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UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
GABRIELA MANZI MORAES
IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR BASEADA NO SEQUENCIAMENTO DE rDNA DE
FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS À Pentacalia desiderabilis (VELL.) CUATREC.
(ASTERACEAE) PRESENTE EM CAMPOS DO JORDÃO (SÃO PAULO, BRASIL)
São Paulo
2017
GABRIELA MANZI MORAES
IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR BASEADA NO SEQUENCIAMENTO DE rDNA DE
FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS À Pentacalia desiderabilis (VELL.) CUATREC.
(ASTERACEAE) PRESENTE EM CAMPOS DO JORDÃO (SÃO PAULO, BRASIL)
Trabalho de Conclusão de Curso
apresentado à Universidade Presbiteriana
Mackenzie como requisito à obtenção do
grau de Bacharelado em Ciências
Biológicas.
ORIENTADORA: Profa. Dra. Ana Paula Pimentel Costa
São Paulo
2017
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus pais, Ednéia e Pedro, ao meu irmão e outros familiares por
todo suporte, carinho e alegria ao longo desta jornada. Pelos momentos que
demonstraram preocupação e interesse na área em que escolhi. Vocês são a minha
força.
Agradeço especialmente a minha querida orientadora, professora Ana Paula, por
toda a orientação, paciência, ensinamentos e oportunidades que me ofereceu durante a
faculdade, não consigo imaginar minha formação sem seu envolvimento. Agradeço
também por todos os momentos de risadas, histórias e desabafos. Obrigada pela
confiança.
Aos companheiros de laboratório Giovanna, Marina e Gustavo por toda a ajuda
que me deram neste projeto. Sentirei falta das risadas, desabafos, histórias e besteiras
que aconteceram. Obrigada por sempre alegrarem meus dias.
Aos colegas Anna, Camilla, Lucas e Luis pela ajuda neste trabalho. E, só para
ressaltar, fungos são lindos sim.
Aos meus amigos da faculdade e de fora da faculdade, não citarei nomes para
não correr o risco de esquecer alguém. Obrigada pelo suporte e por estarem sempre
presentes na minha vida. Não consigo imaginar como seriam meus dias sem vocês.
Aos professores Eder, Marcelo e Oriana que estiveram relacionados a este
trabalho, mesmo que de longe. Obrigada por tudo.
Aos professores da minha antiga escola e aos do Mackenzie. Vocês são os
principais componentes da base fundamental para a realização deste trabalho.
Obrigada por todos os ensinamentos.
À Universidade Presbiteriana Mackenzie por fornecer estrutura e oportunidades
para uma formação de qualidade.
Ao PIBIC Mackenzie, pelo apoio financeiro para a realização deste trabalho.
Aos técnicos de laboratório da Piauí. Obrigada pelos ensinamentos e pelas
risadas.
Aos estagiários por toda a ajuda na elaboração do projeto.
RESUMO
Fungos endofíticos são organismos simbiontes que vivem no interior de plantas,
localizando-se principalmente nos tecidos, folhas e flores da planta hospedeira sem
causar danos ao vegetal. Foram encontrados fungos endofíticos em todas as plantas
analisadas até hoje e são considerados uma possível fonte de compostos bioativos e
estruturas moleculares. Podem ser empregados como fontes de metabólitos primários e
secundários de interesse e também como vetores para inserção de genes úteis nas
plantas. Neste caso, podem ser empregados como agentes inibidores de pragas e
patógenos. Esses seres também podem ser manipulados para fornecer toxinas, fatores
de crescimento, antibióticos e outros produtos de interesse biotecnológico. Neste
trabalho, foi estudada a diversidade de fungos endofíticos associados às folhas do
vegetal Pentacalia desiderabilis (Asteraceae) presente em bordas da Floresta Ambrófila
Mista de áreas remanescentes do domínio Mata Atlântica no estado de São Paulo. Ao
todo, foram analisados 29 diferentes fungos isolados e todos foram identificados
através do sequenciamento das regiões ITS1 e ITS4 do rDNA. Os isolados obtidos
pertencem aos gêneros Diaporthe, Pestalotiopsis, Colletotrichum, Epicoccum,
Ophioceras, Phaeosphaeria, Paraphaeosphaeria. Todos os isolados pertencem ao Filo
Ascomycota. O gênero Diaporthe estava presente com maior frequência, sendo as
espécies Diaporthe phaseolorum e Diaporthe passiflorae as mais dominantes. Dentre
as espécies identificadas, algumas foram descritas por apresentarem interessantes
compostos bioativos. Em geral, os fungos obtidos neste estudo apresentam atividades
antifúngica, citotóxica, antibacteriana, anti-inflamatória, antioxidante e antitumorais. E.
nigrum, por exemplo, além de apresentar essas atividades, possui capacidade
antirretroviral, inibir protease e telomerase e é capaz de produzir um composto
fluorescente epicocconona e diversos pigmentos. Já C. gloeosporioides apresenta
também atividade antidepressiva. E Pestalotiopsis apresenta possível capacidade de
biodegradação. Os resultados obtidos indicam que P. desiderabilis possui uma
intrigante e única comunidade natural de fungos endofíticos que podem ser formadores
de compostos bioativos vantajosos à indústria, agricultura e medicina e também
produtores de compostos inéditos com diferenciadas utilidades.
Palavras-chave: Fungo endofítico. Pentacalia desiderabilis. Asteracea. Biologia
molecular. Sequenciamento genético. Ascomycota.
ABSTRACT
Endophytic fungi are symbiotic organisms that live inside plants, being located mainly in
the tissues, leaves and flowers of the host plant without causing damage to the
vegetable. Endophytic fungi were found in all plants analyzed to date and are
considered a source of bioactive compounds and molecular structures. They can be
used as sources of primary and secondary metabolites of interest and also as vectors
for insertion of genes useful in plants. In this case, they may be employed as pest and
pathogen inhibiting agents. These organisms can also be manipulated to provide toxins,
growth factors, antibiotics and other products of biotechnological interest. In the present
work, was investigated the diversity of endophytic fungi associated with the leafs of the
specie Pentacalia desiderabilis (Asteraceae) present in Mixed Ombrophilous forest
edges of remnant areas of the Atlantic Forest domain in São Paulo. In all, 29 different
fungis isolates were analyzed and all were identified through the sequencing of the ITS1
and ITS4 regions of rDNA. The isolates obtained belong to the genus Diaporthe,
Pestalotiopsis, Colletotrichum, Epicoccum, Ophioceras, Phaeosphaeria,
Paraphaeosphaeria. All fungi sequenced belong to the division Ascomycota. The genus
Diaporthe was present more frequently, being the species Diaporthe phaseolorum and
Diaporthe passiflorae the most dominant. Among the species identified, some were
described as interesting bioactive compounds. In general, the fungi obtained in this
study present antifungal, cytotoxic, antibacterial, anti-inflammatory, antioxidant and
antitumoral activities. E. nigrum, for example, besides presenting these activities, has
antiretroviral capacity, inhibits protease and telomerase and can produces a
fluorescence epicoconone compound and several pigments. C. gloeosporioides also has
antidepressant activity. And Pestalotiopsis presents a possible biodegradation activity.
The results indicate that P. desiderabilis has an intriguing and unique natural community
of endophytic fungi that can be useful bioactive compounders for industry, agriculture
and medicine and also producers of unpublished compounds with different utilities.
Keywords: Endophytic fungi. Pentacalia desiderabilis. Asteracea. Molecular biology.
Genetic sequencing. Ascomycota.
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
BD líquido Batata Dextrose Broth
BDA Batata Dextrose Ágar
BLAST Basic Local Alignmente Search Tool
BLASTn Nucleotide BLAST
CTAB Brometo de cetil trimetilamonio
DNA Ácido desoxirribonucleico
EDTA Ácido etilenodiamino terra-acético
g Força g – força gravitacional
HCl Ácido clorídrico
ITS Internal transcribed spacer
ng Nanograma
M Molar
mg Miligrama
MgCl2 Cloreto de magnésio
mL Mililitro
pb Pares de bases
PCR Reação em cadeia da polimerase
pm Picomol
rDNA Ácido desoxirribonucleico ribossomal
RNA Ácido ribonucleico
SDS Sódio dodecil sulfato
Tris-HCl Trishidroximetilaminometano
μl Microlitro
% Porcentagem
ºC Graus Celsius
λ Lambda
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 9
2. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 14
2.1 CULTIVO DOS FUNGOS ........................................................................................ 14
2.2 EXTRAÇÃO DO DNA.............................................................................................. 15
2.3 REAÇÃO DE PCR .................................................................................................. 16
2.4 PURIFICAÇÃO, QUANTIFICAÇÃO E SEQUENCIAMENTO DAS SEQUÊNCIAS DE
DNA .............................................................................................................................. 17
2.5 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS DE DNA .................................................................. 17
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 20
4. CONCLUSÃO/CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................. 41
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 43
9
1. INTRODUÇÃO
Microrganismos endofíticos são organismos que habitam o interior de plantas,
encontrando-se principalmente nos tecidos, folhas e flores do vegetal, sem prejudicar
seu hospedeiro. Esses seres vivos podem ser tanto fungos como bactérias e insetos
(FELBER; PAMPHILE, 2013). Os endófitos são surpreendentemente úteis na
agricultura e na indústria, especialmente na alimentícia e farmacêutica. Podem ser
aplicados como fontes de metabólitos primários e secundários de interesse e também
como vetores para inserção de genes de interesse nas plantas, podendo ser
empregados como agentes inibidores de pragas e patógenos (SOUZA et al., 2004).
Como resultado, a possibilidade de descobrir novos microrganismos e estes serem
formadores de compostos bioativos vantajosos à indústria, agricultura e medicina vem
aumentando a quantidade de pesquisas sobre microrganismos endofíticos.
Os fungos são os principais decompositores da biosfera e atualmente estão
separados em seis grupos do Reino Fungi: Microsporidia, Quitrídios, Zigomicetos,
Glomeromycota, Ascomycota e Basidiomycota (RAVEN; EVERT; EICHHORN, 2014).
Fungos endofíticos já foram avistados em todas as plantas até agora estudadas,
podem ser fontes de inovadores compostos bioativos e estruturas moleculares, assim
como são muito numerosos em vegetais de regiões tropicais e subtropicais. Estão
distribuídos em vários grupos do Reino Fungi (ARAÚJO et al., 2010).
Os fungos endofíticos introduzem-se na planta pelas raízes, por aberturas
naturais como hidatódios e estômatos, por injurias de parasitas ou colheita de frutos
(AZEVEDO, 1998). Um mesmo fungo pode habitar diversas plantas, uma vez que seus
esporos podem ser conduzidos pelo vento ou por insetos de um vegetal para outro,
porém são capazes de interagir de específicas maneiras com cada hospedeiro
(FELBER; PAMPHILE, 2013). Segundo Chapla, Biasetto e Araújo (2012), nessa íntima
relação mutualística, os fungos conseguem proteção e nutrientes e minerais da planta,
ao mesmo tempo que promovem uma maior resistência, principalmente a fatores
bióticos e abióticos que podem danificar o vegetal. De acordo com Lucero et al. (2006),
a manifestação de tais resistências se deve a habilidade dos endofíticos de conseguir
modificar a genética, fisiologia e ecologia da planta. Consequentemente, apresentam
10
uma função crucial na mediação das interações planta-herbívoros, planta-patógenos e
planta-ambiente (OKI et al., 2009). Há diversos relatos de fungos micorrízicos que
apresentam relação íntima através de simbiose com diversos vegetais e também
possuem estas habilidades descritas acima (FOLLI-PEREIRA et al., 2012).
