View
217
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA FARMACIJO
NIKA HRIBERNIK
NAČRTOVANJE IN SINTEZA NOVIH PIROLAMIDNIH ZAVIRALCEV DNA
GIRAZE B IZ BAKTERIJ ESCHERICHIA COLI IN STAPHYLOCOCCUS AUREUS
MAGISTRSKA NALOGA
ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJA
Ljubljana, 2016
UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA FARMACIJO
NIKA HRIBERNIK
NAČRTOVANJE IN SINTEZA NOVIH PIROLAMIDNIH ZAVIRALCEV DNA-
GIRAZE B IZ BAKTERIJ ESCHERICHIA COLI IN STAPHYLOCOCCUS AUREUS
DESIGN AND SYNTHESIS OF NOVEL PYRROLAMIDE DNA GYRASE B
INHIBITORS FROM ESCHERICHIA COLI AND STAPHYLOCOCCUS AUREUS
MAGISTRSKA NALOGA
ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJA
Ljubljana, 2016
I
Magistrsko nalogo sem izdelala na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani, na
Katedri za farmacevtsko kemijo pod mentorstvom doc. dr. Tihomirja Tomašiča, mag. farm.
Spektroskopske meritve so opravili na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani in
na Institutu Jožef Stefan v Ljubljani. In vitro testiranja so opravili na Fakulteti za farmacijo
Univerze v Ljubljani in na Centre for Drug Research, Fakultete za farmacijo Univerze v
Helsinkih na Finskem.
Zahvala
Rada bi se zahvalila svojemu mentorju, doc. dr. Tihomirju Tomašiču, mag. farm. za
strokovno svetovanje, potrpežljivost in spodbudo pri nastajanju magistrskega dela.
Hvala tudi tebi Jernej, da si verjel vame, me optimistično spodbujal in ob vsakem
trenutku znal narisati nasmeh na obraz.
Iskrena hvala dragima mami in očetu, da sta me v vseh teh letih študija usmerjala po
pravi poti ter me moralno in finančno podpirala.
Hvala tudi vsem prijateljem, s katerimi smo ustvarjali nepozabne spomine na
študentska leta.
Izjava
Izjavljam, da sem magistrsko nalogo samostojno izdelala pod mentorstvom doc. dr.
Tihomirja Tomašiča, mag. farm.
Nika Hribernik
Ljubljana, 2016
II
VSEBINA
POVZETEK.............................................................................................................................. VI
KLJUČNE BESEDE ............................................................................................................... VII
ABSTRACT .......................................................................................................................... VIII
KEYWORDS ........................................................................................................................... IX
SEZNAM OKRAJŠAV ........................................................................................................ - 1 -
1. UVOD ................................................................................................................................ - 3 -
1.1. ZGODOVINA ............................................................................................................ - 3 -
1.2. PROTIBAKTERIJSKE UČINKOVINE .................................................................. - 3 -
1.3. RAZLIKA MED PO GRAMU NEGATIVNIMI IN PO GRAMU POZITIVNIMI
BAKTERIJAMI ................................................................................................................ - 5 -
1.4. DNA ............................................................................................................................ - 6 -
1.5. TOPOIZOMERAZE .................................................................................................. - 6 -
1.5.1. DNA-giraza in topoizomeraza IV ...................................................................... - 7 -
1.5.2. ATP vezavno mesto ............................................................................................ - 8 -
1.6. REZISTENCA BAKTERIJ ....................................................................................... - 9 -
1.7. MOŽNOST RAZVOJA NOVIH PROTIBAKTERIJSKIH UČINKOVIN ......... - 10 -
1.7.1. GyrA/ParC inhibitorji ....................................................................................... - 11 -
1.7.2. GyrB/ParE inhibitorji ........................................................................................ - 11 -
1.8. MOLEKULSKO MODELIRANJE ........................................................................ - 13 -
2. NAČRT DELA ................................................................................................................ - 15 -
3. MATERIALI IN METODE ........................................................................................... - 18 -
3.1. RAČUNALNIŠKE METODE ................................................................................ - 18 -
3.1.1. Računalniška oprema ........................................................................................ - 18 -
3.1.2. Programska oprema........................................................................................... - 18 -
3.2. MATERIALI ............................................................................................................ - 18 -
3.3. SINTEZNE METODE............................................................................................. - 19 -
3.3.1. Kromatografske metode .................................................................................... - 19 -
3.3.1.1. Tankoplastna kromatografija (TLC) ......................................................... - 19 -
3.3.1.2. »Flash« kolonska kromatografija .............................................................. - 19 -
3.3.2. Spektroskopske metode .................................................................................... - 19 -
III
3.3.2.1. Nuklearna magnetna resonanca (NMR) ................................................... - 19 -
3.3.2.2. Masna spektrometrija (MS) ....................................................................... - 19 -
3.3.3. Določanje tališča ............................................................................................... - 19 -
3.4. BIOKEMIJSKA TESTIRANJA ............................................................................. - 20 -
3.4.1. Encimski testi in določanje IC50 ....................................................................... - 20 -
3.4.2. Protibakterijska aktivnost ................................................................................. - 20 -
4. EKSPERIMENTALNO DELO ..................................................................................... - 21 -
4.1. Sinteza 2-metil-1H-pirola ........................................................................................ - 21 -
4.2. Sinteza 2,2,2-trikloro-1-(5-metil-1H-pirol-2-il)etan-1-ona ................................... - 22 -
4.3. Sinteza etil 5-metil-1H-pirol-2-karboksilata .......................................................... - 23 -
4.4. Sinteza etil 3,4-dikloro-5-(klorometil)-1H-pirol-2-karboksilata ........................... - 24 -
4.5. Sinteza etil 3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksilata ...................................... - 25 -
4.6. Sinteza 3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksilne kisline ................................. - 26 -
4.7. Sinteza (S)-N-(2-amino-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-6-il)-3,4-dikloro-5-
metil-1H-pirol-2-karboksamida ...................................................................................... - 27 -
4.8. Sinteza (S)-N-(2-acetamido-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-6-il)-3,4-dikloro-5-
metil-1H-pirol-2-karboksamida ...................................................................................... - 28 -
4.9. Sinteza etil (S)-2-((6-(3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksamido)-4,5,6,7-
tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-2-il)amino)-2-oksoacetata ............................................... - 29 -
4.10. Sinteza (S)-2-((6-(3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksamido)-4,5,6,7-
tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-2-il)amino)-2-oksoacetilne kisline ................................. - 30 -
5. REZULTATI IN RAZPRAVA ...................................................................................... - 32 -
5.1. KOMENTAR MOLEKULSKEGA MODELIRANJA ......................................... - 32 -
5.1.1. Validacija protokola za sidranje ....................................................................... - 32 -
5.2. KOMENTAR SINTEZNIH POSTOPKOV ........................................................... - 36 -
5.2.1. Sinteza 3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksilne kisline .......................... - 36 -
5.2.2. Sinteza končnih spojin ...................................................................................... - 38 -
5.3. KOMENTAR BIOLOŠKIH TESTIRANJ ............................................................. - 39 -
5.3.1. Encimski testi .................................................................................................... - 39 -
5.3.2. Protibakterijska aktivnost ................................................................................. - 43 -
6. SKLEP ............................................................................................................................. - 46 -
7. LITERATURA ................................................................................................................ - 47 -
IV
SLIKOVNO KAZALO
Slika 1: Učinkovine, ki delujejo na posamezne tarče v bakterijski celici ......................... - 4 -
Slika 2: Grafični prikaz po Gramu pozitivnih in po Gramu negativnih bakterij............... - 5 -
Slika 3: Prikaz sproščene in dodatno zvite oblike DNA ..................................................... - 6 -
Slika 4: Modela tetramerov bakterijske DNA-giraze in topoizomeraze IV ...................... - 7 -
Slika 5: Kristalna struktura 43 kDa N-končnega fragmenta GyrB iz E. coli v kompleksu z
ADPNP .................................................................................................................................. - 8 -
Slika 6: ATP-vezavno mesto GyrB iz E. coli v kompleksu z ADPNP .............................. - 8 -
Slika 7: Prikaz interakcij med ATP in GyrB iz E. coli ....................................................... - 9 -
Slika 8: Prikaz različnih mehanizmov v bakteriji, preko katerih pride do rezistence ..... - 10 -
Slika 9: Ciprofloksacin (levo) in moksifloksacin (desno) ................................................ - 11 -
Slika 10: Novobiocin .......................................................................................................... - 11 -
Slika 11: Predstavnik ciklotialidinov ................................................................................. - 12 -
Slika 12: Prvi pirolamidni inhibitorji DNA-giraze odkriti pri podjetju AstraZeneca ..... - 13 -
Slika 13: Primeri pirolamidov, ki so jih razvijali pri AstraZeneci ................................... - 13 -
Slika 14: Encim (E) in inhibitor (I), sidranje stremi k pravilni napovedi kompleksa
[E+I]=[EI] v ravnotežnih pogojih ...................................................................................... - 14 -
Slika 15: Struktura oroidina in novega inhibitorja DNA-giraze. ..................................... - 15 -
Slika 16: Predvidena vezava spojine KSK 21 v ATP-vezavnem mestu DNA-giraze iz E.
coli, narejena s programom FlexX (levo) in s programom OEDocking (desno). ........... - 33 -
Slika 17: Shematski prikaz interakcij (levo) in predvidena vezava spojine 11 v ATP-
vezavnem mestu DNA-giraze iz E. coli (desno). .............................................................. - 36 -
Slika 18: Možni produkti kloriranja. .................................................................................. - 38 -
Graf 1: Prikaz pIC50 v odvisnosti od cenilne funkcije Chemgauss4 Score .................... - 34 -
Graf 2: Prikaz pIC50 v odvisnosti od cenilne funkcije FlexX Score ............................... - 34 -
Graf 3: Idealni prikaz pIC50 v odvisnosti od cenilne funkcije Chemgauss4 Score........ - 35 -
V
Preglednica I: Pomembne razlike med bakterijskimi in človeškimi celicami ................... - 4 -
Preglednica II: Srednje zaviralne koncentracije spojin na izoliranih encimih DNA-giraze in
topoizomeraze IV iz bakterij E. coli in S. aureus.............................................................. - 40 -
Preglednica III: % inhibicije rasti na bakterijskih sevih S. auerus, E. faecalis, E. coli in P.
aeruginosa pri spojinah 8, 9, 10, 11 po 24 urah ................................................................ - 43 -
Preglednica IV: Vrednosti MIC spojine 8 na bakterijskih sevih po Gramu pozitivnih
bakterij E. faecalis in S. aureus po 4 urah, 8 urah in 24 urah. ........................................ - 45 -
Preglednica V: Vrednosti MBC spojine 8 na bakterijskih sevih po Gramu pozitivnih
bakterij E. faecalis in S. aureus. ........................................................................................ - 45 -
VI
POVZETEK
Vedno večji zdravstveni problem predstavljajo bakterije, ki so odporne proti že
uveljavljenim protibakterijskim učinkovinam. Zato so eno izmed bolj perspektivnih področij
raziskovanja topoizomeraze tipa II, predvsem bakterijske topoizomeraze tipa IIa, kamor
uvrščamo DNA-girazo in topoizomerazo IV. Samo bakterije vsebujejo ta dva encima, ki
vplivata na podvojevanje, popravljanje in razpletanje DNA. DNA-giraza je heterodimer,
sestavljen iz dveh podenot giraze A in dveh podenot giraze B, pri čemer je podenota A
odgovorna za cepitev in ponovno združitev dvojne vijačnice DNA, podenota B pa vsebuje
vezavno mesto za ATP in s tem zagotavlja dovolj energije, ki je potrebna pri dodatnemu
zvijanju DNA.
V magistrski nalogi smo najprej s pomočjo molekulskega modeliranja načrtovali
primerne zaviralce na osnovi znanih kristalnih struktur encima DNA-giraze iz bakterije
Escherichia coli v kompleksu z inhibitorji in preučevali predvideno vezavo načrtovanih
spojin s pomočjo sidranja ligandov v ATP-vezavno mesto. Nato smo sintetizirali nove
inhibitorje s 4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazolnim osrednjim delom. Pri tem smo z uvedbo
različnih substituentov poskušali izboljšati inhibitorno in posledično tudi protibakterijsko
aktivnost. Končne spojine (8-11) smo tudi biološko ovrednotili na izolirani DNA-girazi in
topoizomerazi IV iz bakterij E. coli in Staphylococcus aureus ter na klinično nadzorovanih
bakterijskih sevih po Gramu negativnih bakterij E. coli in Pseudomonas aeruginosa ter po
Gramu pozitivnih bakterij S. aureus in Enterococcus faecalis.
