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upstream elements
promoter elements
transcription START site
introns
exons
TRANSCRIPTIONCAPPING
SPLICINGPOLYADENYLATION
m7G
m7G AAAAAAAAAn
m7G AAAAAAAAAn
TRANSPORT
TRANSLATION
gene
pre-mRNA
polyadenylated pre-mRNA
mature mRNA
Espressione genica negli eucarioti
Splicing del pre-mRNA
Scoperta della struttura del gene in esoni ed introni
Tipico gene di mammifero: Regione di circa 16kb 7-8 esoni
Esoni: corti (circa 100-200 bp)Introni: anche molto estesi (>1kb)
Gene dell’ovalbumina di pollo ibridato con il suo mRNA e visualizzato al microscopio elettronico
Come si studia lo splicingCome si studia lo splicing• Procedura Procedura
-Trascrivere l’RNA in vitro-Trascrivere l’RNA in vitro
-Incubare l’RNA in estratti nucleari di cellule HeLa-Incubare l’RNA in estratti nucleari di cellule HeLa
-Estrarre l’RNA dopo diversi tempi di incubazione-Estrarre l’RNA dopo diversi tempi di incubazione
-Analizzare i prodotti della reazione tramite -Analizzare i prodotti della reazione tramite elettroforesielettroforesi
• Procedura Procedura -Trascrivere l’RNA in vitro-Trascrivere l’RNA in vitro
-Incubare l’RNA in estratti nucleari di cellule HeLa-Incubare l’RNA in estratti nucleari di cellule HeLa
-Estrarre l’RNA dopo diversi tempi di incubazione-Estrarre l’RNA dopo diversi tempi di incubazione
-Analizzare i prodotti della reazione tramite -Analizzare i prodotti della reazione tramite elettroforesielettroforesi
Sequenze “consensus” per lo splicing
La reazione di splicing
Analisi in vitro dei complessi di splicing
gel nativo
1 - tempo 0’
3 - tempo 30’
2 - tempo 90’
5 snRNPs1. snRNAs = piccoli RNA nucleari (ricchi in Uracile, a localizzazione nucleoplasmatica): U1, U2, U4, U5 and U6
2. Componenti proteici specifici per ciascuna particella insieme ad un set comune a tutte le snRNPs (Sm)
e
centinaia di proteine (U2AF,BBP…..)
Per lo splicing dei pre-mRNA è richiesto lo SPLICEOSOMA:
small nuclear ribonucleoproteins
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