A diversidade dos endofíticos pode particularizar-se de acordo com o hospedeiro,
distribuição geográfica, idade da planta e condições em relação à sazonalidade e
ecologia da região onde ambos habitam, compreendendo também a altitude e a taxa de
precipitação do local. No vegetal, uma ou duas espécies de fungos endofíticos podem
ser dominantes em um único hospedeiro específico, enquanto os demais são
encontrados em menor quantidade (AZEVEDO, 1998; PIMENTEL et al., 2010).
Segundo Azevedo (1998), os fungos são formadores de substâncias
secundárias, sendo que algumas delas podem ser empregadas como inibidores de
herbívoros e de demais agentes causadores de injúrias. Esses seres também podem
ser manipulados para fornecer toxinas, fatores de crescimento, antibióticos e outros
fármacos e variados produtos de interesse biotecnológico. Atualmente, em torno de um
quarto de todos os produtos naturais biologicamente ativos, são fabricados a partir de
fungos (SILVA et al., 2010).
Os fungos endofíticos também podem ser importantes na produção de fármacos
anticancerígenos, uma vez que 48,6% desses medicamentos são adquiridos através de
produtos naturais desses fungos. Em outras pesquisas, concluíram-se que podem ter
propriedades antidiabéticas, imunossupressoras, citotóxicas e antivirais (CHAPLA;
BIASETTO; ARAÚJO, 2012). Segundo Araújo et al. (2010), esses fungos podem
fornecer compostos medicinais e, a partir de transferência horizontal de genes, tornar
plantas normais em plantas medicinais. São capazes também de reduzir o efeito de
poluentes ao degradar produtos tóxicos auxiliando na conservação do meio ambiente.
Considerando a vasta diversidade e abundância de espécies que constituem a
flora mundial, sabe-se que os vegetais de variados nichos ecológicos, em particular
aqueles que possuem plantas com morfologia atípica ou estratégias incomuns para sua
sobrevivência, são mais propícias para o estudo de seus endofíticos (KUSARI;
SPITELLER, 2011).
11
Estimativas indicam que há em torno de 1,5 milhão de espécies de fungos em
geral no planeta, porém apenas 100.000 destas espécies já foram identificadas
(RAVEN; EVERT; EICHHORN, 2014). Entretanto, em estudo mais recente, não foi
possível sua obtenção, revelam que este número se encontra desatualizado e que há
em torno de 5 milhões de fungos. O estudo da biologia endofítica de específicas plantas
foi pouco realizado até hoje. As chances de identificar novos microorganismos são altas
ao isolar e caracterizar estes indivíduos de plantas de variados ecossistemas,
especialmente de regiões áridas e tropicais, uma vez que são ambientes com maior
quantidade de interações entre seres vivos (CHAPLA; BIASETTO; ARAÚJO, 2012).
Deste modo, as asteráceas são vegetais que apresentam adaptações
morfológicas e fisiológicas que garantem sua sobrevivência e sucesso evolucionário.
Essas plantas possuem a capacidade de se apresentar em todos os habitats terrestres,
com exceção da Antártida (FUNK et al., 2009). A família Asteraceae pertence à ordem
Asterales, sendo esta a que representa um dos mais fundamentais grupos taxonômicos
de Eudicotiledôneas.
Uma espécie da família Asteraceae de clima tropical e que é colonizada por
fungos endofíticos é a Pentacalia desiderabilis (Vell.) Cuatrec. Se apresenta como um
arbusto com flores do raio amarelas e exclusivo de fragmentos restantes da Mata
Atlântica em estados brasileiros da região sul, sudeste e nordeste do país. Apresenta-
se em altitudes que variam de 400 a 2220 metros (TELES, 2008). De acordo com Teles
e Stehmann (2011), P. desiderabilis é uma das únicas espécies nativas do Brasil com
crescimento escandente da tribo Senecioneae, tornando-se facilmente reconhecida por
essa peculiaridade. Pode ser encontrada com flores e frutos nos meses de agosto e
setembro.
Um estudo iniciado anteriormente por Pena e colaboradores (comunicação
pessoal, 2012), tinha por objetivo a obtenção e seleção de extratos brutos provindos de
fungos endofíticos associados à espécie Pentacalia desiderabilis (Vell.) Cuatrec.
(Asteraceae). Este vegetal foi coletado em bordas da Floresta Ombrófila Mista de áreas
remanescentes do domínio Mata Atlântica no bairro de Umuarama em Campos do
Jordão, sendo um local com elevada taxa de umidade, baixas temperaturas e alta
12
altitude. Pena e colaboradores obtiveram 77 isolados de fungos endofíticos. Tais
isolados foram reunidos em 24 morfotipos, em base em suas velocidades de
crescimento (rápido, intermediário e lento) e seus aspectos (coloração do fungo e do
meio de cultura e textura do fungo) na cultura.
Este estudo foi iniciado com o isolamento destes microrganismos endofíticos
associados à Pentacalia desiderabilis, contudo é primordial o entendimento da
diversidade desta comunidade para a prospecção e realização de ensaios tendo em
vista avaliar o seu potencial na formação de compostos bioativos. A interação planta-
endofítico é de alta complexibilidade, sendo assim, a conhecimento desses padrões de
colonização apresenta-se como um fundamental modo de análise do desenvolvimento
da planta hospedeira e interfere nos compostos bioativos produzidos. Para tanto, é
essencial identificar quais são os fungos endofíticos associados à folhas de Pentacalia
desiderabilis e quantas destas espécies são dominantes nesta planta.
Na sistemática microbiana, antigamente, para realizar a identificação de algum
fungo filamentoso, tradicionalmente eram utilizadas apenas características
morfológicas, microscópicas e macroscópicas. Porém, esta metodologia nem sempre
origina dados e resultados precisos, podendo dar um falso diagnóstico e também
demanda de muito tempo e esforço. Por isso, métodos baseados na biologia molecular
estão sendo cada vez mais empregados devido sua praticidade, rapidez e alta precisão
nos resultados utilizando-se pequena quantidade de DNA, resultando na possível
identificação de espécimes em diferentes amostras ambientais e sem a necessidade de
cultivar os organismos estudados (WACULICZ-ANDRADE, 2009).
Hoje em dia, para investigar a variabilidade genética dos fungos, usa-se a
técnica de amplificação por PCR de fragmentos do DNA ribossômico (rDNA). Essa
região se encontra em locais específicos do genoma e possui a função de codificar
diferentes moléculas de RNA ribossomal. Se apresenta como um cluster gênico, que
possui o gene 18S, o gene 5,8S e o gene 28S, que não apresentam variações em sua
sequência uma vez que são intensamente conservadas por evoluir lentamente durante
as gerações (ARRUDA et al., 2003; WACULICZ-ANDRADE, 2009).
13
Dentre esses genes há regiões denominadas de regiões espaçadoras internas
(ITS), como a ITS1 e a ITS4, que apresentam alto polimorfismo por evoluir rapidamente
e, por isso, apresentam grande interesse para estudos a níveis de gênero, espécie e
populações (FUNGARO, 2000; WACULICZ-ANDRADE, 2009). O resultado final é
verificado com uma base de dados com sequências de DNA já anteriormente
identificadas. Esses marcadores possuem a capacidade de investigar o genoma não
importando o estado fisiológico dos microrganismos estudados ou o estágio de
desenvolvimento de seus tecidos e podem distinguir espécies muito parecidas (COSTA-
NETO, 2002; THOMPSON; OLIVEIRA, 2005; BRASIL, 2011).
Dentro deste contexto, o objetivo desse projeto foi analisar a diversidade dos
fungos endofíticos associada à espécie Pentacalia desiderabilis (Asteraceae) presente
em áreas de Floresta Ombrófila Mista no município de Campos do Jordão (São Paulo,
Brasil) em áreas remanescentes do domínio Mata Atlântica. Por meio da caracterização
molecular dos 77 isolados endófitos anteriormente obtidos, espera-se obter o máximo
de informações sobre cada isolado, determinando o gênero e espécie de cada isolado.
Estes dados serão importantes subsídios para a caracterização desta comunidade e a
realização de ensaios para avaliar o seu potencial na produção de compostos bioativos,
bem como para a formação de recursos humanos especializados.
14
2. MATERIAL E MÉTODOS
A espécie Pentacalia desiderabilis (Vell.) Cuatrec. (Asteraceae) foi coletada no
condomínio Umuarama, região à qual pertence à Universidade Presbiteriana
Mackenzie, encontrando-se a cerca de 1700 metros de altitude na Serra da
Mantiqueira, com as coordenadas 22 46’24”S e 45 33’45”W, no município de Campos
do Jordão, que se encontra localizados cerca de 170 quilômetros da capital paulista, na
região leste do Estado de São Paulo. A identificação da espécie foi realizada pela Profª.
Drª. Oriana Aparecida Fávero Profª. Drª. Fátima Maria Motter Magri e sua exsicata foi
depositada no Herbário Dom Bento José Pickel do Instituto Florestal SPSP 37596.
Para a realização do isolamento dos fungos endofíticos do espécime coletado,
foram aplicadas nas folhas de P. desiderabilis as metodologias empregadas por Maier
et al. (1997) e Souza et al. (2004), utilizando técnicas de desinfecção para total
remoção de fungos que não são endofíticos. Para o isolamento, o crescimento dos
microoganismos foi monitorado e repiques sucessivos foram realizados até a obtenção
de isolados totalmente puros. Posteriormente, foram preservados em “slants” (tubo de
ensaio contendo meio BDA inclinado) e água estéril.
2.1 CULTIVO DOS FUNGOS
Os fungos previamente isolados foram repicados e cultivados em meio Batata
Dextrose Ágar (BDA – Difco) em placa de Petri de 9 cm de diâmetro, em estufa a 25 ºC,
por 10 a 20 dias, dependendo da velocidade de crescimento do fungo. Em seguida,
foram analisados quanto sua morfologia, coloração e velocidade de crescimento, sendo
que os dados obtidos foram anotados em caderno adequado armazenado no próprio
laboratório. Após, foram realizadas suspensões micelianas em 5mL de meio Batata
Dextrose Broth (BD – Difco) líquido em tubos tipo falcon de 15mL, a partir de pequenos
repiques obtidos das culturas em placa. O material foi incubado em estufa a 25ºC por
15 dias completamente vedado com papel alumínio para impedir a entrada de luz.
15
2.2 EXTRAÇÃO DO DNA
A extração de DNA foi realizada conforme método descrito por Rodrigues (2010).
Após o crescimento do fungo, o micélio foi filtrado em papel filtro, lavado com água
purificada e seco em papel toalha para retirada do excesso de meio de cultura líquido e
submetido ao protocolo de extração. Para tal, foi necessário a remoção da parte antiga
do repique utilizada para crescimento em meio líquido com o auxílio de uma lâmina de
bisturi. O material restante foi armazenado em microtubos e acrescidos de 400 μl de
tampão de lise (Tris-HCL 0,05M; EDTA 0,005M; NaCl 0,1M; SDS 1%). Em seguida,
foram incubados por 15 minutos em congelador a -20ºC, ou até seu conteúdo congelar
totalmente.
Após o congelamento do material, ocorreu a trituração do micélio congelado com
o auxílio de um pistilo até provocar a homogeneização total do conteúdo. Em seguida,
foram adicionados 5 μl de Proteinase K (50 μg/mL), seguida de homogeneização total
da amostra e incubação a 60ºC por 30 minutos em banho-maria. Posteriormente, foram
acrescidos 162 μl de CTAB de Hoog (Tris 2M; NaCl 8,2%; EDTA 2M; CTAB 0,2%),
seguido novamente de homogeneização e incubação a 65ºC por 10 minutos
(RODRIGUES, 2010).
