Profil de Croissance Virale 1 Éclipse Temps # de virus Infection Latence Lyse Rendement de lyse

Profil de Croissance Virale

1

Éclipse

Temps

# de

viru

s

Infection

Latence

Lyse

Rendement de lyse

Rendement de Lyse

• Définition du rendement de lyse:– No de virus générés par une cellule infectée suite à

un cycle infectieux complet

• Paramètres: – La multiplicité d’infection (M.I.) est No de virus

infectieux disponible par cellule– La M.I. sert aussi à déterminer le No de cellules

infectées

2

Multiplicité d’Infection

•3

Nombre de cellules = 6

Nombre de virus = 4

M.I. = 4/6 = 0.67Ou

4 sur 6 cellules seront infectées

Multiplicité d’Infection

4

Nombre de cellules = 6

Nombre de virus = 10

M.I. = 10/6 = 1.6Ou

6 sur 6 cellules seront infectées

Calcul de la M.I.

• 108 cellules sont exposées à 104 virus – Quelle est la multiplicité d’infection?

• 104/108 = 10-4 Virus/cellule

• Combien de cellules seront infectées? • 104 cellules seront infectées

• Combien de cellules restent non-infectés?• 108-104 = approx. 108 cellules (et non 104)

5

Calcul du Rendement de Lyse

6

Nombre de cellules infectées = 4

Nombre de virus produit =10Ou

10 virus/4 cellulesDonc rendement de lyse = 2.5 virus produits/cellule

Calcul du Rendement de Lyse

• M.I.=0.0001; # de cellules = 108 ; Après 10 heures il y a 106 virus– Quel est le rendement de lyse?

• 0.0001 virus/cellule x 108 cellules = 104 virus ensuite le rendement de lyse est 106/104=100 virus/cellule

– Quelle est la multiplicité d’infection après le premier cycle infectieux?

• 100x plus de virus alors, la nouvelle MI est 0.0001 x 100 = 0.01.

7

Calcul du Rendement de Lyse (suite)

– Quelle est la multiplicité d’infection après le deuxième cycle infectieux?

• 100x plus de virus alors, la nouvelle MI est 0.01 x 100 = 1

– Quelle est No de cycle infectieux total? • 3 cycles

– Combien de virus sont produit à la fin du dernier cycle infectieux?

• Rendement x nombre total de cellule = 100 x 108

8

Énumération et Typage des Virus

• Compte direct– Détermine nombre de virus totaux

• Essai de plages– Détermine nombre de virus infectieux

• Essai d’hémagglutination– Détermine nombre total de virus– Possible seulement avec les virus hémagglutinant

• Qui possède l’hémmaglutinine – Ex. influenza• Infectieux et non infectieux

• Essai d’inhibition d’hémagglutination– Typage antigénique de virus hémagglutinants

9

Comptes Directs

• Coloration négative• Microscopie électronique• Ne distingue pas particules infectieuses de

non-infectieuses• Utile pour les virus qui ne peuvent pas être

crus en laboratoire• Utilise des billes à une concentration connue

pour estimer le volume du champ de vision

1010

Comptes Directs Viraux

11

Ajouter billes (104/mL)

Observer au microscope

10 billes dans un champDonc un champ = 1µL

21 virus dans un champDonc 21 virus/1µL = 2.1 X 104 virus/mL

Essai de Plages

• Infecter monocouches de cellules ou tapis bactériens avec différentes dilutions de virus

• Déterminer le nombre de plages pour chaque dilution– Chaque plage est le résultat d’une seule cellule

infectée par une seule particule virale• 1 UFP

12

Les Plages

• Effet cytopathique localisé– Lyse cellulaire

• Chaque plage représente un foyer d’infection– Chaque foyer d’infection est initié par une cellule

infectée

13

14

33 UFP/0.1ml d’une dilution de 10-4

Donc le titre de la suspension originale est:

330 33 3

Facteur de dilution

9 mL milieu 9 mL milieu 9 mL milieu 9 mL milieu 9 mL milieu

Préparation virale

3.3 X 106 UFP/mL3.3 X 106 UFP/mL

Essai d’Hémagglutination

• Mesure de la quantité minimale de virus requise pour agglutiner les globules rouges– 1 unité d’hémagglutination (UHA)

15

Hémagglutination complète

Hémagglutination partielle

Pasd’hémagglutination

≥1UHA < 1UHA 0 UHA

Essai d’Hémagglutination

16

1:8

1:2 1:21:21:21:2

8 16 32 64 128 256

virus

Dilution

Mélanger avec globules rouges

Titre = 32 UHA1:8

1:2 1:21:21:21:2

8 16 32 64 128 256

Vu de côté

Vu du haut

Essai d’Inhibition d’Hémagglutination

17

Anticorps anti-virus présentAnticorps anti-virus absent

Ac lie le virusLiaison du virus au GR

inhibéeVirus lient GR

HémagglutinationHémagglutination inhibé

Points importants à connaîtreCours_08 Nov 2013

• Les cellules sanguines– Connaître les noms– Leur origine– Les fonctions– Lieu d’action

• Phagocytose (les différentes étapes)• Les deux cascades du complément (en détail)

– Alterne– MB-Lectine (MBL)– Les sentiers communs et différents entre les 2 cascades

– Comprendre comment les antigènes sont présentés aux Lymphocytes

Cellules sanguines

19

Cellule souche hématopoïétique

Plaquettes

ÉrythrocytesÉosinophile

Neutrophile

Mégacaryocyte

Mastocyte

Basophile

Lymphocyte T

Cellule NK

Cellule dendritique

Lymphocyte B

Cellule progénitrice lymphoïde

Cellule myeloïde

progénitrice

Monocyte

MoelleOs

Macrophage

Cellules Polymorphonucléaires - Granulocytes• Cellules qui relâchent des granules

– Enzymes digestives, antiseptiques et initiateurs de la réponse inflammatoire

• Neutrophile– Cellule phagocytaire (cellules qui mangent)– Une concentration élevée indique d’une infection– Normalement ils restent dans système sanguin– Mais vont dans les tissus seulement s’il y a infection dans le tissu

• Éosinophile– Phagocytaire pour les complexes antigènes/anticorps (étiquettes)– Combats les infections parasitiques– Impliqué dans les réactions allergiques

• Basophile (dans le circulation)/Mastocyte (dans les tissus)– Initie et amplifie la réponse inflammatoire

20

Cellules sanguines

21

Cellule souche hématopoïétique

Plaquettes

ÉrythrocytesÉosinophile

Neutrophile

Mégacaryocyte

Mastocyte

Basophile

Lymphocyte T

Cellule NK

Cellule dendritique

Lymphocyte B

Cellule progénitrice lymphoïde

Cellule myeloïde

progénitrice

Monocyte

MoelleOs

Macrophage

Leucocytes Non Granulaires

• Monocyte/Macrophage/Cellule dendritique– Cellules phagocytaires– Relâchent les initiateurs de la réponse

inflammatoire– Fait appel au système adaptatif (la 3ème ligne)– Cellules présentatrices d’antigènes (CPA) ou

cellules professionnelles• Molécule présentatrice - CMHII

• Cellules NK– Lymphocyte qui tue cellules infectées et tumorales22

Cellules sanguines

23

Cellule souche hématopoïétique

Plaquettes

ÉrythrocytesÉosinophile

Neutrophile

Mégacaryocyte

Mastocyte

Basophile

Lymphocyte T

Cellule NK

Cellule dendritique

Lymphocyte B

Cellule progénitrice lymphoïde

Cellule myeloïde

progénitrice

Monocyte

MoelleOs

Macrophage

Processus de la Phagocytose

24

•Reconnaissance•PRR (TLR) – PMAP•Opsonines

•Ingestion•Formation de phagosome

•Fusion avec lysosome•Phagolysosome

•Digestion/Destruction•Enzymatique & Chimique

•Expulsion

Phagocytose - Conséquences

• Digestion enzymatique– Lysozyme, Lipases, Glycosidases, Protéases,

Nucléases• Destruction oxydative par radicaux libres

• Superoxide dismutase : 2O2- + H2O à H2O2 + O2.

