Seminario final de biologia molecular!!

Cristina Cruz AgudeloLaura Fandiño GaviriaEstudiantes medicina

III semestre UPB

INTRODUCTION

ANGIOGENESIS: the sprouting of new capillaries from preexisting blood vessels.

INTRODUCTION

• The angiogenesis is essential for tumor growth and progression, because the tumor growth is angiogenesis – dependent.

• One experimental avenue to understad the control of tumor angiogenesis is to identify and study molecules that have regulatory activity on endothelial cells.

• In this article they have discovered an angiogenesis inhibitor from the conditioned medium of pancreatic β tumor cells and refer to it as

• Beta 35. This protein have a gene segment of bovine transferrin.

• They reported the purification, characterization and anti- tumor activity of this protein.

INTRODUCTION

OBJETIVE

• Prove that Beta-35 is a transferrin-derived inhibitor of angiogenesis and tumor growth

1. PREPARACIÓN DEL MEDIO CONDICIONADO

2. ENSAYO DE INCORPORACIÓN CON TIMIDINA

3. ENSAYO DE MEMBRANA CORIOALANTOIDEA DE POLLO (CAM)

4. PURIFICACIÓN DE BETA-35

MATERIALES Y MÉTODOS

5. MICROSECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS Y DETERMINACIÓN DE LA MASA :

• Degradación automatizada de Edman: Pehr Edman. Secuenciación de aminoácidos en un péptido.

- NO en péptidos con N-terminal bloqueado. - 50% de proteínas lo tienen bloqueado. - Rendimiento no es de 100%. Se obtienen muchos errores.

• Espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida.

Miden el peso electrónicamente. Resultados en espectro de masas . Gráfica de cada molécula,

peso y cantidad.

6. CLONACIÓN, EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES HUMANAS BETA – 35.

• Clonaron y expresaron esta proteína en Escherichia coli utilizando el segmento del gen correspondiente de Beta-35 contenida en el cDNA de humanos de la transferrina .

7. ESTUDIOS EN ANIMALES.• Se realizaron en las instalaciones del hospital

infantil de Boston.• Ratones SCID hembra de 24 – 27 g ,

inmunocomprometidos.- Condiciones .- Alimentación.- Anestesia. (metoxyflurano).

8. TRATAMIENTO DE RATONES PORTADORES DE TUMOR CON BETA 35 INSOLUBLE.

Las células pancreáticas se implantaron

Tumor 100 – 200 mm3, se separaron en 2 grupos

Beta 35 recombinante 5mg/kg/día

16 díasInyecciones similares

Se determinó el volumen del tumor

RESULTADOS

1. Identificación y purificación de Beta-35 del medio condicionado de las células tumorales del páncreas de ratón:

Se cuantificó la inhibición de la Timidina [3H] en el ADN de las células BCE

RESULTADOS

2. Secuencia N-terminal y el análisis de espectrometría de masas Beta-35:

Secuencia DPERTVRWCTISTHEANK(X)ASFREN de Beta-35 es idéntica a la secuencia N-terminal de aminoácido de la transferrina

3. La construcción y purificación de proteínas recombinantes humanas Beta-35 en el sistema de expresión de E. coli :

Con el fin de obtener cantidades suficientes de Beta-35 para iniciar experimentos contra el tumor, clonaron esta molécula mediante la inserción de un segmento de gen humano de Beta-35 en el vector sin secuencia del péptido señal.

RESULTADOS

4. Tratamiento de tumor pancreático y melanoma humano en ratones SCDI con Beta 35 humana recombinante:

La administración sistémica de 5 mg / kg / día de Beta-35 inhibe significativamente el crecimiento de dos tipos diferentes de tumores primarios.

64%

RESULTADOS

DISCUSSIONDISCUSSION

AUTOR REPORTS AGREE / DESAGREE

M.S. O’Reilly et al

The potent angiogenesis inhibitor, Angiostatin is a proteolytic product of endogenous proteins which in his intact form isn´t anti-angiogenic

AGREE

M.S. O’Reilly et al

The potent angiogenesis inhibitor, Endostatin is a proteolytic product of endogenous proteins which in his intact form isn´t anti-angiogenic

AGREE

DISCUSSION

AUTOR REPORTS AGREE / DESAGREE

M.S. O’Reilly et al

The potent angiogenesis inhibitor, cleaved antithrombin III is a proteolytic product of endogenous proteins which in his intact form isn´t anti-angiogenic

AGREE

M.F. CarlevaroThe intact form of the transferrin has been reported to be angiogenic DISAGREE

CONCLUSIONES

• This study opens a new window to cancer therapy.

• This type of study encourages us to research on the subject and move toward cure of the disease.

• The tumors have multiple causes and we need to know about these to intervene effectively.

• The reason of medicine is unstoppable search for patient welfare

GRACIAS