Após a incubação, foram adicionados 570 μl de clorofórmio/álcool isoamílico
(24:1), misturado por inversão até homogeneização total do conteúdo e,
posteriormente, incubado por 30 minutos em gelo. Em seguida, a amostra foi
centrifugada a 15.929 x g por 15 minutos. Nessa etapa, foi possível observar a fase
aquosa (superior) e esta foi transferida para um novo microtubo. Posteriormente, foi
adicionado 10% do volume de acetato de sódio 3M. Em seguida, o tubo foi invertido até
ocorrer a homogeneização completa e incubado a 0ºC por 30 minutos. Após a
incubação, a amostra foi centrifugada a 15.929 x g por 15 minutos (RODRIGUES,
2010).
O sobrenadante resultante da centrifugação foi transferido para um novo
microtubo e, em seguida, adicionado 50% do volume obtido de isopropanol. O tubo foi
ser invertido repetidamente. Após, ocorreu a centrifugação a 15.929 x g por 10 minutos.
Nessa etapa, o sobrenadante foi desprezado e, em seguida, foi adicionado 200 μl de
16
etanol 70% a 4ºC, promovendo uma gentil suspenção do material precipitado com o
auxílio de uma pipeta para não danificar o DNA. Após essa etapa, a amostra foi
centrifugada por 15929 x g por 5 minutos. Em seguida, a etapa na qual ocorreu a
adição de etanol 70% foi repetida mais uma vez para melhores resultados. Após a
centrifugação, o sobrenadante foi desprezado e a amostra permaneceu aberta para
ocorrer a evaporação total do etanol por cerca de 1 hora. Por fim, foi acrescido 100μl de
Tris-EDTA (Tris-HCl 0,01 M; EDTA 0,001M) na amostra (RODRIGUES, 2010).
Conforme necessário, as amostras foram congeladas (-20 ºC) até a sua utilização.
As amostras de DNA obtidas foram submetidas a eletroforese em gel de agarose
0,8% para quantificação, utilizando marcadores de concentração (λ DNA, Invitrogen).
2.3 REAÇÃO DE PCR
As amostras de DNA genômico foram submetidas a técnica de PCR para a
amplificação do rDNA. Os oligonucleotídeos iniciadores aplicados foram o ITS1 (5'
TTCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') e ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3') para
estudo da região ITS conforme descrito por Rodrigues (2010), com algumas
modificações.
Cada reação de PCR apresentou um volume final de 50 μl contendo de 5-10ng
DNA; 10 μl de tampão de PCR 5x; 2,5 μl de primer ITS-1 (5’
TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3’) a 100 pm; 2,5 μl de primer ITS-4 (5’
TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’) a 100 pm; 2 μl de dNTPs a 10 pm; 7 μl de MgCl₂ 25
mM; 1 μl de enzima Taq Polimerase. As condições da PCR foram: desnaturação por 5
minutos a 94ºC, seguido de 24 ciclos (desnaturação a 94ºC por 1 minuto, anelamento a
55ºC durante 1 minuto e elongação a 72ºC por 1 minuto) e extensão final de 72 °C
durante 5 minutos (RODRIGUES, 2010). Conforme necessário, as amostras foram
congeladas (-20 ºC) até a sua utilização.
Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,2%,
sendo utilizado marcador de concentração (1 kp DNA ladder Biolabs).
17
2.4 PURIFICAÇÃO, QUANTIFICAÇÃO E SEQUENCIAMENTO DAS SEQUÊNCIAS DE
DNA
O produto de reação da PCR foi submetido à purificação através do kit Invisorb®
Fragment CleanUp da Invitek, seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante. Para a
confirmação do material, as amostras foram submetidas à eletroforese com gel 1,2% de
agarose.
Em seguida, as amostras foram quantificadas. Para tal, foi utilizado o aparelho
Quantus™ Fluorometer da Promega, seguindo o protocolo manual para QuantiFluor®
dsDNA System fornecido pelo fabricante. Os dados obtidos foram alojados em forma de
tabela para uso posterior.
Para a realização do sequenciamento das amostras, as amostras foram enviadas
para a empresa Helixxa Pesquisa (Campinas, SP), onde foi utilizada a plataforma
Applied Biosystems® 3500 Genetic Analyzer, sendo também enviados os dados de
quantificação de cada amostra.
2.5 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS DE DNA
Depois de realizado o sequenciamento, as sequências obtidas se encontraram
em arquivos com formato “Arquivo AB1”, sendo um arquivo para a sequência forward
(sentido 3’ para 5’) e um outro arquivo para a sequência reverse (5’ para 3’) para uma
mesma amostra de DNA. Essas sequências foram visualizadas com o programa BioEdit
(Biological sequence alignment editor – versão 7.2.5).
Posteriormente, ambos os arquivos de cada amostra de DNA foram alinhados
para a obtenção de um contig, que é a junção de segmentos de DNA sobrepostos que,
em conjunto, representam uma região consensual de DNA. Para tal, os arquivos foram
convertidos em formato “.zip” e encaminhados para o programa Electropherogram
quality analysis (http://asparagin.cenargen.embrapa.br/phph/) desenvolvido pela
Embrapa: Genetic Resources and Biotechnology. Em seguida, foi obtida a tabela de
qualidade das amostras.
18
A tabela informa o número total de bases, quantidade de bases com qualidade
superior a 20%, quantidade de bases com qualidade superior a 30% e se a sequência
apresentou mais de 100 bases com qualidade superior a 20% da sequência forward e
da sequência reverse. As sequências que apresentaram o último item como “Ok” foram
analisadas posteriormente e as que obtiveram “No” foram descartadas devido uma má
qualidade de uma ou ambas as sequências.
Em seguida, ambas as sequências com boa qualidade foram selecionadas em
“Read number” e foi selecionada a opção “cluster sequences using CAP3 for checked
reads” na parte inferior da tabela. Quando necessário, esse último passo foi refeito até
o surgimento da opção “contig list” na nova página carregada. Por fim, nessa opção foi
obtido o contig, que foi armazenado em arquivo word para posterior análise.
Para a identificação dos isolados, os contigs foram depositados separadamente
no banco de dados NCBI (National Center for Biotechnology Information
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), utilizando o programa BLAST Nucleotide (Basic Local
Alignment Search Tool Nucleotide) desenvolvido pela National Center for
Biothecnology. O contig foi armazenado em “Enter accession number(s), gi(s), or
FASTA sequence(s)” e, em seguida, foi selecionada a opção “BLAST” em azul no final
da página.
Posteriormente, o site demonstrou a distribuição dos 100 melhores BLASTs de
100 sequências armazenadas no site e sequências que produziram alinhamentos
significativos. Neste último, foi dado a descrição e o nome da sequência armazenada,
sendo o começo do nome, na maioria das vezes, o nome científico do organismo
estudado, juntamente com seu max score, total score, query cover, e-value, identidade
e accession (Query ID). São fundamentais para este estudo o max score, e-value e
identidade. Esses três foram armazenados em forma de tabela.
Em caso de obtenção de duas ou mais sequências com nomes diferentes, mas
com max score e identidade muito parecidas, foi realizada uma comparação com a
morfologia obtida com a literatura para poder diferenciar essas sequências e para uma
melhor identificação dos isolados. Posteriormente, os nomes que possuíam altas
diferenças morfológicas foram descartados.
19
Após obtenção do nome científico ou gênero de cada fungo, a literatura foi
consultada para descobrir qual nicho o isolado estudado pertence e informações gerais
e específicas dos mesmos.
20
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Dos 77 fungos inicialmente isolados, 51 apresentaram significativo crescimento e
estavam sem contaminação. Em todos estes, foi realizada a extração de DNA. Na figura
1 observa-se os resultados obtidos com a eletroforese em gel de agarose de amostras
de DNA extraídas dos isolados.
Figura 1 - Eletroforese em gel de agarose 0,8% da extração de DNA obtida de 4 diferentes isolados de fungos presentes em P. desiderabilis. Kb: tamanhos das bases do marcador utilizado. M: marcador λ
HindIII DNA da BioLabs®, onde não foi possível a visualização das bandas de tamanho 564 pb e 125 pb; 1 a 4: DNA de fungos com cerca de 9416 pb. Amostra 3 com pequeno rastro, mas com a presença de grande quantidade de RNA na parte inferior da figura. Amostra 4 com rastro significativo e pouco RNA.
Com a utilização de eletroforese em gel de agarose para verificar as amostras,
foi possível estimar a concentração de DNA obtido na extração de DNA de cada
isolado. De acordo com o manual do marcador, a banda de tamanho de 2027 pb possui
concentração de 20,9 ng/μl e a banda 4361 pb possui 45 ng/μl. Em vista disso, as
amostras foram comparadas com o marcador para se obter uma estimativa da
concentração de DNA das amostras.
Para a realização da técnica de PCR, é preciso de no mínimo 20 ng/μl de DNA e
no máximo 100 ng/μl. Entretanto, nem todas as amostras possuíram essa
concentração. Porém, sabe-se que mesmo com uma baixa concentração de DNA é
21
possível realizar a reação de amplificação, visto que esta técnica vai promover a
multiplicação do DNA, aumentando milhões de vezes o DNA inicial.
Também foi possível avaliar a qualidade do DNA obtido através da eletroforese.
Algumas amostras possuíram um rastro na banda de 9416 pb e este rastro pode
prejudicar na amplificação da região a ser estudada, uma vez que sinaliza degradação
do DNA. Porém, em alguns casos, a degradação ocorrida pode não ter afetado a região
a ser estudada, não interferindo, assim, na amplificação por PCR. Também foi visto que
grande parte das amostras demonstraram conter RNA. A presença do RNA não
interfere na amplificação, uma vez que o RNA é uma molécula estável e os primers vão
apenas se alinhar à molécula de DNA.
Para a extração de DNA, diversos autores, como Carvalho-Filho (2013) e
Barichello et al. (2010), descrevem a utilização do nitrogênio líquido na extração de
DNA como sendo o método mais apropriado, porém mesmo sem sua utilização, a
extração empregada neste estudo se mostrou efetiva e de baixo custo.
Também foi realizada a amplificação por PCR das 51 amostras de DNA
extraídas. Todas as amostras apresentaram uma banda de 500 pares de base, assim
como descrito por Araújo et al. (2010). Algumas destas amostras estão representadas
na figura 2. De acordo com o manual do marcador 1kp DNA ladder Biolabs® utilizado, a
banda de 3000 pb apresenta 125 ng/μl de concentração. Com isso, pode-se estimar
que todas as amostras obtiveram uma concentração superior de 125 ng/μl.
A figura 2 exemplifica os produtos de amplificação por PCR de 4 diferentes
isolados em gel de agarose 1,2%. Percebe-se que as amostras apresentaram um rastro
entre as bandas de 1000 pb e 500 pb que pode interferir no sequenciamento. Já na
região inferior da figura, há a presença de excessos de primers, DNA e reagentes que
também podem causar interferência.
22
Figura 2 - Eletroforese em gel de agarose 1,2% dos produtos de amplificação por PCR obtidos de 4 diferentes isolados presentes em P. desiderabilis utilizando os primers ITS 1 e ITS 4. Kb: tamanhos dos pares de bases do marcador utilizado. M: marcador 1 kp DNA ladder (Biolabs®); 1 a 4: produto de PCR de diferentes isolados apresentando banda de 500 pb com alta concentração; CN: controle negativo da
reação de PCR apresentando apenas excesso de componentes da reação, sem nenhuma banda aparente, demostrando que não houve contaminação na reação. Região inferior da foto demonstrando
excesso de primers, DNA e outros componentes da reação.