Najboljšo inhibitorno aktivnost na vseh izoliranih encimih je pokazala spojina 11, ki
je derivat oksalne kisline na aminski skupini na mestu 2 osrednjega ogrodja. Ugotovili smo
tudi, da so zaradi manjšega ATP-vezavnega mesta na DNA-girazi iz S. aureus najbolj
primerne spojine s 3,4-dikloro-5-metilpirolnim obročem, ki poleg vodikove vezi tvorijo še
dodatne hidrofobne interakcije. Čeprav smo od spojine 11 največ pričakovali tudi pri testih
na bakterijskih sevih, pa je samo spojina 8 po 24 urah dosegla več kot 50% inhibicijo na
bakterijskem sevu S. aureus.
Možnosti za nadaljnje raziskovanje je še veliko, predvsem bi bilo zanimivo, če bi s
spremembo fizikalno-kemijskih lastnosti spojin dosegli lažje prehajanje membrane po
Gramu pozitivnih bakterij in s tem izboljšali tudi protibakterijsko aktivnost zaviralcev DNA-
giraze tega strukturnega razreda.
VII
KLJUČNE BESEDE
Protibakterijska učinkovina
DNA-giraza
Odpornost
Dvojni zaviralci
Sidranje
VIII
ABSTRACT
Bacteria resistant to the established antibacterial drugs represent a growing health
threat. Thus, one of the most promising areas of research are type II topoisomerases,
especially bacterial type IIa topoisomerases including DNA gyrase and topoisomerase IV.
Only bacteria contain these two enzymes that are vital to DNA replication, repair and
decatenation. DNA gyrase is a heterodimeric enzyme consisting of two DNA gyrase A
subunits and two DNA gyrase B subunits, whereby the A subunit is responsible for breakage
and reunion of the double DNA strand, while B subunit is required for the ATPase activity,
providing sufficient amount of energy for DNA supercoiling.
In the first part of our Master’s thesis, we have mapped suitable inhibitors by
molecular modelling, on the basis of known crystal structures of the enzyme from
Escherichia coli DNA gyrase in complex with inhibitors, and studied the foreseen binding
of compounds by anchoring ligands to ATP-binding pocket. Then, we have synthesised
novel inhibitors based on 4,5,6,7-tetrahydrobenzo[1,2-d]thiazole scaffold. By introducing
various substituents, we have tried to improve the inhibitory and, consequently, antibacterial
activity. Final compounds 8-11 were also biologically evaluated on the isolated DNA gyrase
and topoisomerase IV from E. coli and Staphylococcus aureus, as well as on clinically
controlled bacterial strains of Gram-negative E. coli and Pseudomonas aeruginosa and
Gram-positive S. aureus and Enterococcus faecalis.
Compound 11, a derivative of oxalic acid on the amino group at the position 2 of the
central scaffold, showed the most potent inhibitory activity on all isolated enzymes. We have
also discovered that due to a smaller ATP-binding site on S. aureus DNA gyrase, the most
suitable compounds are those with a 3,4-dichloro-5-methylpyrrole moiety, which forms –
along with a hydrogen bond – additional hydrophobic interactions. Although we also had
high expectations for compound 11 in terms of bacterial strain assays, only compound 8
achieved more than 50% inhibition after 24 hours on S. aureus.
Possibilities for further research are numerous; however, an especially interesting
aspect may be gained with modification of the physicochemical characteristics of
compounds to facilitate easier membrane penetration in Gram-positive bacteria, thus
improving the antibacterial activity of DNA gyrase inhibitors of this structural class.
IX
KEYWORDS
Antibacterial drug
DNA gyrase
Resistance
Dual inhibitors
Docking
- 1 -
SEZNAM OKRAJŠAV
ATP adenozin-5'-trifosfat
2D dvodimenzionalen
3D tridimenzionalen
Å ångström
ADPNP adenozin-5'-(β,γ-imino)trifosfat
Arg136 arginin 136
Asp73 aspartat 73
Asp81 aspartat 81
DIPEA N-etildiizopropilamin
DMF N,N-dimetilformamid
DMSO-d6 devteriran dimetilsulfoksid-d6
DNA deoksiribonukleinska kislina
E. coli Escherichia coli
E. faecalis Enterococcus faecalis
ESI ionizacija z razprševanjem v električnem polju
Gly77 glicin 77
GyrA A podenota DNA-giraze
GyrB B podenota DNA-giraze
HATU 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridin 3-oksid
heksafluorofosfat
IC50 srednja zaviralna koncentracija inhibitorja
Ile78 izolevcin 78
Ile94 izolevcin 94
- 2 -
kDa kilodalton
MBC minimalna baktericidna koncentracija
MF mobilna faza
MHz megaherz
MIC minimalna inhibitorna koncentracija
MRSA meticilin rezistenten Staphylococcus aureus
MS masna spektroskopija
NMR nuklearna magnetna resonanca
P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa
ParC C podenota topoizomeraze IV
ParE E podenota topoizomeraze IV
PDB Protein Data Bank
ppm delci na milijon (10-6)
RA rezidualna aktivnost
Rf retencijski faktor
S. aureus Staphylococcus aureus
THF tetrahidrofuran
Thr165 treonin 165
TLC tankoplastna kromatografija
TMS tetrametilsilan
topoIV topoizomeraza IV
Val120 valin 120
δ kemijski premik
- 3 -
1. UVOD
1.1. ZGODOVINA
Že stari Egipčani in Kitajci v tradicionalni kitajski medicini so si pri zdravljenju
bakterijskih infekcij pomagali z različnimi plesnimi in rastlinami, npr. s pelinom. Novo
obdobje v zgodovini medicine sta s svojimi znanstvenimi dognanji o povzročiteljih
nalezljivih bolezni začela francoski mikrobiolog Louis Pasteur in nemški zdravnik Robert
Koch. Leta 1928 je škotski biolog Alexander Fleming po naključju odkril penicilin in prav
to odkritje se je izkazalo za eno pomembnejših v boju proti boleznim, ki so jih povzročale
bakterije in so v tistih časih v večini primerov veljale za neozdravljive. (1, 2, 3, 4)
1.2. PROTIBAKTERIJSKE UČINKOVINE
Bakterijske okužbe lahko zdravimo s protibakterijskimi učinkovinami naravnega,
polsinteznega in sinteznega izvora, ki delujejo bakteriostatično, t.j. zavirajo rast in
razmnoževanje bakterij, ali pa baktericidno, t.j. ubijejo povzročitelje bolezni.
Ozkospektralne protibakterijske učinkovine delujejo le proti eni skupini bakterij, če pa
učinkujejo tako proti po Gramu negativnim kot po Gramu pozitivnim bakterijam, jih
imenujemo širokospektralne učinkovine.
Glede na mehanizem delovanja poznamo protibakterijske učinkovine, ki (i) zavirajo
sintezo bakterijske celične stene, (ii) interagirajo s citoplazemsko membrano, (iii) ovirajo
sintezo proteinov, (iv) zavirajo replikacijo, transkripcijo in zvijanje jedrnih kislin, ali pa (v)
delujejo kot antimetaboliti. (3, 4, 5, 6, 7)
Primeri učinkovin, ki delujejo na posamezne tarče, so predstavljeni na sliki 1.
- 4 -
Slika 1: Učinkovine, ki delujejo na posamezne tarče v bakterijski celici. (prirejeno po 8)
Pri načrtovanju novih protibakterijskih učinkovin želimo doseči selektivno
toksičnost, ki temelji na razlikah med bakterijskimi in človeškimi celicami. Čeprav tudi
nekateri evkariontski encimi, npr. kinaze, evkariontske topoizomeraze II, za svoje delovanje
potrebujejo energijo iz ATP, so inhibitorji DNA-giraze in topoizomeraze IV dovolj
selektivni, da delujejo samo na bakterijske celice. (9)
Pomembne razlike med bakterijskimi in človeškimi celicami so predstavljene v
preglednici I.
Preglednica I: Pomembne razlike med bakterijskimi in človeškimi celicami. (3, 4, 6, 7, 10)
CELIČNE
KOMPONENTE
PROKARIONTI EVKARIONTI
VELIKOST (premer) 1-10 µm 6-20 µm
CELIČNA STENA IZ
PEPTIDOGLIKANA
da, razen pri Mycoplasma Ne
ORGANELI V
CITOPLAZMI
ne mitohondriji, endoplazemski
retikulum, Golgijev aparat,…
RIBOSOMI 70S (50S/30S) 80S (60S/40S)
JEDRNA MEMBRANA ne Da
KROMOSOMI en sam več
- 5 -
ZUNAJKROMOSOMSKA
DNA
plazmidi v organelih (mitohondriji)
DNA VERIGA krožna, prosto v
citoplazmi
linearna, v celičnem jedru
DNA-GIRAZA da Ne
1.3. RAZLIKA MED PO GRAMU NEGATIVNIMI IN PO
GRAMU POZITIVNIMI BAKTERIJAMI
Okužbo so sposobne povzročiti patogene bakterije, ki jih lahko razdelimo na po
Gramu negativne in po Gramu pozitivne bakterije. Razlika med njimi je predvsem v zgradbi
celične stene, ki daje obliko in zaščito celici pred zunanjimi vplivi.
Po Gramu pozitivne bakterije imajo do 40 plasti debelo plast peptidoglikana. Le-ta
predstavlja do 50% celične stene, ki lahko vsebuje tudi teihoično kislino, ki je vezana na
peptidoglikan in lipoteihoično kislino, ki je vezana na celično steno (slika 2).
Po Gramu negativne bakterije pa imajo bolj kompleksno zgradbo celične stene, ki je
sestavljena iz le nekaj plasti peptidoglikana (5-10% celične stene) in zunanje membrane, ki
vsebuje fosfolipide, lipopolisaharide in proteine. Med citoplazemsko in zunanjo membrano
je periplazemski prostor, v katerem so vezavni proteini za različna hranila, lipoproteinske
molekule in encimi (slika 2). (3)
Slika 2: Grafični prikaz po Gramu pozitivnih in po Gramu negativnih bakterij. (prirejeno po
11)
- 6 -
1.4. DNA
Dvojno vijačnico DNA sestavljata dve komplementarni polinukleotidni verigi, ki sta
antiparalelni. Pri evkariontih je DNA linearna, shranjena v celičnem jedru in mitohondrijih
v obliki kromosomov. DNA prokariontov pa je v obliki zaprte krožne molekule, ki prosto
plava v citoplazmi. Bakterije lahko vsebujejo še dodatne manjše krožne molekule DNA,
imenovane plazmidi.
Obstajata dve obliki DNA, sproščena in dodatno zvita, ki je manj stabilna od
sproščene oblike (slika 3). DNA je lahko dodatno zvita v pozitivno ali v negativno smer. V
naravi največkrat najdemo negativno dodatno zvito obliko DNA, pri kateri je DNA zvita
okoli osi v nasprotni smeri dvojne vijačnice. Pretvarjanje med obema oblikama DNA
katalizirajo encimi topoizomeraze. (6, 7, 12)
Slika 3: Prikaz sproščene in dodatno zvite oblike DNA. (prirejeno po 13)
1.5. TOPOIZOMERAZE
Topoizomeraze so encimi, ki spreminjajo topološka stanja DNA in so s tem
pomembni za življenje tako prokariontske kot evkariontske celice. Poznamo topoizomeraze
tipa I, ki odvijajo dodatno zvito DNA, s tem da cepijo le eno verigo dvojne vijačnice in
tvorijo energetsko ugodnejšo, sproščeno obliko DNA. Topoizomeraze tipa II, katerih naloga
je zavijanje molekule DNA, tako da tvorijo negativni dodatni zavoj, pa cepijo obe verigi
vijačnice hkrati.
