Quantitative analysis of bovine cytokine mRNA levels in response to tick infestation

Quantitative analysis of bovine cytokine mRNA levels in response

to tick infestation.

Objectif

• Qualifier et quantifier le type de cytokines induites par la piqûre de tique et leur impact sur l’orientation de la réponse immune.

Les tiques

• Famille des acariens• Ixodides: parasite strictement hématophage,

intermittent• fixation via le rostre et la sécrétion de cément• Prise du repas sanguin: injection de salive, un seul

repas à la fois qui dure 3-15 j en moyenne chez le femelle

• Détachement suite à la lyse du cémentŒuf Larve nymphe adulte

Pathogénie des tiques

• Risque d’ anémie intense par pompage du sang• Transmission des parasites unicellulaires du sang:

Piroplasmes et eperythrozoons• Inoculation de nombreux microbes: fièvre Q,

maladie de Lyme• Vecteur de :

– Maladies abortives: brucellose, chlamydiose, salmonellose

– Border disease et la maladie des muqueuses– Maladies virales: leucose bovine, maedi et CAEV

Les tiques

• Rhipicephalus– Cycle à 2 hôtes: la larve engorgée reste sur

l’hôte et y mue en nymphe et vit son stade adulte sur une autre hôte

– R. sanguineus: vecteur de B. canis et de Ehrlichia canis

Les tiques

• Ixodes– cycle à 3 hôtes: après chaque repas, l’acarien

quitte l’hôte et mue avant de regagner un nouvel hôte. Cycle très long (jusque 3 ans) mais le séjour sur l’hôte est bref.

Les tiques chez les bovins

• Boophilus:– Tiques non ornementées à 1 hôte plus facile à contrôler

– Cycle à 1 hôte: les 3 stades et les 2 mues se déroulent sur le même animal cycle court mais séjour prolongé sur l’hôte

– Vecteur de * babésiose tropicale (B. bovis et B. bigemina)

* anaplasmose (A. marginale)

• Boophilus:

• B. microplus: 1300 larves parvenant au stade femelle gorgée perte de 1kg de PV

Les cytokines

• les cellules TH1 sécrètent les interleukines

- IL-1 - IL-2

- IL-8 - IL-12

- IFN-gama - MCP-1

• les cellules TH2 sécrètent les interleukines

- IL-4 - IL-5

- IL-6 - IL-9

- IL-10 - IL-13

L’impact des tiques

• Les tiques ont un impact certain sur l’économie d’un pays tel que le Brésil dont le PIB est très influencé par l’élevage bovin.

• 0,5 à 1,5 milliards par an.

Quelles tiques

• Boophilus est la tique posant le plus de problèmes chez les bovins :– Australie– Mexique à Uruguay + Argentine– Asie du Sud-Est– Zones en Afrique

Zones d’implantation• Les tiques sont

largement distribuées dans les zones d’élevage sensibles.

• Boophilus a atteint toute son aire d’expansion potentielle.

T° = 20 à 30 °C

Hygrométrie = 75 à 95 %

Habitat

• De plus, l’habitat de tiques est fortement influencé par les précipitations.

Impact économique• Les tiques du bétail revêtent un fort impact

économique de part leurs effets directs :– Dommage au cuir

– Prurit

– Réaction inflammatoire

Le repas de sang

dure de 5 à 25 j.

Impact économique• Et indirects :

– Faiblesse

– Diminution de production :

lait et viande

– Décès secondaires aux maladies transmises :

• Babésiose (Boophilus)

• Anaplasmose (Boophilus)

• Theilériose (Amblyoma)

• Cowdriose (Amblyoma)

• Dermatophilose (Amblyoma)

• Ehrlichiose

Animaux touchés

• La sensibilité aux maladies associées aux tiques ou transmises par elles, est très variable

→ réceptivité et capacité immunitaire différentes

• brahmans :– extrême sensibilité à la dermatophilose (maladie bactérienne cutanée à

évolution lente et fréquemment mortelle) – grande résistance aux protozoaires sanguins et aux rickettsies, auxquels

les bovins européens sont par contre très sensibles.

• petits ruminants : sensibles à la dermatophilose d'autant plus sensibles à la cowdriose qu'ils ont été élevés dans une zone indemne d'Amblyomma.

Matériel et méthodes• 1 groupe de 5 veaux Nelore, infestés à 5 mois d’âge.• 1 groupe témoin de 5 veaux Nelore de même âge.

Matériel et méthodes• Des biopsies de peau et de nœuds lymphatiques

sont prélevés 9 jours après l’infestation.

• On procède à une PCR en temps réel afin de définir l’expression des gènes codant pour les molécules suivantes :– IL-2– IL-4– IL-8– IL-12 (sous-unité α35KDa)– MCP-1

Le gène RPL-19 est utilisé pour la normalisation(pas d’influence du traitement).

Matériel et méthodes

• Puis les données sont traitées par analyse de variance puis un test de t-Student.

• Des différences significatives P < 0.1 sont présentes entre les 2 groupes.

PCR• Objectif : amplifier in vitro de l'ADN en tirant parti du mode normal de

synthèse de l'ADN in vivo. • - Chaque brin de l'ADN sert de matrice pour la synthèse du brin

complémentaire. - Si on répète le processus (réaction en chaîne + à chaque cycle, le nombre de molécules double), après 20 cycles on obtient 106fois le nombre d'exemplaires du fragment désiré (soit une quantité de l'ordre du microG. pour une quantité initiale de l'ordre du picoG. !!!). - In vitro : la synthèse de mol. ADN se fait toujours à partir d'une amorce ("primer"). Cette amorce est une courte chaîne nucléotidique (oligonucléotide) nécessaire à l'accrochage de la polymérase. Donc le choix d'un couple d'amorces va déterminer les extrémités de la séquence synthétisée. - procédé révolutionnaire : permet d'obtenir, pour la première fois, sans clônage une amplification considérable d'un fragment donné d'ADN. Gain++en sensibilité et en temps. En pratique...