Todas as amostras foram purificadas para evitar problemas no sequenciamento.
A purificação se mostrou eficiente para a remoção tanto dos rastros e da banda de
1000 pb, quanto de excessos de primers, DNA e outros componentes da reação de
PCR. Como mostrado na figura 3, mesmo após a purificação, as amostras continuaram
apresentando mais de 125 ng/μl de concentração.
Figura 3 - Eletroforese em gel de agarose 1,2% dos produtos de amplificação purificados de 4 diferentes isolados fúngicos de Pentacalia desiderabilis. Kb: tamanhos dos pares de bases do marcador utilizado. M: marcador 1 kp DNA ladder (Biolabs®); 1 a 4: produto de PCR de diferentes isolados apresentando
banda de 500 pb com alta concentração. Todas amostras demonstraram possuir apenas a banda de 500 pb, sem rastros.
23
A quantificação foi realizada em todas as amostras e foi concluído que
possuíram cerca de 72 e 194 ng/μl de concentração, com uma média de 139 ng/μl. Tal
fato, confirma a concentração estimada com o uso do marcador. Posteriormente, todas
as amostras foram enviadas para sequenciamento.
Foram sequenciados 51 diferentes produtos de amplificação, cada um
correspondente a região ITS1 e ITS4 do rDNA de diferentes isolados. O resultado
obtido de cada isolado foi analisado com o programa Electropherogram quality analysis.
Este programa é a interface de um programa phrap que permite a montagem de
contigs, gera informações sobre eles, permite a manipulação de diversas sequências ao
mesmo tempo, dentre outras funções (FORMIGUIERI, 2004). As amostras que foram
avaliadas como “Ok” pelo programa apresentaram uma quantidade superior de 100
pares de bases com qualidade acima de 20% do total da sequência (Tabela 1). A
amostra exemplificada na Tabela 1 apresentou 1025 bases ao todo com qualidade
acima de 20, indicando que 89% da sequência apresentou boa qualidade
Já as avaliadas como “No” não cumpriram essas características e, por isso,
foram descartadas (Tabela 2). A amostra exemplificada na Tabela 2 apresentou 149
bases ao todo com qualidade acima de 20, indicando que somente 11% das
sequências se demonstrou com boa qualidade. De todas as amostras sequenciadas,
foram obtidas 29 sequências de boa qualidade, segundo análise realizada com o
programa.
Em alguns casos, pode-se obter uma sequência foward definida como “Ok”,
porém uma sequência reverse definida como “No”, ou vice-versa. Nestes casos, a
obtenção de uma sequência “No” acaba desqualificando a outra sequência, uma vez
que é necessário de ambas para formar o contig (Tabela 3). A amostra exemplificada
na Tabela 3 apresentou 365 bases ao todo com qualidade acima de 20, indicando que
24% das sequências se demonstrou com boa qualidade. A sequência foward se
demonstrou como “Ok” por possuir 291 bases com qualidade acima de 20, porém a
reverse se demonstrou como “No” por possuir 74 bases com qualidade acima de 20
Em outros casos, pode ocorrer uma quebra do DNA na região a ser
sequenciada. Tal ocorrência, pode resultar em uma fita incompleta ou fragmentada com
24
poucos trechos sequenciados, apresentando baixa quantidade de pares de bases com
qualidade acima de 20%, resultando em uma sequência qualificada como “No”.
Uma possível explicação para a obtenção de sequências qualificadas como “No”
seria a utilização de primers antigos na realização da amplificação por PCR, que
poderiam estar degradados.
Para confirmação, as amostras foram visualizadas com o programa BioEdit que é
um programa phred que permite a aferição da qualidade de cada base obtida, leitura de
cromatogramas, visualização e edição dos contigs, dentre outras funções
(FORMIGUIERI, 2004).
Tabela 1 – Resultado obtido através do programa Electropherogram quality analysis,
exemplificando a região ITS1 e ITS4 do isolado L69A, que foi classificado como “Ok”.
Tabela 2 – Resultado obtido através do programa electropherogram quality analysis,
exemplificando a região ITS1 e ITS4 do isolado P22 que foi classificado como “No”.
Tabela 3 – Resultado obtido através do programa electropherogram quality analysis,
exemplificando a região ITS1 e ITS4 do isolado P20A que foi classificada como “No”.
25
Nos cromatogramas das amostras analisadas, o programa atribuiu bases a cada
pico observado e valores que indicam a qualidade de cada base. Quanto maior o pico,
maior a chance da base indicada no cromatograma ser a correta, portanto, picos baixos
podem indicar uma imprecisão na base indicada. O programa aplica uma cor para cada
base para melhor identificação. A base T apresenta coloração vermelha, a base C
possui coloração azul, a base G possui cor preta, a base A possui coloração verde e as
bases indefinidas com outras letras do alfabeto é de cor roxa. Quanto menor a
quantidade de bases indefinidas, melhor a sequência para realizar a identificação de
indivíduos corretamente. O programa também demonstra, logo em cima das bases
obtidas, a região da sequência que está sendo observada.
A figura 4 exemplifica a sequência foward da amostra P2B que apresentou alta
qualidade devido a picos estáveis e únicos em cada região da sequência, apresentando
essas características por toda a sequência. É comum que a região inicial e a final da
sequência apresentem picos muito baixos e bases incertas.
Já a figura 5 exemplifica a sequência foward do isolado P22 que foi descartado.
Esta foi avaliada como uma sequência de baixa qualidade devido a picos muito baixos
em grande parte da sequência, principalmente na região central, demonstrando grande
quantidade de bases imprecisas. As poucas regiões que apresentaram picos mais altos
se demonstraram ser muito instáveis com diversas ocorrências de sobreposição entre
os picos.
Figura 4 – Sequência foward do isolado P2B visualizada no programa BioEdit. Primeira linha representa o começo da sequência com as primeiras bases obtidas. Segunda linha representa a região central da
sequência apresentando uma ótima qualidade. Terceira linha representa a região final da sequência, com as últimas bases obtidas.
26
Figura 5 – Sequência foward do isolado P22 visualizada no programa BioEdit. Primeira linha representa o começo da sequência com as primeiras bases obtidas. Segunda linha representa a região central da
sequência apresentando uma baixa qualidade. Terceira linha representa a região final da sequência, com as últimas bases obtidas.
Não foi utilizado um programa unicamente consed, uma vez que não houve
edição dos contigs e o programa phrap utilizado e o BLASTn já permitiram a
visualização dos alinhamentos.
O programa BLASTn permite a comparação de uma sequência de nucleotídeos
de entrada com um banco de dados de sequências de nucleotídeos. Com sua
utilização, é possível obter os parâmetros mais importantes para este estudo: o score,
identidade e e-value. O score é uma nota que foi atribuída pelo algoritmo criado pelo
programa e pela quantidade de pareamentos perfeitos e imperfeitos entre a sequência
que vai ser estudada com uma sequência já depositada no GenBank. Quanto maior o
score, melhor o pareamento, porém o score não pode ser analisado individualmente,
devendo ser acompanhado de outros valores (AMARAL et al., 2007).
O e-value representa a probabilidade de que o alinhamento realizado pelo site
seja correto ou errôneo (falso positivo). Pode ser considerado como a quantidade de
sequências errôneas que apresentariam score bastante similar à sequência correta.
Quanto menor seu valor, menor a chance de se obter um falso positivo e, portanto,
maior sua confiabilidade. Estatisticamente, o e-value pode representar um valor
significativo de ser um falso-positivo, porém, biologicamente, em alguns casos, o valor
obtido pode não ser significativo e se encontrar na faixa ideal. O e-value pode ser
representado como 0,0, 0,12 ou 3e-25. Neste último, esse valor pode apresentar-se
com outros números e em forma abreviada de notação científica. Também é importante
ressaltar que sequências curtas podem apresentar alta similaridade, porém e-value alto,
27
uma vez que há maiores chances de sequências pequenas apresentarem um resultado
falso positivo (AMARAL et al., 2007).
Identidade é a quantidade de letras com pareamento perfeito identificados no
alinhamento da sequência estudada e da sequência armazenada no banco de dados. É
expresso em porcentagem e a similaridade entre as sequências é baseada em seu
valor (AMARAL et al., 2007).
A partir destes parâmetros obtidos pelo BLASTn, foram escolhidas como certas
as sequências que apresentaram maior valor de score, maior identidade e menor e-
value possível.
Segundo Moreira (2013), fungos pertencentes ao filo Ascomycota, podem
apresentar problemas em sua identificação caso suas sequências sejam obtidas a partir
da região ITS. Para tal, é necessário realizar uma interpretação específica para estas
sequências. As sequências com identidade de 99% devem ser consideradas como a
mesma espécie, igual a 98% como pertencentes à mesma espécie ou gênero devendo
haver sempre uma comparação com sua morfologia, entre 95% e 97% devem ser
consideradas apenas o mesmo gênero e as abaixo de 95% como pertencentes à
mesma família, classe ou como inconclusiva.
Após a obtenção do sequenciamento, os fungos com boas sequências foram
cultivados novamente em duplicatas para verificação de contaminação por outros
fungos. Apenas o isolado P28A2 apresentou dois fungos, sendo descartado. Os demais
estavam totalmente isolados e o L69B não pode ser verificado devido a este se
apresentar sem crescimento mesmo após seu cultivo ser refeito outras 2 vezes.
Das 29 sequências, foram obtidos os gêneros Diaporthe, Pestalotiopsis,
Colletotrichum, Epicoccum, Ophioceras, Phaeosphaeria, Paraphaeosphaeria. A maioria
dos fungos pertencem ao gênero Diaporthe, sendo as espécies mais frequentes
Diaporthe passiflorae e Diaporthe phaseolorum. Todos os fungos identificados
pertencem ao filo Ascomycota e os dados obtidos no banco de dados NCBI se
apresentam na tabela 4.
28
Tabela 4 - Resultados da identificação dos fungos endofíticos através da comparação
das sequencias obtidas com o banco de dados do NCBI.
Nome do Fungo Nome científico Score (ident) E value
P2A1 Diaporthe passiflorae Diaporthe sp.
710 (93%) 704 (93%)
0.0 0.0
P2B Diaporthe passiflorae 1000 (98%) 0.0
P3 Diaporthe phaseolorum 806 (94%) 0.0
P8 Diaporthe phaseolorum 1035 (99%) 0.0
P9 Diaporthe phaseolorum 773 (93%) 0.0
P18 Diaporthe phaseolorum 966 (98%) 0.0
P22A Diaporthe sp. Diaporthe passiflorae
723 (92%) 721 (92%)
0.0 0.0
P22B1 Phomopsis sp. Diaporthe passiflorae
586 (96%) 583 (96%)
1e-163 2e-162
P23 Paraphaeosphaeria neglecta Paraconiothyrium sporulosum
1037 (99%) 1037 (99%)
0.0 0.0
P28C2 Diaporthe passiflorae 1029 (99%) 0.0
L44 Ophioceras leptosporum 929 (98%) 0.0
L46A Diaporthe sp. 983 (98%) 0.0
L46B Diaporthe sp. Phomopsis sp.