- 7 -
Samo bakterije vsebujejo topoizomeraze tipa IIa – DNA-girazo in topoizomerazo IV
– ki vplivata na podvojevanje, popravljanje in razpletanje DNA. (6, 9, 14)
1.5.1. DNA-giraza in topoizomeraza IV
Bakterijska DNA-giraza je encim, ki uvaja dodatne negativne zavoje v krožno
molekulo DNA pred podvojevalnimi vilicami in tako vzdržuje topologijo DNA, saj zmanjša
torzijsko napetost med podvojevanjem. Za to uporablja energijo, ki se sprosti ob hidrolizi
ATP. Encim je sestavljen iz dveh podenot giraze A (GyrA) in dveh podenot giraze B (GyrB),
ki skupaj tvorita funkcionalni heterodimer A2B2 (slika 4). Podenota A je odgovorna za
cepitev in ponovno združitev dvojne vijačnice DNA, podenota B pa vsebuje vezavno mesto
za ATP in s tem zagotavlja dovolj energije, ki je potrebna pri dodatnemu zvijanju DNA. (4,
14, 15, 16, 17)
Topoizomeraza IV je paralog DNA-girazi, sestavljen iz dveh podenot ParC in dveh
podenot ParE, ki sta homologni GyrA in GyrB in tvorita heterodimer C2E2 (slika 4). Funkcije
bakterijske topoizomeraze IV še ne poznamo dobro, vemo pa, da nadzoruje dodatno zvijanje
DNA in razpletanje hčerinskih kromosomov na koncu podvojitve DNA. (9, 14, 16)
Slika 4: Modela tetramerov bakterijske DNA-giraze in topoizomeraze IV. (prirejeno po 18)
- 8 -
1.5.2. ATP vezavno mesto
Celotna kristalna struktura DNA-giraze in topoizomeraze IV še ni poznana. Na voljo
pa nam je več kristalnih struktur fragmentov GyrB in ParE vezavne domene za ATP v
kompleksu z različnimi ligandi. (14, 16)
Leta 1991 je bil objavljen 43 kDa N-končni fragment DNA-giraze B iz E. coli v
kompleksu z ADPNP, t.j. nehidrolizirajočim analogom ATP, kot prva poznana kristalna
struktura bakterijske topoizomeraze tipa II (slika 5). Na domeni I, ki vsebuje 8 β-ploskev in
5 α-vijačnic se nahaja ATP-vezavno mesto. Domena II pa vsebuje 4 β-ploskve in 4 α-
vijačnice. Ob prisotnosti ATP ali ADPNP GyrB tvori dimer (slika 6). (16, 18)
Slika 5: Kristalna struktura 43 kDa N-končnega fragmenta GyrB iz E. coli v kompleksu z
ADPNP. (prirejeno po 16)
Slika 6: ATP-vezavno mesto GyrB iz E. coli v kompleksu z ADPNP. (prirejeno po 18)
- 9 -
Zelo pomembna je strukturno ohranjena molekula vode, ki tvori vodikove vezi z
adeninskim obročem ATP in aminokislinskimi ostanki Asp73, Gly77 in Thr165. S stransko
verigo Asp73 se tvorita dve vodikovi vezi, ena direktno z adeninskim obročem, druga pa
posredno preko molekule vode. Hidrofobni žep z aminokislinskimi ostanki Ile78, Ile94 in
Val120 tvori hidrofobne interakcije z adeninom in ribozo. (16)
Interakcije med molekulo ATP in DNA-girazo B iz E. coli so predstavljene na sliki
7.
Slika 7: Prikaz interakcij med ATP in GyrB iz E. coli (strukturno ohranjena molekula vode:
rdeča; aminokislinski ostanki, s katerimi voda tvori vodikove vezi: modra; aminokislinski
ostanki, ki tvorijo hidrofobni žep: zelena; vodikove vezi: črtkana črta; hidrofobne
interakcije: polna črta). (prirejeno po 16)
1.6. REZISTENCA BAKTERIJ
Svetovna zdravstvena organizacija opozarja, da povsem običajne infekcije, ki so bile
obvladljive več desetletij, kmalu ne bodo več ozdravljive ravno zaradi odpornosti bakterij
proti protibakterijskim učinkovinam. (19)
Bakterije imajo različne mehanizme, preko katerih pride do pridobljene odpornosti,
ki so predstavljene na sliki 8. Ob prisotnosti različnih encimov se protibakterijske učinkovine
lahko razgradijo, npr. betalaktamaze razgradijo betalaktame, kloramfenikol je inaktiviran s
- 10 -
kloramfenikol acetiltransferazo, plazmidne transferaze pa razgradijo aminoglikozide. S
pomočjo izlivne črpalke pride do aktivnega črpanja spojine iz celice in s tem do zmanjšanega
zadrževanja zdravilne učinkovine v bakteriji. Zaradi mutacij na genih za porine pride do
zmanjšane prepustnosti celične membrane. Lahko se spremeni presnovna pot, na katero
deluje protibakterijska učinkovina, ali pa nastane nova presnovna pot, na katero učinkovina
ne more vplivati. Pri spremembi tarčnega mesta pride do nastanka novih ali spremembe že
obstoječih penicillin vezočih beljakovin, do spremembe ribosomov, DNA-giraze ali DNA-
ligaze (3, 5)
Slika 8: Prikaz različnih mehanizmov v bakteriji, preko katerih pride do rezistence.
(prirejeno po 20)
1.7. MOŽNOST RAZVOJA NOVIH PROTIBAKTERIJSKIH
UČINKOVIN
Zaradi povečane razširjenosti rezistentnih bakterijskih sevov, slabih
farmakokinetičnih lastnosti in toksičnosti se zmanjšuje učinkovitost in uporaba
protibakterijskih učinkovin. Zato pri odkrivanju novih protibakterijskih učinkovin velikokrat
izkoristimo za tarčo prav bakterijske topoizomeraze tipa IIa, ki nam s pomočjo dvojne
inhibicije DNA-giraze in topoizomeraze IV v večini bakterij, razen mikobakterij, ponujajo
možnost zmanjšati razvoj rezistence. Nastanek rezistence lahko upočasnimo s
protibakterijskim učinkovinam, ki delujejo na dve tarči, saj bi se mutacije morale zgoditi na
dveh različnih genih med eno samo generacijo. (9, 14, 15)
- 11 -
1.7.1. GyrA/ParC inhibitorji
Inhibitorji GyrA in ParC stabilizirajo kompleks med molekulo DNA in podenoto
DNA-giraze A, saj se vežejo v nastali kompleks in s tem preprečujejo združitev DNA verig
in posledično zaustavijo razmnoževalni cikel bakterij. (14, 16, 17)
Mednje prištevamo fluorokinolone, npr. ciprofloksacin, moksifloksacin (slika 9),
gemifloksacin, ki so edini dvojni inhibitorji, ki se trenutno uporabljajo za zdravljenje
uroinfektov, okužb respiratornega trakta ter sistemskih okužb. Zaradi njihove toksičnosti,
neželenih stranskih učinkov in bakterijske rezistence nanje pa se je obudilo zanimanje za
razvoj protibakterijskih učinkovin, ki inhibirajo ATPazno katalitično domeno GyrB in/ali
ParE. (14, 16, 17)
Slika 9: Ciprofloksacin (levo) in moksifloksacin (desno). (prirejeno po 14)
1.7.2. GyrB/ParE inhibitorji
Inhibitorji GyrB in ParE se vežejo v ATP-vezavni žep, ki se nahaja na N-končnem
delu GyrB oziroma ParE in tako preprečijo vezavo ATP. S tem encim izgubi vir energije ter
posledično svojo aktivnost. (16, 21)
Mednje prištevamo aminokumarine, npr. novobiocin (slika 10), klorobiocin, ki so
prvi naravni ATP-kompetitivni inhibitorji DNA-giraze. Novobiocin so nekaj časa
uporabljali celo za zdravljenje infekcij s proti meticilinu odpornem S. aureus (MRSA),
vendar pa so ga zaradi varnostnih razlogov (toksičnost, razvoj rezistence) morali umakniti
iz uporabe. (14, 16)
Slika 10: Novobiocin. (prirejeno po 18)
- 12 -
Predstavniki naravnih GyrB/ParE inhibitorjev so tudi ciklotialidini (slika 11), katerih
encimska inhibicija je dvakrat močnejša kot pri novobiocinu in izražajo tudi večjo
selektivnost do bakterijske DNA-giraze napram evkariontskim topoizomerazam tipa II v
primerjavi z aminokumarini (novobiocin) in fluorokinoloni (ciprofloksacin). Imajo pa slabo
protibakterijsko aktivnost zaradi slabega prehajanja v notranjost celice skozi celično steno.
(16, 18)
Slika 11: Predstavnik ciklotialidinov. (prirejeno po 18)
Za nas pa so najbolj zanimivi inhibitorji DNA-giraze s protibakterijskim delovanjem
iz skupine pirolamidov, ki so jih s pomočjo molekulskega modeliranja odkrili pri podjetju
AstraZeneca. (22)
Z različnimi substituenti so želeli izboljšati encimsko in protibakterijsko aktivnost
prvih pirolamidov (slika 12). Ugotovili so, da sta za večjo jakost potrebni dve
elektronprivlačni skupini, npr. klor, na pirolu, saj tako povečata hidrofobne interakcije v
vezavnem žepu za adenin in zmanjšata pKa vrednost NH skupine v pirolu, s čimer dobimo
močnejši donor vodikove vezi z Asp81 (pri DNA-girazi B iz S. aureus). Prišli so tudi do
ugotovitve, da je šibkejše protibakterijsko delovanje inhibitorjev DNA-giraze proti po
Gramu negativnim bakterijam posledica izlivnih črpalk. Najboljše fizikalno-kemijske
lastnosti in jakost pa dobimo pri pirolamidih s tiazolnim obročem (slika 13). (15, 22)
- 13 -
Slika 12: Prvi pirolamidni inhibitorji DNA-giraze odkriti pri podjetju AstraZeneca. Zaradi
primerne jakosti in fizikalno-kemijskih lastnosti (topnost) je bil desni pirolamid izbran za
nadaljnji razvoj in raziskave. (prirejeno po 15)
Slika 13: Primeri pirolamidov, ki so jih razvijali pri AstraZeneci. (prirejeno po 15)
1.8. MOLEKULSKO MODELIRANJE
Pri odkrivanju novih zdravilnih učinkovin ter razvoju le-teh se vse več opiramo na
uporabo računalnikov oziroma na različne računalniške metode. Tudi pri načrtovanju novih
protibakterijskih učinkovin je uporaba računalniških metod zelo pogosta. (7)
Vse spojine gotovo niso primerne kot zdravilne učinkovine in ravno teh se z
virtualnim rešetanjem znebimo. Virtualno rešetanje (ang. virtual screening) je rešetanje
nekaj milijonov velikih virtualnih knjižnic spojin in rezultat je knjižnica spojin skrčena na
nekaj 1000 spojin, katere potem lahko testiramo v laboratoriju. Je nadomestek rešetanju
visokih zmogljivosti (ang. high troughput screening – HTS), saj je le-ta drag in časovno
zamuden. (23, 24)
Poznamo več oblik virtualnega rešetanja, od filtriranja s pomočjo osnovnih
deskriptorjev (molekulska masa, logP,…), 2D in 3D rešetanja na osnovi podobnosti z
znanim ligandom, do strukturno podprtega virtualnega rešetanja (sidranje), katerega smo pri
izvedbi magistrske naloge uporabili tudi mi. (24)
Glavni pogoj za izvedbo sidranja je poznana 3D struktura tarče, ki jo eksperimentalno
določimo s pomočjo rentgenske kristalografije ali NMR spektroskopije, ali pa izračunamo z
metodo homolognega modeliranja. Veliko tarčnih proteinov z ligandi je že kokristaliziranih
- 14 -
in objavljenih v bazi podatkov Protein Data Bank (PDB), ki je baza javno dostopnih
eksperimentalno določenih proteinskih struktur, iz katere smo tudi sami pridobili kristalne
strukture kompleksov DNA-giraze B iz E. coli in S. aureus z ligandi. (7, 24)
Sam proces sidranja (ang. ''docking'') je sestavljen iz dveh delov, in sicer iz
postavljanja spojine v vezavno mesto (ang. ''posing'') in iz ocene vezavnih energij (ang.
''scoring''). Za sidranje poznamo več programov iz različnih programskih paketov (FlexX,
GOLD, OEDocking, AutoDock, …), katerih cilj je natančno napovedovanje vezave liganda
v vezavno mesto tarče in pravilna napoved njegove aktivnosti (slika 14). Večina programov
za sidranje obravnava spojino fleksibilno, makromolekulo pa rigidno. S sidranjem
napovemo konformacijo in orientacijo liganda znotraj vezavnega mesta tarče. (7, 24, 25)
Slika 14: Encim (E) in inhibitor (I), sidranje stremi k pravilni napovedi kompleksa
[E+I]=[EI] v ravnotežnih pogojih. (prirejeno po 25)
Zelo pomemben del strukturno podprtega virtualnega rešetanja predstavlja ocena
vezavnih energij. Za to obstajajo različni algoritmi (FlexX Score, Chemgauss4 Score,
genetski algoritem, …), ki vrednotijo interakcije med ligandom in vezavnim mestom.
