UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE …...Roteiro da Aula 5 (cap. 8 e 9) • O que são...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR, EMBRIOLOGIA E GENÉTICA

2019-1

Profª Drª Ilíada Rainha de Souza

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR, EMBRIOLOGIA E GENÉTICA

2019-1

Profª Drª Ilíada Rainha de Souza

Griffiths et al., 2009: (biblioteca Universitária, Xerox)

Cap. 8 – Transcrição e processamento

Cap. 9 -- Proteínas e sua síntese (Tradução)

Klug et al., 2009, cap.11, 14 e 15

Alberts et al., 2008, cap.6

Complementares:

Principal (indicada):

Anthony Griffiths; Susan Wessler; Richard Lewontin; Sean Carroll.

Menks Ribeiro, 2009

(Moodle).

Roteiro das Aulas 05 e 06 (cap. 8 e 9)

• O que são genes? E o genoma?

• Estrutura de gene

• Região promotora

• Região transcrita (Íntrons e Éxons)

• Regiões reguladoras

• Transcrição

• Processamento do RNA [quepe (cap), cauda poli-

A e encadeamento (splicing)]

Processamento alternativo do RNA (íntron →

éxon)

• Tradução (→ teórico-prática)

• Regulação da tradução

GENOMAS E SUAS

CARACTERÍSTICAS

Como estão Organizados os

Genomas de diferentes espécies?

...e como é a Estrutura dos Genes ?

Hipótese:

Relação do tamanho do Genoma e

a complexidade do organismo

Constatação....

Mus musculus

TAMANHO

DO

GENOMA

(pb)

Escherichia coli Amoeba dubia

2.500.000.000 pb 2.900.000.000 pb

4.639.221 pb 670.000.000.000 pb

Frittilaria assyriaca

120.000.000.000 pb

Homo sapiens

12/ 1.000.000 pb 9,3/ 1.000.000 pb

950/ 1.000.000 pb > 90/ 1.000.000 pbnd

DENSIDADE

DO

GENOMA

(genes/Mb)

Mus musculus

Escherichia coli Amoeba dubiaFrittilaria assyriaca

Homo sapiens

Genomas

• Grande variedade de tamanho eorganização

• O tamanho do genoma é medido pelasua quantidade de DNA: C (haplóide)

• O tamanho do genoma não se correlaciona com complexidade

→ paradoxo do valor de C

• Região de 65 kilobases (65.000 pares de bases) de DNA é ilustrada para

cada organismo. A região que codifica para a maior subunidade da RNA

polimerase (RNA pol II para as células eucariontes) está indicada em

vermelho.

• Notar como o no de genes codificados dentro do mesmo comprimento

de DNA diminui a medida que a complexidade do organismo aumenta.

Comparação da densidade gênica nos cromossomos para

diferentes organismos:

Tamanhos aproximados (em quilobases),

espaçamento de genes e o número total de genes

em vários organismos representativos

Número total de genes ~ 3.200

Número total de genes ~ 6.300

Número total de genes ~ 13.600

Número total de genes ~ 25.000

O que

são os

genes?

Dogma

central

da

Biologia

Molecular

O que é um gene?

Dogma

central

da

Biologia

Molecular

O que é um gene?

EUCARIOTOS X PROCARIOTOS

Semelhanças

e diferenças

Procariotos

Região codificadora: contém a informação para o produto

do gene (geralmente uma proteína).