760 (93%) 754 (93%)
0.0 0.0
L48 Diaporthe sp. Diaporthe passiflorae
981 (99%) 970 (99%)
0.0 0.0
L49 Diaporthe phaseolorum 1014 (99%) 0.0
L50A Diaporthe phaseolorum 941(99%) 0.0
L56 Xylariaceae sp. Sordariomycetidae
571 (86%) 545 (91%)
6e-159 4e-151
L58A Diaporthe passiflorae 1013 (99%) 0.0
L62A1 Diaporthe phaseolorum 946 (98%) 0.0
L62A2 Diaporthe phaseolorum 968 (99%) 0.0
L63 Diaporthe phaseolorum Diaporthe passiflorae
992 (99%) 981 (99%)
0.0 0.0
L64 Phaeosphaeria poagena 547 (96%) 8e-152
L65A Colletotrichum gloeosporioides Pestalotiopsis microspora
1101 (99%) 1096 (99%)
0.0 0.0
L67 Diaporthe passiflorae Diaporthe phaseolorum
935 (97%) 926 (97%)
0.0 0.0
L69A Fungo endofítico Pestalotiopsis sp
Pestalotiopsis vismiae Pestalotiopsis carveri
1044 (99%) 1038 (99%) 1038 (99%) 1038 (99%)
0.0 0.0 0.0 0.0
L69B Fungo endofítico Pestalotiopsis microspora
Pestalotiopsis neglecta
1044 (99%) 1038 (99%) 1038 (99%)
0.0 0.0 0.0
L70B Epicoccum nigrum 885 (99%) 0.0
11B Diaporthe phaseolorum Diaporthe passiflorae
793 (95%) 776 (95%)
0.0 0.0
29
Nas figuras 6 e 7, é possível observar a morfologia de cada um dos isolados
sequenciados após crescimento de 10 a 20 dias.
Figura 6 – Alguns dos Isolados sequenciados. Cima para baixo, frente e verso, da esquerda para a direita: P2A1, P2B, P3, P8, P9, P18, P22A, P22B1, P23, P28C2, L44, L46A, L46B, L48 e L49.
30
Figura 7 – Alguns dos Isolados sequenciados. Cima para baixo, frente e verso, da esquerda para a direita: L50A, L56, L58A, L62A1, L62A2, L63, L64, L65A, L67, L69A, L70B e 11B.
O Filo Ascomycota apresenta cerca de 30 mil espécies de fungos unicamente
terrestres, sendo o maior grupo do reino Fungi compreendendo cerca de 75% de todos
os fungos descritos. Sua principal diferença é a presença de ascos, célula sexual
produtora de esporos destes fungos, que contém ascosporos. Podem apresentar tanto
reprodução sexuada quanto reprodução assexuada. Compreende espécies
cosmopolitas e possuem natureza saprofítica, fitopatógena, endofítica e patógena de
humanos. Vários representantes deste filo apresentam papel fundamental na indústria
alimentícia e biotecnológica (MAMEDE, 2012; SILVA; COELHO, 2006; MORAES et al.,
2009).
Os isolados P2A1, P3, P9, L46B e P22A foram classificadas como pertencentes
à família Diaporthaceae por apresentarem valor de identidade entre 92 a 94%, 0,0 e-
value e mediano score.
A família Diaporthaceae foi definida por Hohnel e Wehmeyer no ano de 1926.
Sua forma altera de acordo com sua maturidade. As paredes do asco são delicadas e
31
podem quebrar facilmente em água. Apresentam esporos com diversos formatos, como
hialino, septado, alantoide, dentre outros. Apresenta 24 gêneros, sendo um deles o
gênero Diaporthe (IMA, 2016; WEHMEYER, 1926).
Foram identificados como Diaporthe sp. as amostras P28A2, L46A, L67 e 11B
por apresentar de 98% a 99% de similaridade com Diaporthe sp. apresentando alto
score e baixo e-value ou por apresentar similaridade entre 95% e 97% com alguma
espécie do gênero Diaporthe apresentando 0.0 de e-value e score de mediano a alto.
Já a amostra P28A2, como explicado anteriormente, apresentou contaminação
com outro fungo e, portanto, foi classificada como inconclusiva. Enquanto isso, o
isolado P22B1 apresentou identidade de 96% e foi identificado como Diaporthe sp.,
porém demonstrou um e-value de 1x10-163, tal fato é explicado por este isolado ter
apresentando uma pequena sequência, como discutido anteriormente.
O gênero Diaporthe foi definido por Nitschke no ano de 1970. Apresenta
distribuição global e possui cerca de 800 espécies. O gênero Diaporthe inclui um
grande número de espécies nomeadas, sendo que muitas são sinônimas entre si. Seus
esporos se apresentam como hialinos e seus ascos são escuros e longos. O único
caráter constante é o formato de seu esporo. Acredita-se que sua forma simples tenha
sido originada a partir do gênero Gnomonia (IMA, 2016; ELFAR et al., 2013;
WEHMEYER, 1926; RODRIGUES, 2010).
Já foi visto como endofítico, saprofítico, fitopatógeno e patógenos de humanos.
Há diversos relatos de espécies de Diaporthe que causam câncer em caules e ramos,
deterioração de galho, podridão de frutos e sementes, queima da haste e da vagem,
mancha foliar e ferrugem em uma ampla gama de vegetais hospedeiros. Podem estar
presentes em vegetais de interesse econômico como amêndoa, abacate, azeitona,
pistache, girassol, limão, soja e morango. Em alguns desses casos pode ser
classificado como fitopatógeno fraco, causando danos não muito significativos no
vegetal. Entretanto, Diaporthe tem sido reportado como um dos fungos endofíticos mais
frequentemente encontrados (CHEN et al., 2014; GOMES et al., 2013; ELFAR et al.,
2013)
32
Tem sido reconhecido pela sua produção de enzimas e metabólitos secundários
para antibióticos e atividades anticancerígenas. Já foram utilizados para atividades
lignocelulolíticas, para deter herbivoria e como bioherbicida. Seu nicho ecológico vai
depender do meio onde este se encontra (GOMES et al., 2013; CHEN et al., 2014;
RODRIGUES, 2010). O complexo enzimático celulolítico é produzido por diversos
microrganismos para uso industrial das celulases. Sabe-se que o etanol combustível
pode ser fabricado a partir de materiais lignocelulósicos ao ter a conversão de açúcar
em etanol. Esse modo de produção auxilia na obtenção de preparações enzimáticas de
baixo custo, com altos níveis de atividade enzimática e estabilidade (BONOMI et al.,
2008).
Estudos realizados demonstraram apresentar taxol, dicetopiperazinas, ácido
nitropropiônico, uracila, tirosol, zygosporina D, pirrolidona, lovastatina e alternariol e as
enzimas Laccas e Dicerandrol A, B e C. Algumas destas enzimas e metabólitos podem
apresentar atividade anticancerígena, antioxidante, antifúngica e anti-inseticida. Produz
citocalasinas H e J, que demonstraram efeitos inibitórios potentes sobre os neutrófilos
humanos, possuindo a capacidade de atuar como inibidores potenciais de NADPH-
oxidase que podem ser alvos promissores para a elaboração de agentes anti-
inflamatórios. Em alguns estudos realizados, foi visto um composto inédito derivado de
triterpenoide tretracíclio 19-nor-lanostana, que apresentou atividade antibacteriana em
relação a bactérias gram-positivas e gram-negativas, como Streptococcus pyogenes,
Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus (BIASETTO, 2016; BORGES,
2008; PES, 2015).
Já a amostra L63 apresentou a mesma identidade de 99% para Diaporthe
phaseolorum e Diaporthe passiflorae e mesmo e-value de 0,0, porém o primeiro obteve
992 de score enquanto que o segundo teve 981 de score. Portanto, essa amostra foi
identificada como D. phaseolorum. O mesmo caso se apresentou no isolado L48, igual
identidade de 99% para Diaporthe sp. e Diaporthe passiflorae e igual e-value de 0,0,
porém Diaporthe sp. apresentou 981 de score, enquanto que D. passiflorae obteve 970.
Este isolado foi identificado como Diaporthe sp.
33
A partir do alinhamento com sequências previamente depositadas no GenBank,
os isolados P2B, P28C2 e L58A foram identificados como Diaporthe passiflorae, pois
apresentaram identidade máxima de respectivamente 98%, 99% e 99%, e-value 0.0 e
alto score.
Os fungos P8, P18, L49, L50A, L62A1 e L62A2 foram identificadas como
Diaporthe phaseolorum, uma vez que apresentaram identidade de 98% a 99%, e-value
0.0 e score alto.
A espécie Diaporthe phaseolorum foi descrita por Saccardo em 1870. Apresenta
7 subespécies e sua taxonomia vem sendo considerada difícil e controversa, porém
técnicas moleculares estão sendo aplicadas para auxiliar em uma melhor classificação
deste microorganismo. Pode ser fitopatógeno em plantações de feijão, porém em
alguns mangues pode ser endofítico. Além disso, já foi reportado um caso de
patogenicidade em paciente soro positivo para vírus linfotrópico de células T humanas
tipo 1 (HTLV-1), distúrbio que afeta resposta imune, que sofreu inoculação do fungo no
corpo através de injúrias causadas por espinhos de Amaranthus spinosus. Em estudo
realizado, foi visto que este fungo produziu derivados dicetopiperazinas (GOMES et al.,
2013; FERNÁNDEZ; HANLIN, 1996; BORGES, 2008).
O fungo Diaporthe passiflorae foi descrito primeiramente por Crous e Lombard no
ano de 2012. Apresenta crescimento em temperaturas entre 10ºC e 30ºC, possuindo
crescimento excelente de seus micélios em 20ºC. Portanto, possui preferência em
regiões tropicais e subtropicais. Segundo estudos, este fungo possui crescimento
rápido, correspondendo ao resultado observado nos isolados deste estudo identificados
como D. passiflorae (ELFAR et al., 2013; IMA, 2016). Estudos de Elfar et al. (2013)
descreveram o primeiro relato deste espécime atuando como altamente fitopatógeno
em plantações de mirtilo. Não foram encontrados estudos sobre sua composição
química.
Segundo Gomes et al. (2013), com a deleção do Art. 59 do Código Internacional
de Nomenclatura para algas, fungos e plantas (ICN), os organismos iguais que
apresentam diferenças quanto ao estado assexuado e sexuado devem ser nomeados
igualmente. Como o nome Diaporthe foi descoberto em 1870 e o Phomopsis em 1905,
34
deve-se ser adotado apenas o nome mais antigo para este grupo de fungos. Portanto,
nas amostras P22B1, P28A2 e L46B o gênero obtido como Phomopsis sp. foi
substituído para Diaporthe sp. Sendo assim, o isolado L46B foi identificado como
Diaporthe sp. devido a uma similaridade de 93%, e-value de 0.0 e mediano score.
O gênero Phomopsis (anamorfo de Diaporthe) foi definido em 1905 por
Saccardo. Contém mais de 1.000 espécies. Atualmente, as técnicas moleculares para
identificação deste gênero se demonstram eficazes e credíveis. Essas técnicas também
auxiliaram na separação do estado anamórfico e teleomórfico através de sequências
moleculares independentemente da presença de estruturas sexuadas ou assexuadas.
Já foi encontrado em algumas leguminosas e rubiáceas e apresenta o mesmo nicho
ecológico de Diaporthe sp. Além disso, outros estudos afirmaram que este gênero se
demonstrou como efetivo produtor de metabólitos novos e bioativos, havendo relatos de
Phomopsis apresentando alta atividade antimicobacteriana (CHEN et al., 2014;
RODRIGUES, 2010; IMA, 2016).