Seveda se tudi pri delu z računalniki ne moremo izogniti morebitnim napakam, npr. večje
molekule tvorijo več hipotetičnih interakcij v vezavnem mestu kot manjše molekule in imajo
zaradi tega boljše ocene vezavnih energij. (25)
Najboljše rangirane spojine nato kupimo, če so komercialno dostopne, ali pa
sintetiziramo in ovrednotimo njihovo aktivnost z biološkimi testi. Spojino, ki se izkaže za
aktivno, lahko kristaliziramo skupaj s proteinom in s pomočjo rentgenske kristalografije
ugotovimo, ali se je spojina vezala tako, kot smo pričakovali. (7)
- 15 -
2. NAČRT DELA
Pri eksperimentalnem delu magistrske naloge bomo izhajali iz strukturnih analogov
oroidina, alkaloida iz spužve Agelas sp, s (S)-N-(2-amino-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-
d]tiazol-6-il)-4,5-dibromo-1H-pirol-2-karboksamidnim skeletom (slika 15). Spojine so bile
nedavno odkrite in sintetizirane na Katedri za farmacevtsko kemijo Fakultete za farmacijo
Univerze v Ljubljani.
Slika 15: Struktura oroidina in novega inhibitorja DNA-giraze.
Najprej bomo strukture znanih inhibitorjev DNA-giraze B iz bakterije E. coli narisali
in energijsko minimizirali s pomočjo programskega paketa ChemBioOffice in nato s
programom OMEGA programskega paketa OpenEye pripravili knjižnico konformerov.
S programom FlexX programskega paketa LeadIT in programom OEDocking programskega
paketa OpenEye bomo izvedli sidranje ligandov v kristalno strukturo DNA-giraze B iz E.
coli in določili, kateri od programov je ustreznejši za preučevanje vezave inhibitorjev DNA-
giraze B. Izbrani program bomo nato uporabili še za sidranje ligandov v ATP-vezavno mesto
DNA-giraze B iz S. aureus.
Sledila bo sinteza novih potencialnih zaviralcev DNA-giraze B z omenjenim
skeletom. Pri tem bomo z uvedbo različnih substituentov poskušali izboljšati inhibitorno in
protibakterijsko aktivnost.
Prva stopnja bo sinteza 3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksilne kisline (spojina
6), ki je predstavljena v shemi 1. Izhajali bomo iz 1H-pirol-2-karbaldehida (spojina 0),
katerega bomo v bazičnem mediju reducirali do alkana 1, nato pa na mesto 2 na pirolu pripeli
trikloroacetilni fragment (2), ki ga bomo v naslednji sintezi z natrijevim etoksidom pretvorili
v ester 3. Sledilo bo kloriranje le-tega s sulfuril kloridom do trikloriranega produkta 4,
dobljeni alkilklorid 4 pa bomo nato s katalitskim hidrogeniranjem reducirali do alkana 5. Na
koncu bo sledila še alkalna hidroliza estra 5 do kisline 6.
- 16 -
Shema 1: Reagenti in pogoji. a) KOH, NH2NH2, etilenglikol, refluks, 24 h; b)
trikloroacetilklorid, Et3N, THF, 0 °C, 24 h; c) Na, EtOH, sobna T, 1 h; d) SO2Cl2, CCl4, 0
°C – sobna T , 2 h; e) H2, Pd/C, EtOH, sobna T, 24 h; f) 10 M NaOH, EtOH, refluks, 3 h
Druga stopnja pa bo sinteza končnih spojin 8 – 11, ki so predstavljene v shemi 2.
Izhajali bomo iz predhodno sintetizirane spojine (S)-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-
2,6-diamina (spojina 7), ki jo bomo s sklopitvenim reagentom 1-[bis(dimetilamino)metilen]-
1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridin 3-oksid heksafluorofosfatom (HATU) v bazičnih pogojih
pretvorili do spojine 8. Z namenom, da dosežemo dodatne interakcije z Arg136 v ATP-
vezavnem žepu DNA-giraze B, bo sledilo pripenjanje različnih substituentov na aminsko
skupino na mestu 2. Pri eni sintezi bomo dodali acetilni (9), pri drugi pa oksalilni fragment
(10). Le-tega bomo na koncu z alkalno hidrolizo pretvorili do kislinskega derivata spojine
(11), da bomo videli razlike med esterskim in kislinskim derivatom.
- 17 -
Shema 2: Reagenti in pogoji. a) 3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksilna kislina, 1-
[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridin 3-oksid heksafluorofosfat, N-
etildiizopropilamin, N,N-dimetilformamid, sobna T, 24 h; b) acetil klorid, Et3N, 1,4-dioksan,
sobna T, 12 h; c) etil oksalil klorid (ClCOCOOCH2CH3), Et3N, 1,4-dioksan, sobna T, 12 h;
d) 1 M NaOH, EtOH, sobna T, 12 h
Končne spojine bodo tudi biološko ovrednotene na izoliranih encimih DNA-giraze
in topoizomeraze IV iz bakterij E. coli in S. aureus ter na klinično nadzorovanih bakterijskih
sevih po Gramu negativnih bakterij E. coli in P. aeruginosa in po Gramu pozitivnih bakterij
S. aureus in E. faecalis.
- 18 -
3. MATERIALI IN METODE
3.1. RAČUNALNIŠKE METODE
3.1.1. Računalniška oprema
Molekulsko modeliranje smo izvajali na računalniku s procesorjem Intel Core i5-
4200U 1.6 GHz, z 8 GB RAM-a, 500 GB trdega diska in z operacijskim sistemom Windows
8.
3.1.2. Programska oprema
Program ChemBioDraw Ultra 14.0, proizvajalca CambridgeSoft, smo uporabili za
risanje spojin in reakcijskih shem ter za poimenovanje spojin. S pomočjo programa
ChemBio3D Ultra 14.0, proizvajalca CambridgeSoft, smo generirali in energijsko
minimizirali tridimenzionalne modele spojin. Za pretvorbo zapisa molekul iz 2D v 3D smo
uporabili program OpenBabel 2.3.0. Knjižnico konformerov smo pripravili s programom
OMEGA, programskega paketa OpenEye. Za sidranje spojin v kristalno strukturo DNA-
giraze B iz E. coli (PDB koda: 4DUH (17)) smo uporabili programa FlexX, ki je del
programskega paketa LeadIT, in OEDocking, ki je del programskega paketa OpenEye.
FlexX smo nato uporabili še za sidranje ligandov v ATP-vezavno mesto DNA-giraze B iz S.
aureus (PDB koda: 3TTZ (15)). Za pregledovanje rezultatov in izdelavo slik smo uporabili
programe VIDA (OpenEye) in PyMOL.
3.2. MATERIALI
Pri eksperimentalnem delu smo uporabili reagente in topila različnih proizvajalcev
(Merck, Sigma-Aldrich, Acros Organics, Tokyo Chemical Industry).
- 19 -
3.3. SINTEZNE METODE
3.3.1. Kromatografske metode
3.3.1.1. Tankoplastna kromatografija (TLC)
Pri tankoplastni kromatografiji, kot metodi za ugotavljanje poteka reakcij ter
ustreznosti mobilne faze za čiščenje spojin s »flash« kolonsko kromatografijo, smo
uporabljali TLC plošče Kieselgel 60 F254 z 0,20 mm nanosom silikagela na aluminijastem
nosilcu, nemškega proizvajalca Merck. Spojine smo detektirali pod UV lučjo z valovno
dolžino 254 nm.
3.3.1.2. »Flash« kolonska kromatografija
Produkte reakcij smo čistili s »flash« kolonsko kromatografijo in pri tem za
stacionarno fazo uporabili silikagel z velikostjo delcev 0,040-0,063 mm (Merck, Nemčija)
in različne mobilne faze. Uporabljali smo različno velike steklene kolone, odvisno od
količine spojine.
3.3.2. Spektroskopske metode
3.3.2.1. Nuklearna magnetna resonanca (NMR)
1H NMR spektre smo posneli na spektrometru Bruker Avance III 400 MHz na
Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani. Vzorce smo raztopili v devteriranem topilu
DMSO-d6, za interni standard pa uporabili TMS.
3.3.2.2. Masna spektrometrija (MS)
Masne spektre so posneli na spektrometru Autospec (VG-Analytical) z metodo ESI
na Centru za masno spektrometrijo na Institutu Jožef Stefan v Ljubljani.
3.3.3. Določanje tališča
Tališča smo spojinam določali s pomočjo Kofflerjevega mikroskopa z ogrevalno
mizico Leica.
- 20 -
3.4. BIOKEMIJSKA TESTIRANJA
3.4.1. Encimski testi in določanje IC50
Vsem spojinam je bila določena encimska zaviralna aktivnost na rekombinantni
DNA-girazi iz bakterije E. coli, bolj obetavnim spojinam pa tudi na DNA-girazi iz bakterije
S. aureus in na topoizomerazi IV iz bakterij E. coli in S. aureus.
Encimske teste je opravil izr. prof. dr. Janez Ilaš, mag. farm., na Fakulteti za
farmacijo Univerze v Ljubljani.
3.4.2. Protibakterijska aktivnost
Za testiranje protibakterijske aktivnosti so uporabljali klinično nadzorovane seve po
Gramu pozitivnih bakterij Enterococcus faecalis (ATCC 29212) in Staphylococcus aureus
(ATCC 25923) ter klinično nadzorovane seve po Gramu negativnih bakterij Escherichia coli
(ATCC 25922) in Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853).
Protibakterijsko aktivnost so določili na Fakulteti za farmacijo Univerze v Helsinkih
na Finskem.
- 21 -
4. EKSPERIMENTALNO DELO
4.1. Sinteza 2-metil-1H-pirola
Natehtali smo spojino 0 (12,22 g; 126,81 mmol) in jo raztopili v 150 mL
etilenglikola, mešali in dodali hidrazin (13,78 mL, 152,04 mmol; 1,02 g/mL). Nato smo
mešali na prej segreti oljni kopeli (90 °C) 1 uro. V reakcijsko zmes smo dodali kalijev
hidroksid (12,24 g; 215,40 mmol) in mešali naprej na oljni kopeli (90 °C) 30 minut. Nato
smo med povratni hladilnik in bučko dodali kapalnik, ki je služil lovljenju produkta, ki je
kondenziral v povratnem hladilniku, ter mešali še 4 ure pri 195 °C. Surovemu produktu, ki
smo ga dobili v kapalniku, smo dodali diklorometan (50 mL) in organsko fazo spirali z
nasičeno raztopino NaHCO3 (25 mL) in nasičeno raztopino NaCl (25 mL). Organsko fazo
smo sušili nad Na2SO4, filtrirali in diklorometan uparili pod znižanim tlakom. Dobili smo
9,055 g spojine 1
Produkt 1: 2-metil-1H-pirol
Elementna sestava C5H7N Mr = 81,12
Opis rumena tekočina
Izkoristek 88,0% 1H NMR
(400 MHz, DMSO-d6)
δ 2,34 (s, 3H, CH3), 5,97 (tdt, 1H, J1 = 3,1 Hz, J2 = 1,7
Hz, J3 = 0,8 Hz, Ar-H3), 6,19 (dd, 1H, J1 = 5,8 Hz, J2 =
2,9 Hz, Ar-H4), 6,71 (dt, 1H, J1 = 4,2 Hz, J2 = 2,6 Hz, Ar-
H5), 7,93 (br s, 1H, NH) ppm
- 22 -
4.2. Sinteza 2,2,2-trikloro-1-(5-metil-1H-pirol-2-il)etan-1-ona
Natehtali smo spojino 1 (9,055 g; 111,62 mmol), jo raztopili v tetrahidrofuranu
(THF) (120 mL; 1,674 mol; 0,889 g/mL) in postavili na ledeno kopel. Potem smo dodali
trietilamin (18,68 mL; 133,94 mmol; 0,726 g/mL) in v roku 30 minut počasi, po kapljicah,
dodajali trikloroacetilklorid (16,29 mL; 145,11 mmol; 1,62 g/mL). Pustili smo mešati čez
noč. Naslednji dan smo v reakcijsko zmes dodali nasičeno vodno raztopino natrijevega
hidrogenkarbonata (15 mL), da smo ustavili reakcijo, in THF uparili pod znižanim tlakom.
Za ekstrakcijo smo uporabili etilacetat (100 mL) in organsko fazo spirali z nasičeno
raztopino NaHCO3 (2 x 50 mL), destilirano vodo (50 mL) in nasičeno raztopino NaCl (50
mL). Naredili smo TLC (MF: etilacetat/heksan=1/4) in na ploščico nanesli vse vodne faze
ter organsko fazo. Sušili smo nad Na2SO4, filtrirali in etilacetat uparili pod znižanim tlakom.
Produkt smo čistili s prekristalizacijo iz heksana. Dobili smo 9,120 g spojine 2.