• Myéloperoxidase: Cl- + H2O2 à hypochlorite (javel)

• Relâchement d’initiateurs de la réponse inflammatoire

• Synthèse et sécrétion de cytokines• Présentation sur CMHII (CPA seulement)

25

Cellules NK

• Le CMHI est exprimé sur toutes les cellules sauf les neurones et les globules rouges

• Tue cellules qui n’ont pas ou peu de CMHI– Cellules infectées par des virus– Cellules cancéreuses

• Deux récepteurs de surface• Récepteur inhibiteur (dominant sur le récepteur activateur)

– Interagit avec CMHI des cellules nucléées

• Récepteur activateur– Interagis avec glycoprotéines induites par le stress

26

NK

Action des Cellules NK

27

Cellule

NK CelluleInfectée

Récepteur inhibiteur

Récepteur activateur

CMHI

Protéine activatrice

CelluleSurvie

CelluleInfectée

Cascades du Complément• La réponse innée comporte deux cascades

– Alterne et MB-Lectine (MBL=Mannose Binding Ligand):• Implique une collection de protéines sériques (libre

dans le serum et inactives)– Protéines du complément:

• C1q, C1r, C1s, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 et C9– Protéines accessoires: B et P– Lectine qui lie le mannose qui se trouve seulement chez

les bactérie (Voie MBL)– Protéases: MASP-1 et MASP-2

• Initié par la liaison à des composantes communes à une grande variété de bactéries:– Alterne: Liaison de C3b à lipide A, acide téchoïque– MBL: Liaison de MBL au mannose des capsules

28

C9

C9

Voie Alterne

29Bactérie Gram Négative

C3 + H2O + C3b

C3b

Ba

PBBb

C3 Convertase

C3 C3aC3b

C3bC5 Convertase

C5C5a

C5b

+

C5b C6 C7

Complexe CAM

C3a

C8C9C

9C9C9

C9

C9

C9

•29

C9

C9

30

Voie de la MB-Lectine

30Capsule BactérienneC5b C6 C7 C8

C9C9

C9C9C9

C9C9

MBL

MASP1MASP2MASP2

C4

C4a

C4b

C4bC2a

C2

C2bC2a

C3 C3aC3b

C5C5a

C5b

+

Conséquences des Voies du Complément• Opsonisation (étiquettes indiquant que les pathogènes

doivent être détruits)– Liaison de C3b et C4b sur la bactérie

• Bactéries, virus et parasites• Anaphylatoxines (des alarmes)

– C3a et C5a• Activent granulocytes et monocytes

– Relâchement d’initiateurs de la réponse inflammatoire– Dégranulation– Recrutement des autres cellules dans la région

• CAM (pore)– Lyse osmotique

• Bactéries Gram négatives – Permet lysozyme d’atteindre la paroi

• Parasites – Perte de solutés31

Présentation & Activation

• La présentation par les CPA est faite seulement aux lymphocytes Ta

• Reconnaissance par les paratopes des RCT appropriés des lymphocytes Ta

– Les CPA sécrètent des cytokines activatrices (substances solubles que agissent sur d’autres cellules)

– Amplification clonale des Ta qui sont sélectionnées

– Donc la réponse acquise est initiée!32

Lymphocytes TA

• Récepteur cellulaire – RCT– Reconnaissance d’épitopes non-soi

présenté par le CMHII• Modes d’action: Sécrétion de cytokines pour

– Activer d’autres lymphocytes (Tc, B) et les CPA (Monocyte/Macrophage/Cellule dendritique)

