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Presentazione realizzata dalla dr.ssa Andrea Dardis, responsabile del laboratorio del Centro di Coordinamento Malattie Rare FVG.
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Functional characterization of the common c.-32-13T>G mutation of
GAA gene: identification of potential therapeutic agents.
Dardis et al., Nucleic Acid Research; 2013
�La maggior parte dei pazienti LO presenta la mutazione di splicing c.-
32-13T>G. (circa il 90 % dei pazienti presentano la mutazione in un
allele).
�Recentemente, sono state utilizzate numerose strategie per valutare
approcci terapeutici in grado di correggere/aumentare lo splicing
normale di trascritti che presentano mutazioni che colpiscono lo
splicing dell’mRNA.
�Esempi: AONs (clinical trials).
Piccole molecole che aumentano l’espressione o l’attività
dei fattori di splicing
�Questi approcci sono mutazione specifici e dipendono del
meccanismo mediante il quale la mutazione altera lo splicing normale.
�Caratterizzazione funzionale della mutazione c.-32-
13T>G del gene GAA
�Valutare in vitro strategie mirate a correggere/aumentare
lo splicing normale dei trascritti mutati.
Obbiettivi
exon 1
exon 2 (578 bp)
exon 3
cgggtgaga
35 bp
gcg/gtaaca
tcttctcccgcaggc….
60 bp
….acggtgggc catctcttctagat
g-13T>G Tcttccccaag/ga
Rela
tive n
orr
mal sp
liced
m
RN
A e
xp
ressio
n(%
of
C)
1 2 3
RT-qPCR
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
Control P1 P2
5’ss(c1) 3’ss(c2)GAA
SV2
SV3c2
SV1
SV3’c2
mRNA splicing
YURAY (Y)n NCAGGAGGURAGU
U6U4
U2
U1U2AF
65BBP
U1 U2
U5
U2A
F35
U2AF
65
U2A
F35
SPLICEOSOME
mRNA
Exon 1 Exon 2
Exon 1
Exon 2
Exon 2Exon 1
ISE/ESE
ESS/ISS
A
-13u gccucccugcugagcccgcuuucuucucccgcagGCCUGUAugugugug
-13g gccucccugcugagcccgcuugcuucucccgcagGCCUGUAugugugug
-13u-13g Beads
U2AF65
TDP-43
-13 3‘ssug-tailBP
(yncuray)
CB -13u-13g BeadsMW
83
58
47.5
32.5
kDa
P. red Western
WT Mut
N
SV3SV2
0
20
40
60
80
100
120
WT MutR
ela
tive n
orr
mal sp
liced
m
RN
A e
xp
ressio
n(%
of
WT
)
Nde1�
50nt 50nt
GAAExon 2SV40
Nde1�
pA
Nde1�
50nt 50nt
GAAExon 2SV40
Nde1�
pAa2-3 Bra2
Minigene
WT
Mut
N
SV3SV2
N
SV3SV2
-
Effetto della sovraespressione di proteine SR e hnRNP sullo
splicing del esone 2 della GAA
SV3SV2
-
N
N
SV3
SV2
SRSF4
Tubulin
B CR
ela
tive n
orr
mal sp
liced
mR
NA
exp
ressio
n(%
of
scra
mb
le)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
P1 P1+2ug SRSF4 P1+4ug SRSF4
A
Rela
tive n
orr
mal sp
liced
mR
NA
exp
ressio
n(%
of
mo
ck t
ran
sfe
cetd
cells)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
scramble siRNA
*
*
*
Fibroblasti c.-32-13T>G
Fibroblasti Normali
Resv
- +
Resv.
SRSF4
SRSF6
SRSF1
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
Control P1 P1+Resv P2 P2+Resv
*
*
Rela
tive n
orr
mal sp
liced
m
RN
A e
xp
ressio
n(%
of
C)
*
**
Rela
tive n
orr
mal sp
liced
m
RN
A e
xp
ressio
n(%
of
Mu
t)
Rela
tive G
AA
acti
vit
y (
% o
f C
)
*
*
0
20
40
60
80
100
120
Control P1 P1+Resv P2 P2+Resv
0
1
2
3
4
5
6
**
70kDa
Actin
GAA
C P1 P2
- - + - +
Screening
Rela
tive n
orr
mal sp
liced
m
RN
A e
xp
ressio
n(%
of
Mu
t)*
**
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
Screening
exon 1
exon 2 (578 bp)
exon 3
cgggtgaga
35 bp
gcg/gtaaca
tcttctcccgcaggc….
60 bp
….acggtgggc catctcttctagat
-13T>G
Tcttccccaag/ga5’ss(c1) 3’ss(c2)
U2AF
65
SRSF4 Isoforma normale di splicing
Resv. SAHA Isoforma normale di splicing
Espressione della proteina GAA
Attività enzimatica GAA
“in vitro proof of principle” per l’utilizzo di piccole molecole al fine di
correggere lo splicing degli alleli che presentano la mutazione c.-32-
13T>G
In sintesi
Ringraziamenti
ICGEB
Emanuele Buratti
Cristiana Stuani
Francisco Baralle
Regional Coordinator Centre
for Rare Diseases
Stefania Zampieri
Irene Zanin
Annalisa Pianta
Milena Romanello
Bruno Bembi
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