Produkt 2: 2,2,2-trikloro-1-(5-metil-1H-pirol-2-il)etan-1-on
Elementna sestava C7H6NOCl3 Mr = 226,48
Opis svetlo rumeni kristali
Izkoristek 36,1%
Rf 0,42 (MF: etilacetat/heksan=1/4) 1H NMR
(400 MHz, DMSO-d6)
δ 2,30 (s, 3H, Ar-CH3), 6,12 – 6,14 (m, 1H, Ar-H-4), 7,24
– 7,25 (m, 1H, Ar-H-3), 12,20 (s, 1H, Ar-NH) ppm
- 23 -
4.3. Sinteza etil 5-metil-1H-pirol-2-karboksilata
V približno 100 mL absolutnega etanola smo dodali natehtan natrij (0,6097 g; 26,52
mmol). Na bučko smo dali še povratni hladilnik s kalcijevo cevko ter počakali, da je celoten
natrij reagiral. V reakcijsko zmes smo po delih dodali spojino 2 (5,005 g; 22,10 mmol) in
mešali 1 uro. Nato smo naredili TLC kromatogram (MF: etilacetat/heksan=1/4), s pomočjo
katerega smo ugotovili, da je reakcija potekla do konca. Produktu smo uparili topilo pod
znižanim tlakom ter preostanek ohladili na ledeni kopeli. Dodali smo približno 10 mL
destilirane vode in nakisali z 1 M HCl do pH 3. Ekstrakcijo vodne faze smo izvedeli z
etilacetatom (2 x 50 mL) in organsko fazo spirali z nasičeno raztopino NaHCO3 (50 mL) in
nasičeno raztopino NaCl (50 mL). Organsko fazo smo sušili nad Na2SO4, filtrirali in
etilacetat uparili pod znižanim tlakom. Dobili smo 2,923 g spojine 3.
Produkt 3: etil 5-metil-1H-pirol-2-karboksilat
Elementna sestava C8H11NO2 Mr = 153,20
Opis rjavi kristali
Izkoristek 86,3%
Rf 0,34 (MF: etilacetat/heksan=1/4) 1H NMR
(400 MHz, DMSO-d6)
δ 1,26 (t, 3H, J = 7,1 Hz, CH2CH3), 2,21 (s, 3H, CH3),
4,20 (q, 2H, J = 7,1 Hz, CH2CH3), 5,87 – 5,88 (m, 1H,
Ar-H), 6,66 (dd, 1H, J1 = 2,6 Hz, J2 = 3,3 Hz, Ar-H),
11.58 (s, 1H, NH) ppm
- 24 -
4.4. Sinteza etil 3,4-dikloro-5-(klorometil)-1H-pirol-2-
karboksilata
Produkt prejšnje stopnje 3 (2,923 g; 19,08 mmol) smo raztopili v tetraklorometanu
(50 mL) in dali mešati na ledeno kopel, bučko pa zaprli s septumom. Raztopino smo
prepihali z argonom, nato pa smo počasi z brizgo, po kapljicah, dodali sulfuril klorid (3,24
mL; 40,07 mmol; 1,67 g/mL). Po nastanku oborine smo reakcijsko zmes filtrirali pod
znižanim tlakom in razvili TLC kromatogram (MF: etilacetat/heksan=1/4), s katerim smo
preverili, če je reakcija potekla do konca. Na ploščico smo nanesli standard, izhodno spojino
ter reakcijsko zmes. Ugotovili smo, da je v reakcijski zmesi mešanica mono-, di- in
trikloriranega produkta, zato smo reakcijsko zmes ponovno dali mešati na led. Po 2 urah smo
ponovno razvili TLC kromatogram (MF: etilacetat/heksan=1/4) in ugotovili, da imamo še
vedno mešanico vseh treh kloriranih produktov, zato smo v reakcijsko zmes dodali sulfuril
klorid (0,81 mL; 9,54 mmol; 1,67 g/mL). Ponovno smo razvili TLC kromatogram (MF:
etilacetat/heksan=1/4) in nato reakcijsko zmes filtrirali pod znižanim tlakom, oborino sušili
nekaj minut pod znižanim tlakom, matičnici pa uparili tetraklorometan pod znižanim tlakom.
Pri matičnici smo izvedli še ekstrakcijo z nasičeno raztopino NaHCO3, vodno fazo pa
ekstrahirali z diklorometanom (3 x 30 mL). Sušili smo nad Na2SO4, filtrirali in diklorometan
uparili pod vakuumom. Dobili smo 2,778 g spojine 4.
Produkt 4: etil 3,4-dikloro-5-(klorometil)-1H-pirol-2-karboksilat
Elementna sestava C8H8NO2Cl3 Mr = 256,52
Opis kristali umazano bele barve
Izkoristek 56,8%
Rf 0,17 (MF: etilacetat/heksan=1/4) 1H NMR
(400 MHz, DMSO-d6)
δ 1,32 (t, 3H, J = 7,1 Hz, CH3CH2), 4,31 (q, 2H, J = 7,1
Hz, CH2CH3), 4,72 (s, 2H, CH2Cl), 12,89 (s, 1H, Ar-NH)
ppm
- 25 -
4.5. Sinteza etil 3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksilata
Spojino 4 (2,736 g; 10,67 mmol) smo raztopili v približno 100 mL absolutnega
etanola in postavili na magnetno mešalo. Raztopino smo prepihali z argonom, da smo izgnali
zrak iz reakcijske zmesi. To smo naredili tako, da smo vzeli dovolj dolgo iglo, ki je bila
potopljena v raztopino in nanjo namestili balon z argonom. Uporabili smo še eno krajšo iglo,
ki je nismo potopili v reakcijsko zmes, in je služila izhajanju zraka iz bučke. Natehtali smo
paladij na ogljiku (0,137 g; 1,306 mmol; 5% mase, če je masa izhodnega produkta pod 2 g;
10% mase, če je masa izhodne spojine nad 2 g). Nato smo zamenjali balon z argonom z
balonom z vodikom, da je iz zmesi izpodrinil argon. Tako smo pustili približno 10 minut, da
smo izgnali argon, nato smo odstranili krajšo iglo iz bučke, da smo dobili zaprt sistem. Pustili
smo mešati čez noč v vodikovi atmosferi. Naslednji dan smo razvili TLC kromatogram (MF:
etilacetat/heksan=1/4) in na ploščico nanesli izhodno spojino ter reakcijsko zmes. Reakcijo
smo ustavili tako, da smo katalizator odfiltrirali z odsesavanjem. Reakcijski zmesi smo
uparili etanol pod znižanim tlakom. Dobljeni produkt smo čistili s »flash« kolonsko
kromatografijo, za mobilno fazo pa uporabili diklorometan. Dobili smo 753 mg spojine 5 in
1,324 g stranskega produkta, spojina etil 3,4-dikloro-5-(etoksimetil)-1H-pirol-2-karboksilat.
Produkt 5: etil 3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksilat
Elementna sestava C8H9NO2Cl2 Mr = 222,07
Opis beli kristali
Izkoristek 31,8%
Rf 0,3 (MF: diklorometan) 1H NMR
(400 MHz, DMSO-d6)
δ 1,30 (t, 3H, J = 7,1 Hz, CH3CH2), 2,21 (s, 3H, Ar-CH3),
4,27 (k, 2H, J = 7,1 Hz, CH2CH3), 12,31 (s, 1H, Ar-NH)
ppm
- 26 -
Stranski produkt: etil 3,4-dikloro-5-(etoksimetil)-1H-pirol-2-karboksilat
Elementna sestava C10H13NO3Cl2 Mr = 266,09
Opis bledo rumeni kristali
Izkoristek 52,1%
Rf 0,11 (MF: diklorometan)
Tališče 99-103 °C 1H NMR
(400 MHz, DMSO-d6)
δ 1,11 (t, 3H, J = 7,0 Hz, CH2OCH2CH3), 1,31 (t, 3H, J =
7,1 Hz, COOCH2CH3), 3,43 (k, 2H, J = 7.0 Hz,
CH2OCH2CH3), 4,29 (k, 2H, J = 7,1 Hz, COOCH2CH3),
4,38 (s, 1H, CH2OCH2CH3), 12,68 (s, 1H, Ar-NH) ppm
HR-MS (ESI+) 266,0358 (izračunana: 266,0351)
4.6. Sinteza 3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksilne kisline
V 10 mL 96% etanola smo raztopili produkt prejšnje stopnje 5 (0,678 g; 3,05 mmol)
in dodali natrijev hidroksid (5,5 mL; 55,00 mmol; 10 mol/L). Mešali smo 3 ure pri
temperaturi refluksa. Razvili smo TLC kromatogram (MF: diklorometan) ter na ploščico
nanesli izhodno spojino in reakcijsko zmes. Etanol smo uparili pod znižanim tlakom,
preostalo vodno raztopino pa nakisali s 37% HCl do pH 1-2, izpadlo oborino odfiltrirali z
odsesavanjem ter jo posušili v sušilniku. Matičnico smo ekstrahirali z etilacetatom (4 x 20
mL), organske faze združili, sušili nad Na2SO4, filtrirali in etilacetat uparili pod vakuumom.
Dobili smo 446 mg spojine 6.
- 27 -
Produkt 6: 3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksilna kislina
Elementna sestava C6H5NO2Cl2 Mr = 194,02
Opis oborina svetlo rjave barve
Izkoristek 75,3%
Rf 0,0 (MF: diklorometan) 1H NMR
(400 MHz, DMSO-d6)
δ 2,17 (s, 3H, Ar-CH3) ppm
4.7. Sinteza (S)-N-(2-amino-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-
6-il)-3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksamida
Spojino 6 (0,446 g; 2,30 mmol) smo raztopili v 10 mL N,N-dimetilformamida (DMF)
in dodali N-etildiizopropilamin (0,787 mL; 4,60 mmol; 0,755 g/mL) ter mešali na ledeni
kopeli. Po 5 minutah smo dodali HATU (1,049 g; 2,76 mmol) in počakali 20 minut, da je
potekla aktivacija kisline. Nato smo dodali spojino 7 (0,389 g; 2,30 mmol) in še N-
etildiizopropilamin (0,394 mL; 2,30 mmol; 0,755 g/mL). Pustili smo mešati čez noč pri sobni
temperaturi. Naslednji dan smo razvili TLC kromatogram (MF:
diklorometan/metanol=20/1) in na ploščico nanesli izhodno spojino 6 ter reakcijsko zmes.
Pod znižanim tlakom smo uparili DMF. Preostanek smo raztopili v 30 mL etilacetata,
organsko fazo spirali z 10% citronsko kislino (2 x 20 mL), nasičeno raztopino NaHCO3 (2
x 20 mL) in nasičeno raztopino NaCl (2 x 20 mL). Organsko fazo smo sušili nad Na2SO4,
filtrirali in etilacetat uparili pod vakuumom. Produkt smo posušili na rotavaporju in očistili
s »flash« kolonsko kromatografijo ter za mobilno fazo uporabili diklorometan/metanol=9/1.
Dobili smo 423 mg spojine 8.
- 28 -
Produkt 8: (S)-N-(2-amino-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-6-il)-3,4-dikloro-5-
metil-1H-pirol-2-karboksamid
Elementna sestava C13H14N4OSCl2 Mr = 345,16
Opis bela oborina
Izkoristek 53,3%
Rf 0,36 (MF: diklorometan/metanol=9/1)
Tališče 243 °C 1H NMR
(400 MHz, DMSO-d6)
δ 1,84 – 1,89 (m, 1H, HA-7), 1,91 – 1,96 (m, 1H, HB-7),
2,19 (s, 3H, Ar-CH3), 2,56 – 2,58 (m, 3H, H-5, HA-4), 2,83
(dd, 1H, J1 = 5,2 Hz, J2 = 15,4 Hz, HB-4), 4,16 – 4,26 (m,
1H, CHNH), 6,70 (s, 2H, 2-NH2), 7,28 (d, 1H, J = 7,7 Hz,
CONH), 12,02 (s, 1H, Ar-NH) ppm
HR-MS (ESI+) 345,0341 (izračunana: 345,0344)
4.8. Sinteza (S)-N-(2-acetamido-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-
d]tiazol-6-il)-3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksamida
V 10 mL 1,4-dioksana smo raztopili izhodno spojino 8 (0,114 g; 0,33 mmol), bučko
zaprli s septumom, ohladili na ledeni kopeli za 2 minuti in jo nato odstavili. Dodali smo
trietilamin (0,0689 mL; 0,495 mmol; 0,726 g/mL) in nato še acetil klorid (0,0352 mL; 0,495
mmol; 1,104 g/mL). Mešali smo pri sobni temperaturi 3 ure oziroma dokler ni izginila lisa
izhodne spojine na TLC kromatogramu (MF: diklorometan/metanol=9/1). Pod znižanim
tlakom smo uparili 1,4-dioksan, preostanek pa raztopili v etilacetatu (15-20 mL). Organsko
fazo smo spirali z 10% citronsko kislino (2 x 10 mL), nasičeno raztopino NaHCO3 (2 x 10
mL) in nasičeno raztopino NaCl (10 mL). Sušili smo nad Na2SO4, filtrirali in etilacetat
uparili pod vakuumom. Produkt smo očistili s »flash« kolonsko kromatografijo in za
mobilno fazo uporabili diklorometan/metanol=20/1. Dobili smo 60 mg spojine 9.