Regiões regulatórias: contém sequências reconhecidas e

ligadas por proteínas que determinam a transcrição e

influenciam a quantidade de RNA transcrito.© 1999 by W. H. Freeman and Company

Esquema de um gene procarioto

Promotor: Sítio de ligação da RNA Polimerase (transcrição)

+1 = início de transcrição

RBS = sítio ligador ao ribossomo;

ATG = códon de iniciação da síntese protéica;

Cds ou ORF = seq. codificadora da proteína ou quadro aberto

de leitura (open reading frame);

STOP = qualquer um dos três códons de finalização

da síntese proteica (tradução);

terminador = região terminadora da transcrição

Estrutura típica de um gene procarioto

DNA

+1

mRNA transcrito do gene

Estrutura típica de um gene procarioto

mRNA transcrito do gene

UTR = untranslated

region

(região não traduzida)

Estrutura típica de um gene procarioto

mRNA transcrito do gene

5'-UTR

contém

o RBS

UTR = untranslated

region

(região não traduzida)

3'-UTR

grampo de

terminação

Estrutura típica de um gene procarioto

mRNA transcrito do gene

5'-UTR

contém

o RBS

3'-UTRgrampo de

terminação

Estrutura típica de um gene procarioto

amino-terminal (N) (C)

carboxi-

terminal

Região codificante

mRNA transcrito do gene

5'-UTR

contém

o RBS

3'-UTR

grampo de

terminação

UTR = untranslated

region

(região não traduzida)

Estrutura típica de um gene procarioto

amino-

terminal (N)carboxi-

terminal (C)

Região codificante

In:http://departments.oxy.edu/biology/Franck/Bio130S_2002

Um promotor regula a transcrição de vários genes ao

mesmo tempo

Um promotor regula a transcrição de um único gene

Alberts et al. 2010, Fig 6-3

Os genes podem ser expressos sob diferentes

taxas.

PROPRIEDADES DO RNA

Geralmente unifilamentar (+ flexível)

Tem ribose

Tem uracila (U)

Pode catalisar reações (ribozimas)

5’

3’

• Cadeia de polirribonucleotídeos.

• Ligação fosfodiéster é a mesma que ocorre no DNA.

• Moléculas de DNA em torno de milhões de pb e de

RNA apenas milhares de pb ( ≠ ).

RNA-polimerase catalisa ligações fosfodiéster formando uma cadeia linear 5’-3’

Substratos trifosfatos de ribonucleosídeo

Alberts et al. 2010, Fig 6-8

Enzimas polimerases apareceram duas vezes na evolução

INICIAÇÃO

Ponto chave da regulação gênica!

PROCARIOTOS

A RNA-polimerase (uma única) é composta de várias subunidades, alfa, beta e

ômega (2α, β, β’, ω) e o fator sigma (σ)

Apoenzima (enzima base) + fator sigma = holoenzima RNA-polimerase

PROMOTOR: sequência especial no DNA que

indica o ponto de início de transcrição onde o

fator sigma se liga firmemente. Há uma ampla

gama de promotores + fortes ou + fracos.

TTGACAT TATAAT

Sequências de

consenso para todas as

sequências promotoras

de E.coli

Fortes sequências promotoras de E.coli

Sequências promotoras de diferentes

genes bacterianos

Alberts et al. 2010, Fig 6-11

TRANSCRIÇÃO

Alberts et al. 2010, Fig 6-11

Funções da RNA

polimerase ?

TRANSCRIÇÃO

Alberts et al. 2010, Fig 6-11

TRANSCRIÇÃO

1. Reconhecer a região promotora

2. Desnaturar o DNA expondo a

seqüência a ser copiada

3. Manter as fitas de DNA

separadas na região da síntese

Alberts et al. 2010, Fig 6-11

4. Separação do fator σ da RNA

polimerase

5. Manter o híbrido DNA:RNA

estável

6. Renaturar o DNA na região

imediatamente posterior à

síntese

TRANSCRIÇÃO

Alberts et al. 2010, Fig 6-11

TRANSCRIÇÃO

7. Terminar a síntese do RNA

• Reconhecer a região promotora

• Desnaturar o DNA expondo a sequência a

ser copiada

• Manter as fitas de DNA separadas na região

da síntese

• Manter o híbrido DNA:RNA estável

• Renaturar o DNA na região imediatamente

posterior à síntese

• Terminar a síntese do RNA

Funções da RNA polimerase:

TÉRMINO

As sequências de TERMINADORES são muito mais heterogêneas do que as de

PROMOTORES ➔ potencial de formar estruturas em grampo (ex: 5’CCCG...CGGG 3’)

Lewin. Genes IX, Fig 11.45-46

Lewin. Genes IX, Fig 7.13

Transcrição e tradução altamente

relacionadas nas bactérias (quase

simultâneos)

Alberts et al. 2010, Fig 6-14

Sentidos de transcrição de uma pequena porção de genes bacterianos

Se uma molécula de DNA for transcrita e uma das fitas seja

5’- CAATTTGGTTATGCCC - 3’ ... (não molde para o RNA), qual será a

sequência 5’-3’ do RNAm transcrito?

EXERCÍCIO:

Roteiro da Aula 5 (cap. 8 e 9)• O que são genes? E o genoma?

• Estrutura de gene

• Região promotora

• Região transcrita (Íntrons e Éxons)

• Regiões reguladoras

• Transcrição em Procariotos e

Transcrição em Eucariotos

• Processamento do RNA [quepe (cap), cauda poli-

A e encadeamento (splicing)]

Processamento alternativo do RNA (íntron →

éxon)

TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS

Alberts et al. 2010, Tab 6-2

-DNA nuclear de eucariotos é linear e empacotado através de histonas vs DNA

bacteriano que é circular e não associado a histonas;

✓Associação das duas fitas com proteínas - histonas

Estrutura Terciária do DNA

em EUCARIOTOS

( ) Cromossomos em

metáfase: Maior grau de

condensação (10.000x)

( ) Compactação em

intérfase (500x)

( ) Cada cromátide é uma

molécula de DNA

COMPACTANDO

O DNA –

complete as

lacunas:

( ) DNA descompactado

2

1

3

4

5

67

8

9

( ) Solenoide

( ) Histona H1

( ) Nucleossomo( ) cauda N-terminal de

histona

( ) Tetrâmero de

histonas H3-H4EXERCÍCIO

10

EUCARIOOS

-RNA-polimerase tem 3 formas (semelhantes à única polimerase bacteriana)

GTFs ajudam 1) a posicionar a RNA-polimerase sobre o promotor, 2) a separar

as 2 fitas de DNA e 3) a liberar a RNA-polimerase do promotor

TFII = fatores de transcrição da polimerase II (TFII B, TFII D, TFII E, TFII F

(mesma estrutura do fator sigma), TFII H, TFII I).Alberts et al. 2010, Tab 6-2

Forma Produto

RNA-polimerase I rRNA (ribossômico)

RNA-polimerase IImRNA (mensageiro),

snRNA (small nuclear)

RNA-polimerase IIIrRNA 5S, tRNA

(transportador)

RNA-polimerase em Eucariotos:

-RNA-polimerase precisa de vários Fatores Gerais de Transcrição (GTF) vs

único fator sigma (procariotos)

-DNA nuclear de eucariotos é linear e empacotado através de histonas vs DNA

bacteriano que é circular e não associado a histonas;

TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS

COMPLEXO DE INICIAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO

(in vitro)

Alberts et al. 2010, Fig 6-16

• TFIID = Fator de Transcrição (TF) da RNA

polimerase II

• TBP = proteína de ligação à região TATA boxe

COMPLEXO DE INICIAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO

(in vitro)

Alberts et al. 2010, Fig 6-16

TBP = TATA-binding protein

TATA box

(-25)

COMPLEXO DE INICIAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO

(in vitro)

Alberts et al. 2010, Fig 6-16

TFIID = Fator de Transcrição da RNA polimerase II

TFIIB = segundo “ “ liga-se ao DNA

COMPLEXO DE INICIAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO

(in vitro)

Alberts et al. 2010, Fig 6-16

TFIID = Fator de Transcrição da RNA polimerase II

TFIIB = segundo “ “ liga-se

TFIIE, TFIIH = próximos fatores a ligarem-se à

região. A seguir TFIIF e outros fatores ligam-se à

polimerase que se unem ao complexo de pré-

iniciação.