PCR

• Répétition de cycles comprenant : - la dénaturation :tous les brins d'ADN sont dissociés par la chaleur. - l'hybridation des amorces sur un fragment d'ADN. - l'extension : synthèse des brins à partir des amorces hybridées

Tout se fait dans un seul tube ; seule la température varie grâce à l'emploi de polymérase thermostable

- Attention au choix des amorces oligonucléotidiques, de la température, durée des étapes.

- PCR amplifie toujours de l'ADN génomique ou ADN clôné au préalable.

- - Pour amplifier un fragment à partir d'ARN, +1étape avec la reverse transcriptase.

RESULTATS

• Biopsie de la peau:– MCP-1– IL-2 pas de différence significative

– IL-8

– IL-12p35

– Pas de transcription d’ IL-4 détecté

NB: résultat significatif si P<0.1

RESULTATS

• Dans les nodules:– IL-2 0.5x moins abondant dans le groupe traité– MCP-1 0.3 x moins abondant dans le groupe traité– IL-4 3 x plus abondant dans le groupe traité mais ce résultat n’

est pas significatif (p<0.15)– IL-12p35 pas de différence significative– IL-8

• On observe donc une augmentation des IL-4 sécrétées par les LTH2 induisant le développement d’ une réaction humorale.

• Des études avec des souris infestées par des tiques Rhipicephalus sanguineus avaient déjà présenté une augmentation des IL-4 et IL-10 (secrétées par les TH2) et une diminution des IL-2 et IFN-gama (sécrétées par les TH1).

• De même dans une étude de Kovar et al. (2002) sur l’ impact des extraits de glande salivaire des tiques Ixodes ricinus sur les lymphocytes des souris et des hommes, il était observé une augmentation des IL-4 et une diminution des IL-2.

Conclusion

• Les tiques Boophilus modulent la réponse des cytokines des LT dans les nœuds lymphatiques :– Augmentation des cytokines produites par les

LTH2 réponse humorale

– Diminution des cytokines produites par les LTH1 (responsables de la réponse cellulaire)

Intérêt• Ces résultats permettent d’améliorer la compréhension

de l’immunité induite par les tiques ainsi que leur utilisation dans la thérapeutique.

• Ce phénomène pourrait être potentialisé dans le futur via des vaccins ; il existe déjà :– Tickgard® (Australie)

– Gavac® (Cuba)

Traitements classiques

• En effet, les traitements curatifs perdent de leur efficacité et peuvent s’accompagner de contamination de l’environnement par des résidus.

Stratégie d’éradication• Cas des Antilles françaises :

– Campagnes simultanées des zones touchées– Coordination des opérations– Programme sur 5 ans :

• 1 an de préparation

• 3 ans de traitement intensif

• 1 an de surveillance

– Détiquage de tous les animaux porteurs toutes les 2 semaines par aspersion

– Utilisation de pyréthrinoïdes– Contrôle d’efficacité

Vaccins• Avantages :

– Stables et sûrs– Pas de contamination de l’environnement– Potentiellemment bon marché– Meilleure tolérance

• Inconvénients:– Efficacité ? : pas d’éradication– Très (trop ?) spécifique de l’espèce ciblée

Tickgard® contre Boophilus• Le vaccin est très efficace contre les tiques «naïves».• L’effet est ciblé contre les antigènes «cryptiques» du

tube digestif de la tique.

Efficacité

• Pas d’éradication des tiques• Diminution de 56 % de la population de tiques en

première génération.• Diminution de 72 % des capacités reproductives

des tiques.• Diminution de 53 % de la production d’œufs.• GQM de 18.6 kg supérieur chez les bovins traités

après 27 semaines.• Tendance à une diminution du taux cellulaire chez

les laitières.

Intérêt

• Il pourrait être intéressant de pousser l’élevage vers l’utilisation des races plus rustiques moins sensibles aux tiques comme la brahman.

Critiques• L’échantillon de 2 X 5 veaux est-il suffisant

pour rendre les différents paramètres significatifs ?

• Pourquoi ce choix de Nelore alors que les tiques sont beaucoup mieux supportées chez eux que chez les races européennes ?

Références

• Barré N. et al, CIRAD-EMVT, INRA Prod. Anim., 1997, 10 (1), 111-119.depuis :Barré N., Camus E., Fifi J., Fourgeaud P., Numa G., Rose-Rosette F., Borel H., 1996. Tropical Bont Tick eradication campaign in the French Antilles: current status. Ann. N. Y. Acad. Sci., 791, 64-76.

• Programme de prévention de la FAO (Food and Agriculture organization) :«Vaccination against ticks and control of ticks-borne disease», Willadsen P., Australiahttp://www.iaea.org/programmes/nafa/d3/public/willadsen-iaea-sept03-revised.pdf

Références

• Jonsson, N. N., A. L. Matschoss, P. Pepper, P. E. Green, M. S. Albrecht, J. Hungerford and J. Ansell (2000). "Evaluation of TickGARD(PLUS), a novel vaccine against Boophilus microplus, in lactating Holstein-Friesian cows." Veterinary Parasitology 88(3-4): 275-285

• Drognoul C. et Germain H., Santé animale bovins, ovins, caprins

• Lefevre Pierre Charles, Blancou Jean et Chermette René (2003). Principales maladies infectieuses et parasitaires du bétail: Europe et Régions chaudes