- 29 -
Produkt 9: (S)-N-(2-acetamido-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-6-il)-3,4-dikloro-5-
metil-1H-pirol-2-karboksamid
Elementna sestava C15H16N4O2SCl2 Mr = 387,18
Opis bež oborina
Izkoristek 46,5%
Rf 0,12 (MF: diklorometan/metanol=20/1)
Tališče 195 °C 1H NMR
(400 MHz, DMSO-d6)
δ 1,92 – 1,97 (m, 1H, HA-7), 1,99 – 2,06 (m, 1H, HB-7),
2,11 (s, 3H, Ar-CH3), 2,19 (s, 3H, CH3CONH), 2,68 –
2,74 (m, 3H, H-5, HA-4), 3,00 (dd, 1H, J1 = 5,2 Hz, J2 =
15,9 Hz, HB-4), 4,21-4,30 (m, 1H, CHNHCO), 7,33 (d, 1H,
J = 7,8 Hz, CHNHCO), 11,92 (s, 1H, Ar-NH), 12,02 (s,
1H, 2-NHCO) ppm
HR-MS (ESI+) 387,0448 (izračunana: 387,0449)
4.9. Sinteza etil (S)-2-((6-(3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-
karboksamido)-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-2-
il)amino)-2-oksoacetata
V 15 mL 1,4-dioksana smo raztopili izhodno spojino 8 (0,211 g; 0,61 mmol), bučko
zaprli s septumom, ohladili na ledu za 2 minuti in jo nato odstavili. Dodali smo trietilamin
(0,128 mL; 0,915 mmol; 0,726 g/mL) in nato še etil oksalil klorid (0,103 mL; 0,916 mmol;
1,22 g/mL). Mešali smo pri sobni temperaturi 3 ure oziroma dokler ni izginila lisa izhodne
spojine na TLC kromatogramu (MF: diklorometan/metanol=9/1). Pod znižanim tlakom smo
uparili 1,4-dioksan, preostanek pa raztopili v etilacetatu (20 mL). Organsko fazo smo spirali
z 10% citronsko kislino (2 x 10 mL), nasičeno raztopino NaHCO3 (2 x 10 mL) in nasičeno
raztopino NaCl (10 mL). Sušili smo nad Na2SO4, filtrirali in etilacetat uparili pod
vakuumom. Dobili smo 215 mg spojine 10.
- 30 -
Produkt 10: etil (S)-2-((6-(3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksamido)-4,5,6,7-
tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-2-il)amino)-2-oksoacetat
Elementna sestava C17H18N4O4SCl2 Mr = 445,24
Opis rumena oborina
Izkoristek 79,0%
Rf 0,62 (MF: diklorometan/metanol=9/1)
Tališče 186 °C 1H NMR
(400 MHz, DMSO-d6)
δ 1,31 (t, 3H, J = 7,1 Hz, CH3CH2), 1,94 – 2,06 (m, 2H,
H-7), 2,19 (s, 3H, Ar-CH3), 2,73 – 2,79 (m, 3H, H-5, HA-4),
3,06 (dd, 1H, J1 = 5, 1Hz, J2 = 15,9 Hz, HB-4), 4,24 – 4,32
(m, 3H, CH2CH3, CHNHCO), 7,37 (d, 1H, J = 7,7 Hz,
CHNHCO), 12,02 (s, 1H, Ar-NH), 12,85 (s, 1H, 2-
NHCO) ppm
HR-MS (ESI-) 443,0357 (izračunana: 443,0348)
4.10. Sinteza (S)-2-((6-(3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-
karboksamido)-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-2-
il)amino)-2-oksoacetilne kisline
V 5 mL 96% etanola smo raztopili spojino 10 (0,157 g; 0,353 mmol), dodali natrijev
hidroksid (1,41 mL; 1,412 mmol; 1,00 mol/L) in mešali 1 uro. Razvili smo TLC
kromatogram (MF: diklorometan/metanol=20/1) in na ploščico nanesli izhodno spojino ter
reakcijsko zmes. Etanol smo uparili pod znižanim tlakom. Preostalo vodno raztopino smo
nakisali z 1 M HCl do pH 1-2, filtrirali pod znižanim tlakom in produkt dali sušit v sušilnik.
Dobili smo 122 mg spojine 11.
- 31 -
Produkt 11: (S)-2-((6-(3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksamido)-4,5,6,7-
tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-2-il)amino)-2-oksoacetilna kislina
Elementna sestava C15H14N4O4SCl2 Mr = 417,22
Opis temno rumeni kristali
Izkoristek 82,9%
Rf 0,0 (MF: diklorometan/metanol=20/1)
Tališče 215 °C 1H NMR
(400 MHz, DMSO-d6)
δ 1,92 – 2,07 (m, 2H, H-7), 2,19 (s, 3H, Ar-CH3), 2,73 –
2,79 (m, 3H, H-5, HA-4), 3,06 (dd, 1H, J1 = 4,9 Hz, J2 =
15,8 Hz, HB-4), 4,22 – 4,32 (m, 1H, CHNHCO), 7,38 (d,
1H, J = 7,7 Hz, CHNHCO), 12,04 (s, 1H, Ar-NH), 12,58
(s, 1H, 2-NHCO) ppm
HR-MS (ESI-) 415,0045 (izračunana: 415,0035)
- 32 -
5. REZULTATI IN RAZPRAVA
5.1. KOMENTAR MOLEKULSKEGA MODELIRANJA
Nove zaviralce DNA-giraze smo načrtovali s pomočjo strukturno podprtega
načrtovanja na osnovi znanih kristalnih struktur encima v kompleksu z inhibitorji.
Predvideno vezavo načrtovanih spojin smo preučevali s pomočjo sidranja ligandov v ATP-
vezavno mesto.
5.1.1. Validacija protokola za sidranje
Za validacijo smo uporabili kristalno strukturo DNA-giraze iz E. coli (PDB: 4DUH
(17)), načrtovane spojine pa sidrali tudi v DNA-girazo iz S. aureus (PDB: 3TTZ (15)). Za
sidranje smo uporabili dva različna programa – FlexX (LeadIT, BioSolveIT) in OEDocking
(OpenEye).
Za sidranje s programom OEDocking smo receptor pripravili s programom
MAKE_RECEPTOR. Za vezavno mesto pa določili kvader z merami 16,00 Å x 20,67 Å x
13,33 Å okrog inhibitorja iz kristalne strukture. Definirali smo tudi farmakoforne zahteve,
in sicer da ima potencialni inhibitor akceptor in donor vodikove vezi, ki tvorita vodikovi
vezi z aminokislinskim ostankom Asp73 in strukturno ohranjeno molekulo vode.
Pri programu FlexX smo uporabili iste zahteve za farmakofor, razlika je bila, da smo
za vezavno mesto določili aminokislinske ostanke na razdalji do 7 Å okoli inhibitorja, kar je
dalo podobno velikost določenega vezavnega mesta.
Pri sidranju sta nas zanimali predvsem dve stvari: i) ali program dobro napove pozo,
torej postavi pirolamidni del liganda v hidrofobni žep in ii) ali program za sidranje rangira
ligande po aktivnosti.
Pri vizualnem pregledu rezultatov (shema 3, slika 16) smo ugotovili, da sta oba
programa dobro napovedala vezavo pirolamidnega dela, razlika se je pojavila predvsem pri
napovedi vezave terminalnega dela.
- 33 -
Shema 3: Shematski prikaz interakcij spojine KSK 21 v ATP-vezavnem mestu na DNA-
girazi iz E. coli (vodikove vezi: rdeča; hidrofobne interakcije: zelena), kot je predvidel
program FlexX.
Slika 16: Predvidena vezava spojine KSK 21 v ATP-vezavnem mestu DNA-giraze iz E. coli,
narejena s programom FlexX (levo) in s programom OEDocking (desno) (encim: modra;
inhibitor: rumena, oranžna; vodikove vezi: črna).
Noben od programov ni izstopal v svojih napovedih (graf 1 in graf 2), vendar
opazimo, da FlexX vseeno deluje boljše, saj je med 10 najboljše rangiranimi spojinami več
močnih inhibitorjev z IC50 < 1 µM, kot pri rezultatih dobljenih s programom OEDocking.
Sta pa vseeno oba programa bila primerna za preučevanje vezave, saj sta oba dobro
napovedala smiselno pozo spojin v vezavnem mestu, ki smo jih nato tudi sintetizirali.
- 34 -
Graf 1: Prikaz pIC50 v odvisnosti od cenilne funkcije Chemgauss4 Score.
Graf 2: Prikaz pIC50 v odvisnosti od cenilne funkcije FlexX Score.
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
5,50
6,00
6,50
7,00
7,50
8,00
-13,00 -12,00 -11,00 -10,00 -9,00 -8,00 -7,00 -6,00 -5,00 -4,00
pIC50
Chemgauss4 Score
<500 nM 500 nM - 1μM 1 μM - 100 μM >100μM
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
5,50
6,00
6,50
7,00
7,50
8,00
-30,00 -27,00 -24,00 -21,00 -18,00 -15,00 -12,00 -9,00
pIC50
FlexX Score
<500 nM 500 nM - 1μM 1 μM - 100 μM >100μM
- 35 -
Če bi programa delovala idealno, bi graf moral biti linearna funkcija in izgledati kot
graf 3.
Graf 3: Idealni prikaz pIC50 v odvisnosti od cenilne funkcije Chemgauss4 Score.
Inhibitorji so s pirolamidnim delom posnemali vezavo adeninskega obroča ATP v
vezavno mesto na DNA-girazi B. Za doseganje močne inhibitorne aktivnosti morajo imeti
na pirolni obroč vezano hidrofobno skupino (npr.: halogen), ki se veže v hidrofobni žep in
posnema vezavo adeninskega obroča ATP, imeti morajo tudi donor vodikove vezi, ki
interagira s karboksilatno skupino Asp73 (na DNA-girazi iz E. coli) ter akceptor vodikove
vezi, ki tvori vodikovo vez s strukturno ohranjeno molekulo vode. Amino skupina na mestu
2 na tiazolnem obroču je pozicionirana tako, da omogoča substitucijo s funkcionalnimi
skupinami (acetilna in oksalilna skupina), kjer je karbonilni kisik akceptor vodikove vezi, ki
glede na rezultate sidranja tvori dodatno vodikovo vez z gvanidinsko skupino Arg136 (na
DNA-girazi iz E. coli). Opazili smo tudi, da so se v aktivno mesto najbolje sidrale spojine z
dikloropirolamidnim fragmentom (slika 17).
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
5,50
6,00
6,50
7,00
7,50
8,00
-13,00 -12,00 -11,00 -10,00 -9,00 -8,00 -7,00 -6,00 -5,00 -4,00
pIC50
Chemgauss4 Score
<500 nM 500 nM - 1μM 1 μM - 100 μM >100μM
- 36 -
Slika 17: Shematski prikaz interakcij (vodikove vezi: rdeča; hidrofobne interakcije: zelena)
(levo) in predvidena vezava spojine 11 v ATP-vezavnem mestu DNA-giraze iz E. coli
(encim: modra; inhibitor: rumena; vodikove vezi: črna) (desno).
5.2. KOMENTAR SINTEZNIH POSTOPKOV
5.2.1. Sinteza 3,4-dikloro-5-metil-1H-pirol-2-karboksilne kisline
Prva sintezna stopnja, ki smo jo izvedli, je bila Wolff-Kishnerjeva redukcija. To je
reakcija s hidrazinom, ki v bazičnem mediju reducira aldehide v alkane. Redukcija se prične
s kondenzacijo karbonilne skupine aldehida in hidrazina, pri čemer dobimo hidrazon, le-ta
pa ob prisotnosti močne baze (KOH) v topilu etilenglikol po eliminaciji plinastega dušika
tvori karbanionski intermediat, ki se nato protonira s pomočjo topila do reduciranega
produkta 1 (shema 4). (26)
Shema 4: Wolff-Kishnerjeva redukcija aldehida do alkana. (prirejeno po 26)
- 37 -
Druga sintezna stopnja je bila elektrofilna aromatska substitucija s
trikloroacetilkloridom v tetrahidrofuranu. V reakciji nastaja klorovodikova kislina, zato smo
uporabili trietilamin, ki nevtralizira klorovodikovo kislino, pri izolaciji pa natrijev
hidrogenkarbonat, ki hidrolizira nezreagiran kislinski klorid in hkrati nevtralizira pri tem
nastalo klorovodikovo kislino (shema 5).