CTD = domínio C-terminal = 52 repetições de 7 aa,

que sofre fosforilação na cauda de carboxila.

COMPLEXO DE INICIAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO

(in vitro)

Alberts et al. 2010, Fig 6-16

Alberts et al. 2010, Fig 6-19

• Há neste complexo de iniciação de transcrição proteico + de 100 subunidades

• A RNA-polimerase II precisa se liberar do complexo para polimerizar

• Depois ela se move “aos saltos” com ajuda de fatores de extensão que mantém

a associação polimerase-DNA

O processo é ainda + complexo in vivo!!!

Fatores de transcrição e RNA polimerase II

https://www.youtube.com/watch?feature=endscreen&NR=1&v=5MfSYnItYvg

Região promotora e transcrição

Sítio de início da

transcrição

início da transcrição

(+1)

[ https://www.youtube.com/watch?v=icZjgZozkB8 ]

COMPLEXO DE INICIAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO

(in vitro)

Alberts et al. 2010, Fig 6-16

https://www.youtube.com/watch?v=WsofH466lqk

(North Dakota State University)

Griffiths et al. Figura 8.2

Promotores: Sequência da região 5’ antes do ponto de início da

transcrição, região codante do gene, onde fatores de

transcrição (proteínas e/ou RNAs) e a RNA

polimerase se ligam para dar início à transcrição.

TATA box: Sequência conservada, encontrada na promotora a

cerca de 25 a 30 pb anterior (5’) do sítio de iniciação da

transcrição, e onde se ligam complexos proteicos.

Enhancer: É uma sequência de DNA próxima a região promotora que

é capaz de aumentar a capacidade desta.

Regiões reguladoras da transcrição

Início da Transcrição: É determinado por duas sequências curtas

localizadas aproximadamente nos

nucleotídeos -35 (aproximadamente 20 pares

de bases da região TATA box) e -10, onde a

polimerase se liga. Ocorre antes do AUG de

início da Tradução. Estas sequências são

bastante conservadas, assim como o

espaçamento.

Regiões reguladoras da transcrição

Modificações

co- e pós-

transcrição

5’

5’ 3’

Quepe 5’ (Cap 5’): Estrutura de 7-metilguanosina adicionada aos mRNA

eucarióticos após a transcrição; auxilia na estabilidade

da molécula e na iniciação da síntese protéica,

podendo servir também de proteção.

Cauda Poli-A: Parece ter várias funções: (1) auxilia na exportação do

RNAm maduro para o citoplasma; (2) afeta a estabilidade

do mRNA; (3) parece servir como um sinal de

reconhecimento para o ribossomo. A cauda poli-A em

combinação com o quepe 5’ mantém a conformação

secundária circular da molécula de mRNA ativa e permite

ao ribossomo determinar se o mRNA está intacto.

Processamento do RNA co-transcricional

PROCESSAMENTO

DO RNA PÓS-

TRANSCRIÇÃO

(SPLICING)

Gene HBB - Hemoglobina

Íntron 1

Íntron 2

TCAAAAGGTAGGCA

AAATAAGGTGAGCC

AGCTCAGGTACAGA

CCTGCCAGTAAGTT

ACAAATGGTAAGGT

GACTGAGGTATATG

TGAGAGGTATGGC

GCTCTAGACAACT

ATTACAGGTTGTT

TATTCAGTGTGGC

TTTACAGGAATAC

CTTAAAGGAATTA

GCTCAAGCAAGAA

CTTGCAGCTTGAG

Íntron A

Íntron B

Íntron C

Íntron D

Íntron E

Íntron F

Íntron G

Éxon 2...

Éxon 3...

Éxon 4...

Éxon 5...

Éxon 6...

Éxon 7...

Éxon 8...

