Strukturbasiertes phage display. Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Institut für...

Strukturbasiertes

phage display

Martin-Luther-UniversitätHalle-Wittenberg

Institut für Biotechnologie

Arbeitsgruppe Proteintechnologie

Ulrike FiedlerGerald BöhmRainer RudolphCarola Reimann

Phage display und panning

löslichesProtein

eluierter Phage

Selektionsprozess

Light chain

Heavy chainIntra-chain-disufide bonds

Inter-chain disulfide bond

Active site

Active site

VK VKVH VH

CK CKCH1

CH3

CH2

CH1

CH3

CH2

Structure of Antibody Molecules

Complete antibody

IgG molecule Catalytic antibody

Application of Antibodies

Diagnostics

Therapy

Monitoring

Purification

tumour diagnosisELISA

cancer

detection and quantificationof bacteria, toxins, viruses, pesticides

affinity chromatographybioremediation

Antibodies

Affinity

Specificity

Size

Immunogenicity

Low stability

Advantages Disadvantages

Phagenspezies für das phage display

filamentöse Phagen lytische Phagen

periplasmatisch zytoplasmatisch

Plasmamembran

äußere Membran

Expression in der E. coli-Zelle

Verwendung von single-chain FvAntikörpern beim phage display

VKVH

Anwendungen des phage display-Systems

Display natürlicher Peptide: Epitop-Mapping von Antikörpern

Herstellung von Immunogenen

Display von Random-Peptiden: Epitop-Mapping von Antikörpern

Identifizierung von Peptid-Liganden

Mapping der Substratbindungsstelle

von Proteasen und Kinasen

Display von Proteinen und Isolierung von hoch-affinen Antikörpern

Protein-Domänen: cDNA Expressions-Screening

directed Evolution

Cytochrome b562TendamistatZ-Domäne vomProtein A

Cys2His2-Zink-Finger

Scaffolds für das phage display

Zn

Ziel des Projektes

Design eines stabilen Proteins mit Bindungseigenschaften

Anforderungen an das Scaffold-Protein:

- kleines Protein

- hohe Stabilität

- geringe Immunogenität

Das Augenlinsenprotein Gamma-Kristallin -

ein scaffold für das phage display?

sehr stabiles Protein

kleines Protein

kaum immunogen

Kristallstruktur vorhanden

174 Aminosäuren

2 Domänen

4 -Faltblätter mit jeweils 4 -Strängen (greek-keay)

Eigenschaften des Gamma-Kristallins

Gamma-Kristallin als scaffold:

stabiles Protein ohne Bindungseigenschaften

Solvent Accessibility

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Acc

essi

bili

ty (

% o

f m

ax.)

Residues 1-85 (N-terminal domain)

2

4

6

15

1719

36

38

“Inside”

“Outside”

(Glu

) 7

(Ph

e) 5

(Ile) 3

(Th

r) 4

(Ly

s)

2

(Gly

) 1

(Ty

r) 6

(Tyr) 1

6

(Cy

s) 1

8

(Se

r) 1

9

(Glu

) 1

7

(Cy

s)

15

(His

) 1

4

Sequence Variability

(As

p)

38

(Se

r) 39

(Va

l) 37

(Se

r) 34

(Ile) 3

5

(Arg

) 3

6

Mutagenese im -Faltblatt

Ser 19

MutagenisiertePositionen:

Lys 2Thr 4Tyr 6Cys 15Glu 17Ser 19Arg 36Asp 38

Anzahl der möglichenVarianten:208 = 2.6 E+10

Ort der Mutagenense

Oberfläche des Gamma-Kristallins: 9122 Å2

Mutagenisierter Bereich: 560 Å2 = 6,1%

Konstruktion einer kombinatorischenGamma-Kristallin-Bank

Design der Oligonukleotide

Assemblierung

Klonierung

Expression and Selektion

X X X

X X

X X

X

XXX XXX XX

X

Assemblierung der Oligonukleotide

X X X X XX X

XXX

Assemblierung an der Festphase

SA-coated paramagnetic bead XXX

Kodon-NutzungN/N/N - 64 Kodone für eine Aminosäure

CAT/N/N - kein Stop-Kodon, kein Cystein,

keine aromatischen Aminosäuren

N/N/K (T or G) - 32 Kodone für eine Aminosäure

Tripletts - 20 Kodone für eine randomisierte Amiosäure

Ergebnisse und Probleme

Herstellung der Bank Größe der Bank

Qualität der eingesetzten Oligo’s

Expression der mutierten Proteinen

Etablierung des phage

display-Systems (scFv)

Bildung des Fusionsproteins Display auf dem Phagen

Gamma-Kristallin-WT-Protein 3 Stabilität der mutierten Proteine

Panning Selektion geeigneter Targets und

panning-Bedingungen

Target Molecules

Haptens oxazolone, abscisic acid, biotin, digoxigenin, testosterone

Proteins BSA, Il4-receptor CEA (carcinoembryonic antigen) tetanus toxoid SH2-domain EGF-receptor

Glycoproteins EGP 2 (epithelial glycoprotein)

Erste Zielmoleküle

Haptene: OxazoloneBiotin

Proteine: BSALysozymCD 44 (Oberflächenprotein bei Krebszellen)

Enzymatische GlucosidaseAktivitäten:

Weiterführende Arbeiten

Gamma-Kristallin-Bänke unter Verwendung

von Triplett-Oligonukleotiden

Display einzelner Gamma-Kristallin-Domänen oder

Gamma-Kristallin-Cystein-Mutanten auf dem Phagen

Untersuchung der Wechselwirkungen mit dem BIACORE

Stabilitätsuntersuchungen

Ausblick

weitere Mutagenesen: loop-Region,

Region zwischen N- und

C-terminaler Domäne

random - DNA-shuffling

Fusion der isolierten Kristallin-Mutanten

mit dem VP1-Molekül (Targeting Modul)

Panning: an lebenden Zellen

(zellspezifische Targeting-Module)