Em estudos realizados foi visto que algumas espécies de Phomopsis produziram
phomopsidinas inibidoras de microtúbulos, phomoxantonas com atividade antimalárica
e antituberculose, éter biraril herbicida, phomalactona com inibição de citoquinas,
phomopsichalasina antimicrobiana e citocalasina H sendo reguladora de crescimento
de vegetais. Também teve a produção de phomoxantona A e phomodol, lactonas,
mycoepoxydienos policetídeos, sesquiterpenos da classe dos cadinanos,
benzopiranona e lovastatina, sendo que alguns destes demonstraram atividade
antifúngica e atividade citotóxica (BIASETTO, 2016; BORGES, 2008; PES, 2015;
SEBASTIANES, 2010).
O isolado L56 foi considerado como inconclusivo por apresentar uma sequência
com similaridade de 86% e um score de 571, contrastando com a outra sequência
obtida de similaridade de 91%, porém com score de 545, menor que o da primeira.
Além disso, ainda apresentou um alto e-value de 6x10-159 para a primeira sequência e
4x10-151 para a segunda. Tais fatos podem ser explicados pelo lento crescimento deste
fungo, sendo provável que se tenha obtido menor quantidade de material para extração
35
de DNA e, portanto, baixa concentração de DNA, prejudicando a amplificação da região
ITS.
O isolado L65A foi o que apresentou menor concentração de DNA de todas as
amostras “Ok” e apresentou uma similaridade de 99%. Neste, obteve-se duas
sequências com a mesma identidade, porém o fungo foi devidamente identificado como
Colletotrichum gloeosporioides devido à morfologia comparada com estudos de
Waculicz-Andrade (2009).
Em estudos realizados, o fungo Colletotrichum gloeosporioides foi definido por
Penzing e Saccardo no ano de 1884. Já foram descritos como endofíticos de algumas
plantas medicinais, porém também já foi encontrado como saprofíticos. É o agente
causador de diversas doenças como antracnose, podridão de pedúnculo e varicela. A
antracnose afeta gravemente frutos em pós-colheita e é considerada uma doença de
elevada importância econômica em algumas regiões brasileiras. Pode afetar maracujá,
goiaba, mangueira e diversas outras plantas economicamente importantes. Possui
capacidade de produzir derivados iminoaçúcar, dicetopiperazínico, dicetopiperazinas,
substâncias N-(2-feniletil) acetamida, N-acetiltriptamina e metalonoato de 2-hidroxibutila
3-indol. É conhecido pela produção de ácido colletótrico que apresenta bioatividade
contra Bacilus subtilis e Staphylococcus aureus e pela produção do alcaloide piperina.
Apresentam atividade antimicrobiana, antidepressiva, anti-inflamatória, antioxidante e
antitumoral (IMA, 2016; BORGES, 2008; BIASETTO, 2016; MOREIRA, 2013; MARTINS
et al., 2005; SILVA et al., 2006; WACULICZ-ANDRADE, 2009).
O isolado L70B foi identificado como Epicoccum nigrum devido a obtenção de
99% de similaridade, e-value de 0,0 e alto score. Este fungo foi definido por Link no ano
de 1816. Pode ser encontrado em plantas, solo, ar, pele humana e insetos. Foi
encontrado que este fungo se apresenta como endofítico e epífita de alguns vegetais de
zona tropical e pode se relacionar com uma alta variedade de plantas diferenciadas,
demonstrando uma boa adaptação. Apresenta crescimento irregular e cotonoso. Pouco
se sabe atualmente quanto a sua interação com os hospedeiros vegetais, porém
estudos já relataram ele sendo endofítico facultativo de cana-de-açúcar e provocado a
inibição do crescimento de patógenos deste vegetal. Entretanto, seus conídios que se
36
propagam pelo ar podem causar desordens respiratórias em humanos (TUTTOBELLO
et al., 1969; IMA, 2016; FÁVARO et al., 2012; FERREIRA, 2016; ARAÚJO, 2012).
Já foi utilizado como biocontrole contra microorganismos patógenos e também
como fator de crescimento de sistema radicular. Foram encontrados compostos
antioxidante, antirretroviral, antitumoral, inibidor de protease e telomerase e causador
de hemólise de eritrócitos. O metabólito orevactaeno presente neste fungo inibe a
replicação do vírus HIV. Além disso, apresentam metabólitos com capacidade de
biotransformação, produção de beta-glicanas, formação de pigmentos para corantes
alimentícios e compostos fluorescentes epicocconona, que é um novo fluoróforo para
utilização em eletroforese (FÁVARO et al., 2012; FERREIRA, 2016; ARAÚJO, 2012).
Segundo Tuttobello et al. (1969), já foram isolados pigmentos amarelos e
vermelhos deste fungo. O pigmento amarelo foi identificado como flavina, que possui
ação antifúngica. Já o pigmento vermelho é composto por 4 diferentes carotenóides.
Em estudos realizados por Queissada et al. (2013), foi visto que o E. nigrum apresenta
efetividade contra efluentes altamente poluentes em água contaminadas com óleo,
diminuindo a demanda química de oxigênio, quantidade de fenóis totais, óleos,
gorduras e oxigênio dissolvido na água.
Já o fungo L44 foi identificado como Ophioceras leptosporum por apresentar
uma identidade de 98%, 0,0 de e-value e 929 de score. Este organismo foi definido
primeiramente por Walker no ano de 1980. O gênero Ophioceras apresenta fungos
presentes em algumas herbáceas e também em ambientes aquáticos. Algumas
espécies do gênero Ophioceras apresentam atividade antibacteriana, antifúngica de
fitopatógenos através da produção de ophiocerol, ophiocerinas, ácido isoamericanoico
A e ácido cafeico (IMA, 2016; MONKAI et al., 2013; KLAUBAUF, 2015).
A espécie Ophioceras leptosporum é uma espécie de fungo saprofítico. Estudos
revelam que são grandes decompositores, uma vez que crescem em folhas sobre
processo de decaimento e produzem muitas enzimas para realizar essa decomposição
química. Fungos saprofíticos são grandes potenciais para produção de metabólitos
secundários importantes para o ser humano. Apresenta atividade antibacteriana contra
37
Staphylococcus aureus e Bacillus cereus, além de compostos citotóxicos, antitumorais e
antioxidantes. Possui o composto bioativo sesquiterpenos (MONKAI et al., 2013)
O isolado L64 foi identificado como Phaeosphaeria sp. devido uma identidade de
96% e e-value de 8x10-152. Este microorganismo foi definido em 1909 por Miyake. O
gênero Phaeosphaeria é restrito como fitopatógeno de Poaceas e algumas outras
plantas monocotiledôneas. Uma espécie pertencente a este gênero é muito famosa por
causar a mancha branca do milho. Porém, estudos sugerem que ele sozinho não causa
essa doença, precisando de interações com outros fitopatógenos para causar danos em
vegetais. Foram encontrados compostos naftalenona, naftoquinona, dímero de
naftoquinona assimétrico e éter difenílico clorado, sendo que alguns destes possuem
atividade antimicobacteriana e citotóxica (IMA, 2016; SACHS et al., 2011; PUTZKE;
PEREIRA, 2016; PITTAYAKHAJONWUT et al., 2008).
Os isolados L69A e L69B foram primeiramente identificados como fungos
endofíticos no GenBank com uma similaridade de 99%, score de 1044 e 0,0 de e-value.
Porém, apresentaram diversas espécies do gênero Pestalotiopsis com identidade
também de 99%, entretanto com score de 1038. Por fim, foram identificados como
fungos endofíticos do gênero Pestalotiopsis.
Fungos do gênero Pestalotiopsis foram definidos em 1949 por Steyaert. São
encontrados amplamente distribuídos em solos, ramos, sementes, frutas e folhas.
Apresentam uma grande variedade de hospedeiros e podem ser fitopatógenos,
saprofíticos, epífitas e endofíticos. Estudos sugerem que apenas se demonstraram
como endofíticos em algumas gimnospermas de regiões tropicais e subtropicais. No
Brasil, é muito conhecido por causar podridão branca em florestas de eucalipto em
alguns estados brasileiros. Em relação aos metabólitos secundários, estes apresentam
variadas aplicabilidades na medicina e na biotecnologia, ao originar taxol,
polissacarídeos, ácido ambúico e isopestacina com ações, respectivamente,
anticancerígenas, antidiabética, antifúngico e antioxidante. Também já foram
encontradas atividades fitotóxicas e antitumorais (KRUSCHEWSKY, 2010; IMA, 2016;
MOREIRA, 2013).
38
Em estudo realizado por Russel et al. (2011), a espécie Pestalotiopsis
microspora, pertencente ao gênero Pestalotiopsis, apresenta predisposição para
transferência horizontal de genes e tem a capacidade de degradar poliéster poliuretano
em condições aeróbias e anaeróbias, sendo o primeiro relato deste gênero com
capacidade de biodegradação.
Segundo Verkley et al. (2004), os organismos Paraphaeosphaeria sp. e
Paraconiothyrium sp. pertencem ao mesmo gênero Paraphaeosphaeria sp. O isolado
P23, portanto, foi identificado como Paraphaeosphaeria sp., uma vez que apresentou
similaridade de 99% com Paraphaeosphaeria neglecta e Paraconiothyrium sporulosum,
apresentando também o mesmo score de 1037.
O gênero Paraphaeosphaeria foi definido por Eriksson no ano de 1967. Possui
natureza endofítica e saprofítica. Apresenta atividade antimicrobiana, antifúngica e
antitumoral. Origina metabólitos derivados de coniontiriol e micosporulona, policetídeos,
terpenóides, modiólitos A e B, pentanotida linear e modiolina (IMA, 2016; DOURADO et
al., 2016; WIJERATNE et al., 2004; WONG et al., 2000). Em estudo realizado por
Wijeratne et al. (2004), foi visto que a espécie P. quadriseptata exibiu significante
citotoxidade contra diversas células humanas cancerígenas.
O quadro 1 apresenta o nome científico e gêneros encontrados após análise das
sequências, nicho a qual o fungo pertence e literatura do nicho encontrado. Não sendo
inclusa a família encontrada em alguns isolados.
39
Quadro 1 – Relação entre gêneros e espécies obtidas dos isolados, seu nicho ecológico
e devida referência
Espécie e gênero Nicho ecológico Referências
Diaporthe sp. Endofítico, fitopatógeno, saprofítico e patógeno de mamíferos
GOMES et al., 2013; ELFAR et al., 2013
Diaporthe passiflorae Fitopatógeno ELFAR et al.,2013
Diaporthe phaseolorum Endofítico, fitopatógeno e patógeno de humano
FERNÁNDEZ; HANLIN, 1996; GOMES et al., 2013
Paraphaeosphaeria sp. Endofítico e saprofítico DOURADO et al., 2016; WONG et al., 2000
Ophioceras leptosporum Saprofítico MONKAI et al., 2013
Phaeosphaeria sp. Fitopatógeno SACHS et al., 2011.
Colletotrichum gloeosporioides
Endofítico, fitopatógeno e saprofítico
WACULICZ-ANDRADE, 2009; MOREIRA, 2013; MARTINS et al. 2005
Pestalotiopsis sp. Endofítico, saprofítico, fitopatógeno e epífita
KRUSCHEWSKY, 2010; OSONO, 2008
Epicoccum nigrum Epífita, endofítico, patógeno de humano e saprofítico
FERREIRA, 2016
Portanto, foram encontrados 7 endofíticos identificados como D. phaseorolum, 1
C. gloeosporioides e 1 E. nigrum. Já a nível de gênero, foram encontrados 7 isolados
com o gênero Diaporthe, 2 Pestalotiopsis e 1 Paraphaeosphaeria com possíveis fungos
endofíticos. Ao todo, 2 foram considerados inconclusivos e os demais não apresentam
características de endofíticos.