....Éxon 1

....Éxon 2

....Éxon 3

....Éxon 4

....Éxon 5

....Éxon 6

....Éxon 7

Transcrição5’ 3’

gGTaag

“gGUaag”

cAGgSequências permitidas:

Sítio doador Sítio aceptor

Comparação entre sequências nos limites éxon-íntron do gene da albumina

Processamento do RNA pós transcrição

Splicing ou processamento do RNA transcrito

primário

Sequência transcrita em RNA e é mantido na molécula

funcional (mRNA), após o processamento (splicing). A união

dos éxons monta a região codificadora, assim como a 5’UTR e

3’UTR (todas presentes no mRNA maduro).

Íntrons:

Exón:

Sequência transcrita, portanto presente no pré-mRNA, mas

removida durante o processamento, não estando presente na

molécula de mRNA madura. Para isto as regiões que flaqueiam

os íntrons (ou éxons) são ligadas, formando o RNAm maduro.

Um gene pode conter um grande número de íntrons e estes

podem ser bem maiores que a região contida nos éxons.

Processamento do RNA pós transcrição

Junção de splicing: Sequência de DNA que cerca o limite entre um éxon

e um íntron. Há um grau de conservação nestas

regiões, permitindo a identificação e remoção

correta dos íntrons.

Splicing: Processo que ocorre durante a maturação do mRNA

eucariótico, onde ocorre a remoção de íntrons e a união dos

éxons. É o mesmo que processamento do mRNA.

Processamento do RNA pós transcrição

Conceitos de Genética – William S. Klug, Michael R. Cummings, Charlotte A. Spencer & Michael A. Palladino

(a) Interação de guanosina , a

qual age como co-fator de reação

com o transcrito primário;

(b) Grupo 3’ OH da guanosina é

transferido para o nucleotídeo

adjacente à extremidade 5’ do

íntron;

(c) E à extremidade 3’ do íntron;

(d) O íntron é removido e as

regiões dos dois éxons são

ligadas , levando ao ribossomal

Pré- RNA

ribossomal

RNA ribossomal

maduro

transcrito

primário

Splicing

O splicing consiste na retirada dos íntrons de umRNA precursor (heterogêneo nuclear - hnRNA), deforma a produzir um mRNA maduro funcional.

Essa excisão dos íntrons do mRNA é um eventomuito importante e requer uma extrema precisãodas enzimas envolvidas no processo (smallnuclear RNAs - snRNAs).

A falta ou o acréscimo de um único nucleotídeo emum éxon pode levar a uma alteração da fase deleitura e a produção de uma proteínacompletamente diferente da original.

Processamento após Transcrição

Conceitos de Genética – William S. Klug, Michael R. Cummings, Charlotte A. Spencer & Michael A. Palladino

Modelo de remoção de

íntrons do pré-mRNA de

origem nuclear no

mecanismo de

encadeamento (splicing):

A excisão depende de

cinco pequenas

riboncleoproteínas

nucleares (snRNP- snurps)

que são complexos de

proteínas e um dos 5

snRNAs (U1,U2, U4, U5,U6),

as quais atuam como parte

integrante de uma grande

estrutura chamada

spliceossomo.

A estrutura em laço é típica

desse mecanismo.

mRNA

Pré- RNA

mensageiro

Do Transcrito Primário à Proteína

[ ~1800 nucleotídeos]

(5 +2)

A guaniltransferase adiciona 7-

metilguanosina (cap = quepe)

Cauda poli-A:

150 a 200 nc

PR

OC

ES

SA

ME

NT

O

Remoção do Íntron por

snRNA

PROCESSAMENTO

ALTERNATIVO

(SPLICING)

Figure 8-14 Padrão complexo de splicing de mRNA em eucariontes. O transcrito pre-

mRNA do gene α-tropomiosina é alternativamente processado em diferentes tipos de

células. As caixas verdes claras ( , entre os números) representam íntrons e as

outras cores de caixas representam éxons. Poliadenilações são indicadas por um A.