33

RCT

TA

CD4

Lymphocytes TA

• Un Lymphocyte TA possède des RCT avec un paratope capable de reconnaître un épitope associé au CMHII– Cette cellules reconnait seulement cet épitope toute

sa vie– Elle ne pourra pas reconnaitre d’autres épitopes

• Pour reconnaître un autre épitope on a besoin d’un autre lymphocyte TA avec un paratope spécifique pour ce nouvel epitope– C’est la raison pour laquelle on a un répertoire élevé

34

TACD4

Présentation aux Cellules TA

35

CD4TA

CD4TA

CD4TA

CD4TA

CD4TA

Amplification clonale

RCTParatope

CPA

CMHII

TACD4

3e Ligne-Le Système Adaptatif

• Caractéristiques:

– Spécifique

– Acquiert une mémoire après une première rencontre

– Capable d’apprendre et de s’améliorer suite à des infections subséquentes

– Contrairement ou système innée il fait la discrimination entre le “soi” et le “non-soi”

36

Deux Fronts

37

Extracellulaire• Réponse Humorale• Antigènes exogènes:

– Bactéries– Virus– Mycètes– Parasites– Toxines

Intracellulaire• Réponse Cellulaire• Antigènes endogènes:

– Quelques bactéries• Ex. Mycoplasmes• Mycobactérium

– Virus

Participants Cellulaires

• CPA– Lymphocytes B, monocytes, macrophages et cellules

dendritiques

• Lymphocytes Ta (T auxiliaire)– TH1: Réponse cellulaire (contre antigène endogène)– TH2: Réponse humorale (contre antigène exogène)

• Lymphocytes B – Réponse Humorale (contre antigène exogène)

• Lymphocytes Tc– Réponse cellulaire (contre antigène endogène)

38

La Réponse Humorale

1. Choisir un lymphocyte B avec un RCB qui reconnait un épitope de l’antigène

– C’est la sélection clonale2. Si l’antigène se lie à la RCB, l’endocytose du complexe

RCB-Ag se fait3. Ensuite il y a digestion du complexe RCB-Ag4. Présentation d’épitopes complexés sur le CMHII à des

cellules TH2 avec RCT approprié préalablement activées– Donc c’est la deuxième fois que la TH2 se fait présenter l’Ag

5. La TH2 secrète des cytokines pour activer le lymphocyte B6. Ensuite l’activation du lymphocyte B fait l’amplification

clonale et se différence en plasmocytes et cellule B mémoire

39

Lymphocytes B

• Un Lymphocyte B possède un RCB capable de reconnaître un épitope avec un paratope

• Le RCB est formé de 2 isotypes d’anticorps– IgM & IgD membranaire

• C’est une molécule présentatrice – Donc elle possède un CMHII

• Les lymphocytes B secrètent aussi des molécules effectrices (Anticorps)

– 5 isotypes: IgD, IgM, IgG, IgA, IgE40

RCBIgM & IgD membranaire

La Réponse Humorale

• Les plasmocytes secrètent des anticorps– Une cellule peu seulement produire des

anticorps avec un paratope (le même paratope que la cellule mère)

– Elle ne peut pas changer le paratope ni l’épitope qu’il reconnait

• Les cellules B mémoire gardent une mémoire pour l’épitope– Cela fait aussi que la représentation de cette

cellule est plus grande– Donc la prochaine réponse est plus rapide

41

La Réponse Humorale

42

Répe

rtoi

re d

e ly

mph

ocyt

es B

Naï

f

Antigène

TH2Activée

Activation

PP

PP

Plasmocytes

MM

B Mémoires

Amplification clonale et différentiationSécrétion d’Ac

ÉpitopesCMHIIRCB: IgM ou IgDCytokines

Les Anticorps (Immunoglobulines)