Shema 5: Mehanizem elektrofilne aromatske substitucije. (prirejeno po 27)
Pri tretji reakciji smo najprej z redoks reakcijo pripravili natrijev alkoksid (shema 6).
Natrijev etoksid uvrščamo med močne baze, kot nukleofil pa sodeluje v nukleofilnih
substitucijah, kar smo tudi izkoristili pri naši sintezi etilnega estra 3 (shema 7).
Shema 6: Mehanizem redoks reakcije. (prirejeno po 24)
Shema 7: Nastanek estra. (prirejeno po 28)
Kloriranje smo izvedli s sulfuril kloridom, s katerim smo želeli dobiti samo
trikloriran produkt 4 in ne mešanice mono-, di- in trikloriranega. Zato smo morali pred vsako
izolacijo razviti TLC kromatogram, s katerim smo preverili prisotnost tudi ostalih neželenih
stranskih produktov reakcije oziroma prisotnost le trikloriranega produkta (slika 18).
- 38 -
Slika 18: Možni produkti kloriranja.
Dobljeni alkilklorid 4 smo s katalitskim hidrogeniranjem nato reducirali do alkana 5.
Reakcija poteka v vodikovi atmosferi, zato smo najprej morali iz reakcijske zmesi odstraniti
zrak. To smo naredili tako, da smo jo prepihali z argonom, nato pa smo argon izpodrinili z
vodikom. Za katalizator smo uporabili t.i. skeletni katalizator (paladij na ogljiku), ki ima
veliko število por, kar pomeni, da je specifična površina, kamor se adsorbira vodik, velika.
V zadnji, šesti sintezni stopnji pa smo z alkalno hidrolizo estra 5 pripravili natrijevo
sol spojine 6. Z nakisanjem s 37% HCl smo sol pretvorili v ustrezno kislino in dobili spojino
6 (shema 8).
Shema 8: Mehanizem alkalne hidrolize. (prirejeno po 29)
5.2.2. Sinteza končnih spojin
Sinteza spojine 8 je potekla z N-aciliranjem iz amina in kisline (spojina 6) ob
prisotnosti sklopitvenega reagenta HATU, ki je zelo specifičen sklopitveni reagent in
poskrbi za aktivacijo kisline. N-etildiizopropilamin imenovan tudi Hüningova baza, je šibek
nukleofil in v reakciji zagotavlja bazične pogoje.
N-aciliranje lahko poteka tudi preko kislinskega klorida z aminom v bazičnih
pogojih. Spojini 9 in 10 smo pridobili z enakim postopkom – N-aciliranje (shema 9).
Trietilamin deluje kot baza, ki nevtralizira sproščeno HCl, ki je stranski produkt te reakcije,
in na ta način preprečuje pretvorbo amina v nereaktivno HCl sol.
- 39 -
Shema 9: N-aciliranje: kislinski klorid + amin + baza amid. (prirejeno po 29)
R1 = CH3 in CH3CH2O
R2 = (S)-N-(2-amino-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-6-il)-3,4-dikloro-5-metil-1H-
pirol-2-karboksamid (spojina 8)
Spojino 11 pa smo pridobili z alkalno hidrolizo estra 10, tako kot spojino 6 (shema
8).
5.3. KOMENTAR BIOLOŠKIH TESTIRANJ
5.3.1. Encimski testi
Jakost inhibitorja izrazimo z rezidualno aktivnostjo (RA). Le-ta predstavlja razmerje
med aktivnostjo encima ob dodatku spojine in v njeni odsotnosti. Odstotek inhibicije encima
izračunamo po formuli 100% - RA. Rezidualno aktivnost encima smo določali pri dveh
koncentracijah inhibitorja, in sicer pri 100 µM in 10 µM. Spojinam z RA < 50% pri 100 µM
smo določili tudi srednjo zaviralno koncentracijo (IC50), t.j. koncentracija inhibitorja, ki
povzroči 50% inhibicijo encima.
Vsem spojinam je bila določena rezidualna aktivnost na DNA-girazi iz bakterije E.
coli. Bolj obetavnim spojinam (IC50 pod 50 µM) pa smo določili tudi zaviralno aktivnost na
DNA-girazi iz bakterije S. aureus in na topoizomerazi IV iz bakterij E. coli in S. aureus
(preglednica II). Rezultati so predstavljeni kot IC50 za aktivne spojine (RA < 50% pri 100
µM). Za primerjavo smo imeli predhodno ovrednotene spojine KSK 16, 21, 25, 74, THT
10, 11, 21 in TJL 19
- 40 -
Preglednica II: Srednje zaviralne koncentracije spojin na izoliranih encimih DNA-giraze in
topoizomeraze IV iz bakterij E. coli in S. aureus. Vse spojine imajo skupen osrednji (S)-N-
(2-amino-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-6-il)-2-karboksamidni del.
8-11, KSK 16, 21, 25, 74, THT 10, 11, 21, TJL 19
OZNAKA
SPOJINE
STRUKTURA
SPOJINE E. coli
DNA-
giraza
IC50
[μM]
S.
aureus
DNA-
giraza
IC50
[μM]
E. coli
topoIV
IC50
[μM]
S.
aureus
topoIV
IC50
[μM]
R1
R2
8
H
RA (100 μM) = 30%
/
/
/
9
0,48
n.a.
n.a.
n.a.
10
0,23
0,71
n.a.
n.a.
11
0,025
0,43
209 RA (100
μM) =
-28%
KSK 16
0,10 80 RA (100
μM) =
53%
180
KSK 21
0,058 120 200 77
KSK 25
0,40 320 300 290
- 41 -
KSK 74
H
12 n.a. n.a. n.a.
THT 10
11 n.a. n.a. n.a.
THT 11
7,7 n.a. n.a. n.a.
THT 21
0,59 300 n.a. 170
TJL 19
0,022 0,56 RA (100 μM) =
43%
RA (100 μM) =
20%
n.a. = neaktivna spojina
/ = ni bilo testirano
Spojina 8 ima rezidualno aktivnost pri koncentraciji inhibitorja 100 μM 30% in je
primerljiva z ostalimi nesubstituiranimi inhibitorji na končni aminski skupini. Spojina KSK
74, ki ima namesto dveh klorov na pirolnem obroču dva broma, ima vrednost IC50 12 µM.
Za močnejšo, nanomolarno, encimsko inhibitorno aktivnost je torej potrebna substituirana
končna aminska skupina.
Že v naslednji sintezi, ko smo končno aminsko skupino acetilirali in s tem dobili
spojino 9, se je močno izboljšala aktivnost, in sicer za več kot 160-krat (IC50 = 0,48 µM na
DNA-girazi iz E. coli). Predvidevamo, da je to zaradi karbonilnega kisika v acetilni skupini,
ki omogoča tvorbo dodatne vodikove vezi v ATP-vezavnem žepu DNA-giraze iz E. coli. Na
vseh ostalih izoliranih encimih je spojina 9 neaktivna.
Acetilno skupino smo nato zamenjali še z oksalilnim substituentom in ugotovili, da
spojina 10 izkazuje dvakrat močnejšo inhibicijo kot spojina 9 (IC50 = 0,23 µM na DNA-
girazi iz E. coli). Inhibira tudi DNA-girazo iz bakterije S. aureus, medtem ko ni izkazovala
inhibicije topoizomeraze IV iz obeh bakterij. V primerjavi s spojinami drugih raziskovalcev,
ki so prav tako imele oksalilni fragment, ampak so se razlikovale v pirolnem delu, izkazuje
spojina 10 močnejšo inhibitorno aktivnost. THT 10 ima namesto pirola indol in je njena
- 42 -
vrednost IC50 na DNA-girazi iz E. coli 11 µM, na vseh ostalih testiranih encimih pa je spojina
neaktivna. KSK 25 ima 4,5-dikloropirolni fragment brez metilne skupine (IC50 0,40 µM na
DNA-girazi iz E. coli, na DNA-girazi iz S. aureus pa ima bistveno slabše rezultate kot
spojina 10), KSK 16 z 4,5-dibromopirolnim fragmentom ima IC50 0,10 µM na DNA-girazi
iz E. coli, medtem ko ima slabši IC50 v primerjavi s spojino 10 na DNA-girazi iz S. aureus.
Iz kristalnih struktur encimov vemo, da je vezavni žep za pirolamidni fragment ATP-
vezavnega mesta na DNA-girazi iz S. aureus manjši kot na DNA-girazi iz E. coli. Zato se
pri izbiri substituentov na pirolnem obroču pojavijo razlike, saj je 4,5-dibromopirolni obroč
(spojina KSK 16) predvidoma prevelik za vezavo v ATP-vezavno mesto na DNA-girazi iz
S. aureus in je bolj ustrezen 3,4-dikloro-5-metilpirolni fragment, ki ga imajo tudi vse naše
končne spojine.
Z alkalno hidrolizo estra do kislinskega derivata se nam inhibitorna aktivnost še
izboljša. Dosežemo nanomolarno območje z IC50 vrednostjo 0,025 µM na DNA-girazi iz E.
coli, prav tako je spojina 11 aktivna na vseh ostalih testiranih encimih. Njena inhibitorna
aktivnosti je izredno dobra v primerjavi s spojinami drugih raziskovalcev, ki so prav tako
kislinski derivati.
Že prej smo ugotovili, da je za vezavo v ATP-vezavno mesto bolj primeren pirolni
obroč s substituenti in to ugotovitev še dodatno potrdimo s primerjavo spojine 11 in THT
11, ki ima namesto pirola indol in je njena vrednost IC50 7,7 µM na DNA-girazi iz E. coli,
na vseh ostalih encimih pa je neaktivna. KSK 21 ima 4,5-dibromopirolni fragment in
vrednost IC50 0,058 µM na DNA-girazi iz E. coli ter tudi na ostalih encimih ima slabšo
aktivnost od spojine 11. THT 21 pa se od spojine 11 razlikuje v odsotnosti metilne skupine
na mestu 5 pirola in 4,5-dikloropirolnem fragmentu z IC50 0,59 µM na DNA-girazi iz E. coli.
Pomembno vlogo imajo substituenti na pirolamidnem delu, saj vplivajo na hidrofobnost
inhibitorja. Pomembna je torej metilna skupina, ki tvori dodatne hidrofobne interakcije v
hidrofobnem žepu ATP-vezavnega mesta encima in kloridna atoma na pirolu na mestih 3 in
4, saj je drugače encimska aktivnost zelo slaba ali pa je celo ni. Imata pa esterski in kislinski
derivat primerljivi aktivnosti. To nakazuje, da obe tvorita vodikovo vez z gvanidinsko
skupino Arg136.
Če je namesto oksalilnega prisoten malonilni fragment kot pri spojini TJL 19 (IC50
= 0,022 µM na DNA-girazi iz E. coli), opazimo, da je v primeru oksalila boljša inhibitorna
aktivnost. Predvidevamo lahko, da metilenski most zmanjša inhibicijo in so boljše spojine z
oksalilnim substituentom.
- 43 -
5.3.2. Protibakterijska aktivnost
Protibakterijsko aktivnost smo ugotavljali na klinično nadzorovanih sevih po Gramu
pozitivnih bakterij S. auerus in E. faecalis ter po Gramu negativnih bakterij E. coli in P.
aeruginosa.
Preglednica III: % inhibicije rasti na bakterijskih sevih S. auerus, E. faecalis, E. coli in P.
aeruginosa pri spojinah 8, 9, 10, 11 po 24 urah. Vse spojine imajo skupen osrednji (S)-N-(2-
amino-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazol-6-il)-2-karboksamidni del.
8-11
OZNAKA
SPOJINE
STUKTURA SPOJINE
E.
faecalis
(ATCC
29212)
S.
auerus
(ATCC
25923)
E. coli
(ATCC
25922)
P.
aeruginosa
(ATCC
27853) R1 R2
8
H
46
57
6
16
9
6
15
6
-12
10
16
30
8
-16
11
7
25
8
5
% inhibicije rasti na različnih bakterijskih sevih smo določali po 4 urah, 8 urah in 24
urah. Za pozitivno kontrolo smo imeli fluorokinolon ciprofloksacin.
- 44 -
V preglednici III so predstavljeni rezultati protibakterijske aktivnosti po 24 urah, saj
je takrat prisotna največja koncentracija bakterij in najnižja koncentracija inhibitorja.