Linhas pontilhadas nos mRNAs maduros são indicações de regiões removidas por

splicing. TM = tropomiosina. ( J. P. Lees et al., Molecular and Cellular Biology 10, 1990,

1729 – 1742).

- o mecanismo que pode explicar a enorme diferença

entre o tamanho modesto do conjunto de genes

humano e a elevada complexidade do proteoma.

-Estima-se que mais de 50% dos genes humanos são

alternativamente processados

- Alguns genes podem gerar muitas isoformas de

proteínas por eventos complexos de splicing

alternativo.

-A análise do transcriptoma (conjunto de mRNAs do ser

vivo ou da célula em estudo) poderá ajudar a decifrar

splicing alternativo.

Splicing ou processamento alternativo

Mais correto dizer:

Éxons → sequências que permanecem no RNA após a

remoção dos íntrons

Splicing alternativo???

O que é éxon em um momento pode ser íntron em outro

momento e vice-versa

É preciso estar alerta sobre esta dificuldade conceitual,

que de fato não tem solução

Os Exons

(Donadi et al., 2011)

44 alelos14 variantes protéicas(Robinson et al., 2006)

Exemplo de processamento alternativo

HLA-G

MECANISMOS DE

RNA DE

INTERFERÊNCIA

RNAi (RNA interferente ou RNA deinterferência)

é um mecanismo exercido por moléculasde RNA complementares a RNAs mensageiros,as quais inibem a expressão gênica na fasede tradução ou dificulta a transcriçãode genes específicos...

TRANSCRIÇÃO X REPLICAÇÃO

(S = semelhança / D = diferença)

• complementariedade por pareamento de bases (S)

mas com U ao invés de T (D)

• síntese a partir de DNA (S)

• só uma fita do DNA de cada gene é molde,

dependendo do promotor (D)

• o RNA não fica ligado ao molde ➔ muitas cópias (+

1000 / h / gene) (D)

• 1 molécula de DNA = milhões pb; 1 molécula de

RNA ≤ milhares de bases (D)

• Síntese de RNA não há primer ➔ RNA polimerase

erra 1000 X mais que a DNA polimerase (D)

Depois da aula é

a hora de ver o

que vc

aprendeu...

Complete os

exercícios

que estão

no moodle !!

Faça os

exercícios para

comentários

na próxima

aula!!

Griffiths et al., 2009: (biblioteca

Universitária, Xerox)

Cap. 8 –Transcrição e processamento

Cap.9 - Proteínas e sua síntese (Tradução)

Klug et al., 2009,

cap.11, 14 e 15

Alberts et al., 2008,

cap.6

Complementares:

Literatura indicada:

Griffiths et al., 2009

Menks Ribeiro, 2009

Moodle.

TRANSCRIÇÃO

Animação:

• https://www.youtube.com/watch?v=SMtWvDbfHLo(AVANÇADO) - DNA Learning Center ... 22 de mar de 2010

• https://www.youtube.com/watch?v=XzVXhemtwmA (Oxford

University press).

• https://www.youtube.com/watch?v=so3G_kI1PVw

(by Canadian Museum of Nature)

• https://www.youtube.com/watch?v=gG7uCskUOrA

– transcrição e tradução (Oxford University, 2014).

• https://www.youtube.com/watch?v=vi-zWoobt_Q

- Regulação da Transcrição (North Dakota State University )

MATERIAL COMPLEMENTAR:

PROCESSAMENTO DO RNA

Animação (Jack Slater)

• https://www.youtube.com/watch?v=DoSRu15VtdM

(cap e cauda poli-A)

• https://www.youtube.com/watch?v=o0BQJbLNYSg

(splicing)

• https://www.youtube.com/watch?v=28mgfg8nRT4

• https://www.youtube.com/watch?v=gG7uCskUOrA

(Publicado em 7 de jan de 2015)