Apesar de alguns isolados obtidos neste trabalho serem considerados
fitopatógenos, os fungos foram extraídos a partir de folhas sadias de P. desiderabilis
sem qualquer doença aparente.
Segundo Borges (2008), é difícil classificar um organismo corretamente em
endofítico, epifítico ou fitopatógeno uma vez que não há estudos suficientes para
distinguir o limite de cada uma dessas categorias. Com isso, alguns autores podem
classificar erroneamente um determinado organismo como endofítico e este apresentar
características de outra categoria.
40
Alguns pesquisadores acreditam que os fungos endofíticos tenham surgido a
partir de patógenos assintomáticos ou latentes e que algumas alterações mutagênicas
podem alterar a patogenicidade destes microorganismos (BORGES, 2008).
Em pesquisas realizadas demonstraram que as Asteraceas apresentam diversas
substâncias biologicamente ativas como terpenóides, flavonoides, cumarinas,
poliacetilenos e as lactonas sesquiterpênicas. Sendo que os metabólitos flavonoides,
ácidos fenólicos e LST se demonstram como confiáveis quimiossistemáticos.
Apresentam atividades citotóxicas, anti-inflamatórias e antifúngicas. Já o gênero
Pentacalia, apresenta sesquiterpenos, triterpenos e fenilpropanóides, sendo que alguns
representantes deste gênero também podem apresentar sitosterol, eicosanol, friedelina,
cumarinas escolpoletina, 7-geraniloxiescopoletina, flavonoides quercetina e rutina
(BORGES, 2008; FERREIRA et al., 2013; FERREIRA, 2010).
Estudos realizados por Ferreira et al. (2013), P. desiderabilis apresentou
flavonoides, ácido clorogênico, sesquiterpenos, monoterpenos, quinoides e
hidrocarbonetos. Também possui atividade antifúngica, leishmanicida, tripanocida,
antimalárica, antitumoral, citotóxica, anti-inflamatória, miotóxica e antiradicalar.
41
4. CONCLUSÃO/CONSIDERAÇÕES FINAIS
Com este estudo, foi possível estudar a presença de fungos endofíticos
associados à folhas de P. desiderabilis presente em Campos do Jordão, São Paulo.
Esta possui uma interessante e singular comunidade natural de fungos endofíticos.
Sendo que dos 77 fungos inicialmente isolados, 29 foram identificados por meio do
sequenciamento das regiões ITS1 e ITS4 do rDNA. Foi visto que os isolados pertencem
aos gêneros Diaporthe, Pestalotiopsis, Colletotrichum, Epicoccum, Ophioceras,
Phaeosphaeria, Paraphaeosphaeria. Dentre as espécies identificadas, Diaporthe foi o
gênero mais frequente, sendo as espécies Diaporthe phaseolorum e Diaporthe
passiflorae as mais encontradas.
Para a correta identificação dos isolados, os seguintes aspectos dentro desse
processo devem ser cuidadosamente observados:
Correta desinfecção do material vegetal para obtenção apenas de fungos
endofíticos
Isolamento e caracterização em morfoespécies, para diminuir a obtenção
de grande quantidade de fungos da mesma espécie e gênero
Obtenção das amostras de DNA: obtenção de 20 ng/μl a 100ng/μl de
concentração de DNA, podendo ser possível realizar a técnica com menor
concentração; evitar degradação do DNA; RNA não interfere na
amplificação; alta concentração obtida após amplificação não garante
sequências de boa qualidade; purificação deve ser realizada com um kit
ou técnica de boa qualidade e com cuidado para remover aspectos que
podem prejudicar o sequenciamento
Análise das sequências da região ITS 1 e ITS 4 do rDNA: uma precisa
análise das sequências foward e reverse de cada amostra deve ser feita;
visualização das amostras com programa phred; o score deve ser alto e
analisado com o e-value e a identidade; e-value deve ser baixo e sua
correta análise permite a eliminação de resultados falso-positivos; contigs
42
pequenos podem interferir nos valores de e-value e score; identidade deve
ser alta e seu valor pode definir a classificação dos organismos.
Recomenda-se que os isolados que não foram sequenciados e os que
apresentaram baixa similaridade sejam submetidos novamente ao processo de
extração de DNA e produção de seus amplicons para correta identificação.
Por fim, maiores estudos devem ser realizados para avaliar a presença de outros
fungos associados à P. desiderabilis que não foram obtidos neste estudo, para avaliar
novos bioativos que podem ser extraídos destes fungos e também para investigar
relações simbióticas entre a planta hospedeira e estes fungos.
43
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AMARAL, A. M.; REIS, M. S.; SILVA, F. R. (Ed.). O programa BLAST: guia prático de utilização Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Brasília, Distrito Federal: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, dez. 2007. 24 p. ARAÚJO, F. D. S. Aspectos da ecologia química de Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.), Epicoccum nigrum e Tetragonisca angustula. Campinas: UNICAMP, 2012. Tese (Doutorado em Ciências) – Instituto de química, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2012. ARAÚJO, W. L.; LACAVA, P. T.; MARCON, J.; LIMA, A. O. S.; KUKLIMSKYSOBRAL, J.; KLEINER-PIZZIRANI, A. A.; AZEVEDO, J. L. (Coord.). Guia prático: isolamento e caracterização de microrganismos endofíticos. Piracicaba: CALQ, 2010. p. 167.
ARRUDA, M. C. C. de; FERREIRA, M. A. S.; MILLER, R. N. G.; RESENDE, M. L. V.; FELIPE, M. S. S. Nuclear and mitochondrial rDNA variability in Crinipellis perniciosa from different geographic origins and hosts. Mycological Research, Brasil, v. 107, n. 01, p. 25-37, 2003
AZEVEDO, J. L. de. Microorganismos endofíticos. In: AZEVEDO, João Lúcio de; MELO, Itamar Soares de. Ecologia Microbiana. Jaguariúna: Embrapa, 1998. Cap. 4. p. 117-137. BARICHELLO, D.; CONSOLI, L.; PEREIRA, J. F. Otimização do processo de maceração visando a extração de DNA em larga escala. VI Mostra de Iniciação Científica da Embrapa Trigo, Passo Fundo, n. 123, dez. 2010 BIASETTO, C. R. Fungos endofíticos em Eugenia brasiliensis: prospecção química, biológica, enzimática e avaliação do co-cultivo e epigenética em Xylaria cubensis, Diaporthe sp. e Colletotrichum sp. Araraquara: UNESP, 2016. 69 f. Tese (Doutorado em Química) – Instituto de Química Júlio de Mesquita Filho, Universidade Estadual Paulista, Araraquara, 2016. BONOMI, A.; MAIORANO, A. E.; FILOMENA, M. A. R. Técnica aproveita lignocelulose da cana para produzir etanol. Visão agrícola, n. 8, p. 29-33, jun. 2008 BORGES, W. S. Estudo de fungos endofíticos associados a plantas da família Asteraceae como fontes de metabólitos secundários e em processos de biotransformações. Ribeirão Preto: USP, 2008. 350 f. Tese (Doutorado em Ciências), Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2008. BRASIL. Secretaria de Agricultura e Reforma Agrária de Pernambuco. Isolamento, identificação, estudo molecular e biocontrole de fungos de solo em feijoeiro
44
comum (Phaseolus vulgaris L.). Recife: Instituto Agrônomo de Pernambuco, 2011. p. 40. CARVALHO-FILHO, M. R. C. Identificação e relações filogenéticas, potencial de uso de isolados de Trichoderma no controle do mofo branco e como promotores de crescimento do feijoeiro. Brasília: UB, 2013. 123f. Tese (Doutorado em Fitopatologia) – Programa de Pós-graduação em Fitopatologia, Departamento de Fitopatologia, Universidade de Brasília, Brasília, 2013. CHAPLA, V. M.; BIASETTO, C. R.; ARAÚJO, A. R. Fungos endofíticos: uma fonte inexplorada e sustentável de novos e bioativos produtos naturais. Revista Virtual de Química, Araraquara, v. 5, n. 3, p. 421-437, nov. 2012. CHEN, S. F.; MORGAN, D. P.; HASEY, J. K.; ANDERSON, K.; MICHAILIDES, T. J. Phylogeny, Morphology, distribution, and pathogenicity of Botryosphaeriaceae and Diaporthaceae from English walnut in California. Plant Dis, California, v. 98, p. 636-652, 2014. COSTA-NETO, P. Q. C. Isolamento e identificação de fungos endofíticos da Pupunha (Bactris gasipaes Kunth) e caracterização por marcadores moleculares. Manaus: UFA, 2002. 103f. Dissertação (Mestre em Genética e Evolução) – Programa de Pós-graduação em Genética e Evolução, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Federal de São Carlos, Manaus, 2002. ELFAR, K; TORRES, R.; DIAZ, G. A.; LATORRE, B. A. Characterization of Diaporthe australafricana and Diaporthe spp. Associated with Stem Canker of Blueberry in Chile. Plant Disease, Chile, v. 97, n.8, p. 1042-1050, jul. 2013. DOURADO, C. P.; AMORIM, M. R.; BOTERO, W. B.; PEIXOTO, T.; SANTOS, L. C. Avaliação do perfil químico do fungo endofítico Paraphaeosphaeria sporulosa isolado das folhas de Paepalanthus planifolius (Bong) Korn (Eriocaulaceae). Rev. Cien. Farm. Básica Apl., Araraquara, v. 37, p. 1, ago. 2016 FÁVARO, L. C. L.; SEBASTIANES, F. L. S.; ARAÚJO,W. L. Epicoccum nigrum P16, a sugarcane endophyte, produces antifungal compounds and induces root growth. Plos One, v. 7, n. 6, p. 1-10, jun. 2012. FELBER, A. C.; PAMPHILE, J. A. Fungos endofíticos: potencial como controladores biológicos e estudos em videiras. UNINGÁ Review, Maringá, v. 1, n. 14, p. 13-25, abr. 2013. FERNÁNDEZ, F. A.; HANLIN, R. T. Morphological and ARPD Analyses of Diaporthe phaseolorum from Soybean. Mycologia, Nova York, v. 88, n. 3, p. 425-440, 1996. FERREIRA, L. S. Análise de variação populacional e caracterização dos metabólitos secundários presentes nas folhas de Lychnophora granmongolense (Duarte) Semir & Leitão Filho. Ribeirão Preto: USP, 2010. Dissertação (Mestrado em
45
Química) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2010. FERREIRA, A. J. Análise e anotação do genoma de Epicoccum nigrum e metabolismo secundário. São Paulo: USP, 2016. 136 f. Tese (Doutor em Ciências) – Programa de Pós-graduação, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2016. FERREIRA, M. J. P.; TOYAMA, D. O.; ROSSI, M. V.; FÁVERO, O. A.; ROMOFF, P. Estudo fitoquímico e avaliação das atividades biológicas de Pentacalia desiderabilis (Vell.) Cuatrec. 92 f. Relatório final, Escola de Engenharia, Universidade Presbiteriana Mackenzie, São Paulo, 2013 FOLLI-PEREIRA, M. S.; MEIRA-HADDAD, L. S.; BAZZOLLI, D. M. S.; KASUYA, M. C. M. Micorriza arbuscular e a tolerância das plantas ao estresse. R. Bras. Ci. Solo, v. 36, p.1663-1679, 2012. FORMIGHIERI, E. F. Phred phrap consed. Campinas: Laboratório de Genômica e Expressão da UNICAMP, 28 p., 2004.
