行った方法も行わなかった方法も、spin echo 法
による測定と大差なく、確度良く取得できた。T2測
定では、CS による再構成を行った方法は確度良く
測定でき、spin echo 法と極めて近い値となった。
CS を用いることによる時間分解能向上が、フィッ
ティングの精度を向上させ、より正確に T2を評価で
きたためと考える。今回提案した方法を用いること
で、約 2秒と極めて短時間に T1, T2を同時に評価で
き、更なる確度向上により臨床への応用が期待され
る。
E．結論
CS を用いることで、IR bSSFP 法による T1, T2
測定の確度を向上させることができた。これにより
極めて短時間での T1, T2測定が可能となり、創薬研
究や治療法の開発において非常に有用となるであろ
う。
F. 参考文献
1) P. Schmitt et al. Inversion Recovery True FISP:
Quantification of T1, T2, and Spin Density.
2004;51:661-667.
G．研究発表
・学会発表
1) 堀祐樹、井口智史、柴田直人、今井宏彦、木村敦臣、藤原英明．Single shot IR b-SSFP法を用いたマウス脳におけるT1, T2マップ作成につ
いての基礎検討, 第３7 回日本磁気共鳴医学会大会，2009年 10月, 横浜
H．添付図表
Fig.1 各測定法による T1, T2値