Zaviralci DNA-giraze morajo v dovolj visokih koncentracijah preiti hidrofobno
citoplazemsko membrano in peptidoglikan, pri po Gramu negativnih bakterijah pa tudi
zunanjo membrano, da izkažejo učinek. Problem nastane pri fizikalno-kemijskih lastnostih,
npr. prevelika polarnost spojin je odgovorna za slabo permeabilnost skozi celično steno.
Čeprav ima spojina 11 najboljšo inhibitorno aktivnost na vseh izoliranih encimih, je njena
protibakterijska aktivnost zelo slaba, saj je najverjetneje spojina preveč kisla, da bi prišla v
celico. Problem pri po Gramu negativnih bakterijah so tudi izlivne črpalke, ki aktivno črpajo
ksenobiotike ven iz celice. Literaturni podatki kažejo, da je za zadostno protibakterijsko
aktivnost na po Gramu negativnih bakterijah najbrž potrebna subnanomolarna inhibitorna
aktivnost.
Opazimo, da spojini 10 in 11, ki imata oksalni del, nimata protibakterijske aktivnosti,
čeprav sta na izoliranih encimih pokazali največjo aktivnost.
Samo spojina 8 je po 24 urah dosegla več kot 50% inhibicijo na bakterijskem sevu S.
aureus (ATCC 25923), zato smo za to spojino določili še minimalno inhibitorno
koncentracijo (MIC) in minimalno baktericidno koncentracijo (MBC) pri dveh po Gramu
pozitivnih bakterijah – E. faecalis in S. auerus. Vrednost MIC je najnižja koncentracija
inhibitorja, ki zavre rast vsaj 90% mikroorganizmov, vrednost MBC pa je najnižja
koncentracija inhibitorja, ki ubije vsaj 99,9% mikroorganizmov. Rezultati so predstavljeni v
preglednici IV in preglednici V.
- 45 -
Preglednica IV: Vrednosti MIC spojine 8 na bakterijskih sevih po Gramu pozitivnih bakterij
E. faecalis in S. aureus po 4 urah, 8 urah in 24 urah.
OZNAKA
SPOJINE
STRUKTURA
E. faecalis
(ATCC 29212)
[μM]
S. aureus
(ATCC 25923)
[μM]
R1 R2 4h 8h 24h 4h 8h 24h
8
H
>125
>125
>125
125
>125
>125
Preglednica V: Vrednosti MBC spojine 8 na bakterijskih sevih po Gramu pozitivnih bakterij
E. faecalis in S. aureus.
OZNAKA
SPOJINE
STRUKTURA E. faecalis
(ATCC 29212)
[μM]
S. aureus
(ATCC 25923)
[μM]
R1
R2
8
H
n.d.
>125
n.d. – ni določena
Za pozitivno kontrolo smo imeli fluorokinolon ciprofloksacin (MIC90 (E. faecalis) =
3,02 μM, MIC90 (S. aureus) = 1,51 μM) . Vrednost MIC spojine 8 pri E. faecalis je bila
vedno večja od 125 μM, zato niti nismo določali MBC pri tem bakterijskem sevu. Pri S.
aureus pa je bila vrednost MIC pri 4 urah 125 μM, pri ostalih časovnih mejnikih pa večja od
125 μM. Prav tako so bile vrednosti MBC pri S. aureus večje od 125 μM.
- 46 -
6. SKLEP
V okviru magistrske naloge smo načrtovali in sintetizirali nove pirolamidne zaviralce
DNA-giraze B iz bakterij E. coli in S. aureus. Vse spojine so imele skupen 4,5,6,7-
tetrahidrobenzo[1,2-d]tiazolni osrednji del. Pri sintezi smo želeli z uvedbo različnih
substituentov izboljšati inhibicijo DNA-giraze iz S. aureus in s tem izboljšati njihovo
protibakterijsko aktivnost.
Vse končne spojine (8-11) smo biološko ovrednotili na izolirani DNA-girazi in
topoizomerazi IV iz bakterij E. coli in S. aureus, prav tako so bile te spojine testirane na
klinično nadzorovanih sevih bakterij S. aureus, E. faecalis, E. coli in P. aeruginosa. Z
uvedbo oksalilnega substituenta na 2-amino skupini osrednjega skeleta smo dosegli
izboljšano inhibicijo DNA-giraze iz S. aureus, še posebej spojina 11 ima v primerjavi s
svojim estrskim derivatom (spojina 10) boljšo inhibitorno aktivnost na vseh izoliranih
encimih. Prav tako imajo naše spojine bistveno boljšo inhibitorno aktivnost v primerjavi s
spojinami drugih raziskovalcev, ki so vključevale drugače substituirane pirole ali indole. To
potrdi ugotovitev iz literature, da je ATP-vezavno mesto DNA-giraze iz S. aureus manjše,
kot DNA-giraze iz E. coli in so zato bolj primerne spojine z dikloro fragmentom na mestih
3 in 4, metilna skupina na mestu 5 na pirolu pa poskrbi za dodatne hidrofobne interakcije v
hidrofobnem žepu vezavnega mesta.
Po testiranju na izbranih sevih bakterij pa smo opazili, da najbolj obetavni spojini 10
in 11 nista imeli protibakterijske aktivnosti. Verjetno spojini nimata optimalnih fizikalno-
kemijskih lastnosti, da bi prešli bakterijsko celično steno ali pa sta njuni inhibitorni
aktivnosti vseeno prešibki, da bi dosegli delovanje na bakterijah.
Lahko načrtujemo spojino, ki se odlično prilega vezavnemu mestu encima, ampak če
spojina ne doseže svoje tarče, potem taka spojina ne bo izkazovala zadostnega
protibakterijskega delovanja, da bi bila primerna za nadaljnji razvoj. Zato bi za nadaljnje
raziskovanje bilo zanimivo, če bi s spremembo fizikalno-kemijskih lastnosti (topnost,
hidrofobnost) dosegli lažje prehajanje celične stene bakterij in s tem izboljšali tudi
protibakterijsko aktivnost novih zaviralcev DNA-giraze tega strukturnega tipa.
- 47 -
7. LITERATURA
(1) M. Kržan, Inštitut za farmakologijo in eksperimentalno toksikologijo, Medicinska
fakulteta, Univerza v Ljubljani: http://www.mf.uni-lj.si/media-library/2013/12/040baaad
3d3fb7abfd5c15cb3ae56b83.pdf (dostopano: 17. 12. 2015)
(2) Aminov R. I.: A brief history of the antibiotic era: Lessons learned and challenges
fort he future. Front microbiol 2010, Vol. 1, 134: 1-7.
(3) Gubina M., Ihan A.: Medicinska bakteriologija z imunologijo in mikologijo,
Medicinski razgledi, Ljubljana, 2002: 3-15, 427-446, 503-515.
(4) Lemke T.L., Williams D.A.: Foye's principles of medicinal chemistry, 5. izdaja,
Lippincott Williams&Wilkins, Philadelphia, 2002: 819-864.
(5) Rang H. P., Dale M. M., Ritter J. M., Flower R. J., Henderson G.: Rang and Dale's
Pharmacology, 7. izdaja, Churchill Livingstone, Elsevier, 2012: 609-637.
(6) Madigan M.T., Martinko J.M., Parker J.: Brock biology of microorganisms, 9. izdaja,
Prentice Hall, Upper Saddle River, New Jersey, 2000: 68-75, 721-723.
(7) Patrick G.: An Introduction to Medicinal Chemistry, 3. izdaja, Oxford university
press, New York, 2005: 117-121, 163-219, 326-357, 379-439.
(8) Bbosa G. S., Mwezaba N., Odda J., Kyegombe D. B., Ntale M.:
Antibiotics/antibacterial drug use, their marketing and promotion during the post-antibiotic
golden age and their role in emergence of bacterial resistance. Health 2014, Vol. 6, No. 5:
410-425.
(9) Tomašič T., Katsamakas S., Hodnik Ž., Ilaš J., Brvar M., Solmajer T., Montalvão S.,
Tammela P., Banjanac M., Ergović G., Anderluh M., Peterlin Mašič L., Kikelj D.: Discovery
of 4,5,6,7-tetrahydrobenzo[1,2-d]thiazoles as novel DNA gyrase inhibitors targeting the
ATP-binding site. J Med Chem 2015, 58: 5501-5521.
(10) http://micro.digitalproteus.com/agents.php (dostopano: 11.1.2016)
(11) http://www.easynotecards.com/notecard_set/15094 (dostopano: 11.1.2016)
(12) Boyer R. F.: Temelji biokemije, Študentska založba, Ljubljana, 2005: 244-257
(13) Staveley B., Department of Biology, Memorial University of Newfoundland,
Kanada: http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-18/CB18.html
(dostopano: 17.12.2015)
(14) Tomašič T, Peterlin Mašič L: Prospects for developing new antibacterials targeting
bacterial type IIA topoisomerases. Curr Top Med Chem 2014, Vol. 14, No. 1: 130-151.
- 48 -
(15) Sherer B. A., Hull K., Green O., Basarab G., Hauck S., Hill P., Loch III J. T., Mullen
G., Bist S., Bryant J., Boriack-Sjodin A., Read J., DeGrace N., Uria-Nickelsen M.,
Illingworth R. N., Eakin A. E.: Pyrrolamide DNA gyrase inhibitors: Optimization of
antibacterial activity and efficacy. Bioorg Med Chem Lett 2011, 21: 7416-7420.
(16) Oblak M., Kotnik M., Solmajer T.: Discovery and development of ATPase inhibitors
of DNA gyrase as antibacterial agents. Curr Med Chem 2007, Vol. 14, No. 19: 2033-2047.
(17) Brvar M., Perdih A., Renko M., Anderluh G., Turk D., Solmajer T.: Structure-based
discovery of substituted 4,5'-bithiazoles as novel DNA gyrase inhibitors. J Med Chem 2012,
55: 6413-6426.
(18) Bisacchi G. S., Manchester J. I.: A new-class antibacterial-almost. Lessons in drug
discovery and development: A critical analysis of more than 50 years of effort toward
ATPase inhibitors of DNA gyrase and topoisomerase IV. ACS Infect Dis 2015, 1: 4-41.
(19) http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs194/en/ (dostopano: 22.12.2015)
(20) http://www.reactgroup.org/toolbox/category/understand/the-rise-and-spread-of-
antibiotic-resistance/resistance-mechanisms-in-bacteria/ (dostopano: 8.1.2016)
(21) Ronkin S. M., Badia M., Bellon S., Grillot A-L., Gross C. H., Grossman T. H., Mani
N., Parsons J. D., Stamos D., Trudeau M., Wei Y., Charifson P. S.: Discovery of
pyrazolthiazoles as novel and potent inhibitors of bacterial gyrase. Bioorg Med Chem Lett
2010, 20: 2828-2831.
(22) Eakin A. E., Green O., Hales N., Walkup G. K., Bist S., Singh A., Mullen G., Bryant
J., Embrey K., Gao N., Breeze A., Timms D., Andrews B., Uria-Nickelsen M., Demeritt J.,
Loch III J. T., Hull K., Blodgett A., Illingworth R. N., Prince B., Boriack-Sjodin P. A., Hauck
S., MacPherson L. J., Ni H., Sherer B.: Pyrrolamide DNA gyrase inhibitors: Fragment-based
nuclear magnetic resonance screening to identify antibacterial agents. Antimicrob Agents
Ch 2012, Vol. 56, No. 3: 1240-1246.
(23) Walters W. P., Stahl M. T., Murcko M. A.: Virtual screening – an overview. Drug
Discov Today 1998, Vol. 3, No. 4: 160-178.
(24) Anderluh M., Mravljak J., Perdih A., Sova M., Pečar S.: Farmacevtska kemija III:
Vaje in seminarji, Fakulteta za farmacijo, Ljubljana, 2010.
(25) Kitchen D. B., Decornez H., Furr J. R., Bajorath J.: Docking and scoring in virtual
screening for drug discovery: Methods and applications. Nat rev drug discov 2004, Vol. 3:
935-949.
- 49 -
(26) http://www.chem.ucla.edu/harding/IGOC/W/wolff_kishner_reduction.html
(dostopano: 19.1.2016)
(27) Smith M. B., March J.: March's advanced organic chemistry: Reactions, mechanisms
and structure, 7. izdaja, John Wiley & Sons, New Jersey, 2007: 569-575.
(28) http://www.organic-chemistry.org/namedreactions/nucleophilic-substitution-sn1-
sn2.shtm (dostopano: 19.1.2016)
(29) http://www.slideshare.net/Oatsmith/21-2-part-2-reactions-of-carboxylic-acid-
derivatives-wade-7th (dostopano: 19.1.2016)
Recommended