FUNGARO, M. H. P. PCR na micologia. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento,
Londrina, v. 14, p. 12-16, 2000. FUNK, V. A.; SUSANNA, A.; STUESSY, T. F.; BAYER, R. J. (2009). Systematics, Evolution and Biogeography of Compositae. Vienna: Handcover IAPT, 2009. p. 1000. GOMES, R. R.; GLIENKE, C.; VIDEIRA, S. I. R.; LOMBARD, L.; GROENEWALD, J. Z.; CROUS, P. W. Diaporthe: a genus of endophytic, saprobic and plant pathogenic fungi. Persoonia, v. 31, p. 1-41, 2013. IMA. International Mycological Association. Mycobank, 2016. KLAUBAUF, S. Regulation of plant polysaccharide utilization in Magnaporthe oryzae and other ascomycetous fungi. Utrecht, Países Baixos: Universidade Utrecht, 2015. 198 f. Tese (Doutorado em Fisiologia de fungos) – Centro de Biodiversidade de fungos e fisiologia molecular de fungos, Universidade Utrecht, Utrecht, 2015. KRUSCHEWSKY, M. C. Taxonomia e ecologia do gênero Pestalotiopsis no Brasil, com ênfase para a Mata Atlantica do sul da Bahia. Ilhéus: UESC, 2010. 68f. Dissertação (Mestrado em Produção vegetal) – Programa de pós-graduação em produção vegetal, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, 2010 KUSARI, S.; SPITELLER, M. Are we ready for industrial production of bioactive plant secondary metabolites utilizing endophytes?. Nat. Prod. Rep, Alemanha, v. 28, p. 1203-1207, 2011.
46
LUCERO, M. E.; BARROW, J. R.; OSUNA, P.; REYES, I. Plant-fungal interactions in arid and semi-arid ecosystems: Large-scale impacts from microscale processes. Journal of Arid Environments, New Mexico, n. 65, p. 276-284, 2006. MAIER, W.; HAMMER, K.; DAMMANN, U.; SCHULZ, B.; STRACK, D. Acumulation of sesquiterpenoid cyclohexenone derivatives induced by an arbuscular mycorrhizal fungus in members of the Poaceae. Planta, Alemanha, n. 202, p. 36-42, 1997. MAMEDE, A. C. P. B. Avaliação da atividade antibacteriana de fungos do filo ascomycota e basidiomycota sobre Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Florianópolis: UFSC, 2012. 59 f. Dissertação (Bacharel em Ciências Biológicas) – Centro de Ciências Biológicas, Departamento de microbiologia, imunologia e parasitologia, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, 2012. MORAES, A. M. L.; PAES, R. A.; HOLANDA, V. L. Micologia. In: MOLINARO, E.; CAPUTO, L. F. G.; AMENDOEIRA, M. R. R. Conceitos e Métodos para formação de profissionais em laboratórios de saúde. Rio de Janeiro: EPSJV, v. 4, 2009. 469 p. MARTINS, I.; MELLO, S. C. M.; ÁVILA, Z. R.; PÁDUA, R. R.; PEIXOTO, J. R. Produção de Colletotrichum gloeosporioides em meio líquido. Brasília: Embrapa Recursos genéticos e Biotecnologia, Circular técnica, 1 ed., set. 2005 MONKAI, J.; CHUKEATIROTE, E.; CHAMYUANG, S.; SYNYTSYA, A.; RUML, T.; HYDE, K. D. Antimicrobial activity of some saprobic fungi isolated from Magnolia liliifera and Cinnamomum iners leaves. Mycology, v. 4, n. 2, p. 82-84, 2013. MOREIRA, M. G. Diversidade e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos associados à Araucaria angustifólia (Bertol.) O., Kuntze. Ouro Preto: UFOP, 2013. 68f. Dissertação (Mestre em Biotecnologia) – Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, Núcleo de pesquisa em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, 2013. OSONO, T. Endophytic and epiphytic phyllosphere fungi of Camellia japonica: seasonal and leaf age-depend variations. Mycologia, Japão, v. 100, n. 3, p. 387-391, 2008. OKI, Y.; SOARES, N.; BELMIRO, M. S.; JUNIOR, A. C.; FERNANDES, G. W. Influência dos fungos endofíticos sobre os herbívoros de Baccharis dracunculifolia (Asteraceae). Neotropical Biology and Conservation, Minas Gerais, v. 4, n. 2, p. 83-88, ago. 2009. PES, M. P. Metabólitos secundários obtidos de Diaporthe sp. aplicados para o controle de plantas daninhas. Santa Maria: UFSM, 2015. Dissertação (Mestrado em Engenharia Agrícola) – Programa de Pós-graduação em Engenharia Agrícola, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, 2015 PIMENTEL, I. C.; FIGURA, G.; AUER, C. G. Fungos endofíticos associados a acículas de Pinus taeda. Summa Phytopathol, Botucatu, v. 36, n. 1, p. 85-88, 2010.
47
PITTAYAKHAJONWUT, P; SOHSOMBOON, P.; DRAMAE, A.; SUVANNAKAD, R.; LAPANUN, S.; TANTICHAREON, M. Antimycobacterial substances from Phaeosphaeria sp BCC8292. Planta Med., Tailândia, v. 74, p. 281-286, 2008 PUTZKE, J.; PEREIRA, A. B. Phaeosphaeria deschampsii (Ascomycota): A new parasite species of Deschampsia antarctica (Poaceae) described to Antarctica. Anais da Academia Brasileira de Ciências, v. 88, n. 3, p.1967-1969, 2016 QUEISSADA, D. D.; SILVA, F. T.; PENIDO, J. S.; SIQUEIRA, C. D.; PAIVA, T. C. B. Epicoccum nigrum and Cladosporium sp. for the treatment of oily effluent in an air-lift reactor. Brazilian Journal of Microbiology, v. 44, n. 2, p. 607-612, 2013. RAVEN, Peter H.; EVERT, Ray F.; EICHHORN, Susan E. Biologia Vegetal. 8. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2014. p. 876. RODRIGUES, R. L. Fungos endofíticos associados à Vellozia compacta Mart. Ex Schult F. (Velloziaceae) presente em afloramentos rochosos nos estados de Minas Gerais e Tocantins. Ouro Preto: UFOP, 2010. 70f. Dissertação (Mestre em Ecologia de Biomas Tropicais) – Programa de Pós-graduação em Ecologia de Biomas Tropicais, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2010. RUSSEL, J. R.; HUANG, J. ANAND, P.; KUCERA, K.; SANDOVAL, A. G.; DANTZLER, K. W.; HICKMAN, D.; JEE, J.; KIMOVEC, F. M.; KOPPSTEIN, D.; MARKS, D. H.; MITTERMILLER, P. A.; NÚÑEZ, S. J.; SANTIAGO, M.; TOWNES, M. A.; VISHNEVETSKY, M.; WILLIAMS, N. E.; VARGAS, M. P. N.; BOULANGER, L.; BASCOM-SLACK, C.; STROBEL, S. A. Biodegradation of Polyester Polyurethane by endophytic fungi. Applied and Environmental Microbiology, v. 77, n. 17, p. 6076-6084, set. 2011. SACHS, P. J. D.; NEVES, C. S. V. J.; CANTERI, M. G.; SACHS, L. G. Escala diagramática para avaliação da severidade da mancha branca em milho. Summa Phytopathol, Botucatu, v. 37, n. 4, p. 202-204, 2011. SEBASTIANES, F. L. S. Diversidade genética e potencial biotecnológico de fungos endofíticos de manguezais do estado de São Paulo. Piracicaba: USP, 2010. 151 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Escola superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2010. SILVA, R. R.; COELHO, G. D. Fungos: principais grupos e aplicações biotecnológicas. Instituto de Botânica, São Paulo, p. 1-20, out. 2006. SILVA, K. S.; REBOUÇAS, T. N. H.; LEMOS, O. L.; BOMFIM, M. P.; BOMFIM, A. A.; ESQUIVEL, G. L.; BARRETO, A. P. P.; SÃO JOSÉ, A. R.; DIAS, N. O.; TAVARES, G. M. Patogenicidade causada pelo fungo Colletotrichum gloeosporioides (Penz) em diferentes espécies frutíferas. Ver. Bras. Frutic., Jaboticabal, v. 28, n. 1, p. 131-133, abril 2006.
48
SILVA, G. H.; OLIVEIRA, C. M. de; TELES, H. L.; BOLZANI, V. S.; ARAÚJO, A.R.; PFENNING, L. H.; YOUNG, M. C. M.; COSTA-NETO, C. M.; HADDAD, R.; EBERLIN, M. N. Citocalasinas produzidas por Xylaria sp., um fungo endofítico de Piper aduncum (PIPERACEAE). Quim. Nova, São Paulo, v. 33, n. 10, p. 2038-2041, 2010. SOUZA, A. Q. L. de; SOUZA, A. D. L. de; ASTOLFI FILHO, S.; BELÉM PINHEIRO, M. L.; SARQUIZ, M. I. de M.; PEREIRA, J. O. Atividade antimicrobiana de fungos endofíticos isolados de plantas tóxicas da Amazônia: Palicourea longiflora (aubl.) rich e Strychnos cogens bentham. Acta Amazonica, Amazonas, v. 34, n. 2, p. 185-195, 2004. TELES, A. M. Contribuição ao estudo taxonômico da tribo Asteraceae no Brasil e Senecioneae (Asteraceae) no estado de Minas Gerais. Belo Horizonte: UFMG, 2008. p. 256. Tese (Doutorado em Biologia Vegetal) - Programa de Pós-Graduação em Biologia Vegetal, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2008. TELES, A. M.; STEHMANN, J. R. Flora da Serra do Cipó, Minas Gerais: Asteraceae – Senecioneae. Bol. Bot. Univ, São Paulo, v. 29, n.1, p. 57-68, 2011. THOMPSON, F. L.; OLIVEIRA, V. M. de. Taxonomia Microbiana. Brasil: CRIA, 2005. p. 35. TUTTOBELLO, L.; FOPPEN, F. H.; CARILLI, A. Growth and pigmentation of Epicoccum nigrum in submerges culture. Applied microbiology, v. 17, n. 6, p.847-852, jun. 1969. VERKLEY, G. J. M.; SILVA, M.; WICKLOW, D. T.; CROUS, P. W. Paraconiothyrium, a new genus to accommodate the mycoparasite Coniothyrium minitans, anamorphs of Paraphaeosphaeria, and four new species. Studies in Mycology, v. 50, p. 323-335, 2004. WACULICZ-ANDRADE, C. E. Variabilidade genética de fungos do gênero Colletotrichum de plantas cítricas e da vegetação espontânea. Curitiba: UFP, 2009. 79f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Programa de Pós-Graduação em Genética, Departamento de Genética, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 2009. WEHMEYER, L. E. A biologic and phylogenetic study of stromatic Sphaeriales. American Journal of Botany, v. 13, p. 574-645, 1926. WIJERATNE, E. M.; CARBONEZI, C. A.; TAKAHASHI, J. A.; PIERSON, E. E.; PIERSON III, L. S.; VANETTEN, H. D.; WHITESELL, L.; BOLZANI, V. S.; GUNATILAKA, A. A. L. Isolation, optimization of production and structure-activity relationship studies of Monocillin I, the cytotoxic constituent of Paraphaeosphaeria quadriseptata. The Journal of antibiotics, v. 57, n. 8, p. 541-546, aug. 2004. WONG, M. K. M.; GOH, T.; HYDE, K. D. Paraphaeosphaeria schoenoplecti sp. nov. from senescente culms of Schoenoplectus litoralis in Hong Kong. Fungal Diversity, v. 4, p. 171-179, 2000.
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