43

Chaîne lourde

Région variable

Région constanteLiens disulfures

Chaîne légère

Région variable

Région constante

Isotype

Idiotype

Sites de liaisons d’épitopes antigéniques

2 X Fab

1 X Fc

• Fab (Fragment Antigen Binding)– Région responsable de la reconnaissance de

l’épitope– N’est pas responsable de la fonction

• Fc (Fragment constant)– Région responsable de la fonction– N’est pas implique dans le reconnaissance

44

Les Anticorps (Immunoglobulines)

Immunoglobulines - Cinq Isotypes

45

• IgD

• IgM

• IgG

• IgA

• IgE

• Les cellules B peuvent produire 5 isotypes (Le mode d’action des Ac est déterminé par l’isotype)

• Mais seulement 1 idiotype (resposable de la reconnaissance de l’epitope)

Déterminé par la région ConstanteConfère fonctionnalité

IgD

• Monomère valence de 2– Peut reconnaitre 2 molecules d’un même epitopes

• Ac exclusivement membranaire– Pas secrété

• Ac de surface des cellules B• Represente le RCB

46

IgM

47

• Pentamère (valence de 10)• Anticorps de surface• RCB

– Forme membranaire mais peut être secrété

• Premier Ac sécrété• Fixation du complément• Agglutinant• Agit comme étiquette (ADCC) reconnue

par cellules NK

IgG

• Monomère (valence de 2)• Ac sérique prédominant

– Plus abondant dans le sérum

• Le seul que peut traverser le placenta– Donc peu protéger le fétus

• Fait la fixation du complément• Région Fc est une opsonine

– Reconnue par phagocytes

• Agit comme étiquette (ADCC) reconnue par cellules NK

48

IgA

• Dimère (valence de 4)• Principalement associé aux muqueuses

– Dans les orifices (la bouche, le nez, l’anus, etc..)

• Neutralisant et agglutinant

49

IgE

• Monomère– Secrété par les lymphocyte B

• Leurs régions Fc se lient aux membranes des macrophages, basophiles et mastocytes– Deviennent donc des Ac membranaires

• Impliqué dans les réactions allergiques– Ces cellules du système innée acquièrentdes récepteurs qui les rendent spécifiques

50

Modes d’Actions des Anticorps

51

• Agglutination

• Neutralisation

• Opsonisation

• ADCC

• Dégranulation des macrophages

• Fixation du complément– Voie classique du complément

IgM et IgA

IgM, IgA et IgG

IgG et IgM

IgG et IgM

IgE

IgM et IgG

Agglutination

52

• Favorise la phagocytose• Inactive l’envahisseur

Neutralisation

53

• Liaison à des composantes essentielles causant l’inactivation

Opsonisation par IgG ou IgM

54

• Régions Fc d’IgM et d’IgG sont des opsonines reconnues par les cellules phagocytaire– Le lysozyme tue toute les cellules dans l’environnement

ADCC

55

• Régions Fc d’IgM et d’IgG sont reconnues par des récepteurs des cellules NK– La destruction est ciblée (tue les cellules ciblées)

Dégranulation des Mastocytes par les IgE

56

IgE

Lysosome

Granules de médiateurs préformés

Récepteur de région Fc

Allergène

•Antigène (pas nécessairement une bactérie)

Voie Classique du Complément

57

C1qC1r C1s

Complexe C1C4

C4a

C4b

+

C4b

C2

C2a

C2a C2b+

C5 ConvertaseC3

C3b

C3a

+

C5bC6 C7C3b

C3 ConvertaseC5

C5a

C5b

+

C9

C9 C8

C9C9

C9C9C9

C9C9

Conséquences de la Voie Classique

• Opsonisation– C3b & C4b

• Analphylatoxines– C3a & C5a

• CAM– Lyse osmotique

58

Décours de la Réponse Humorale

59

Rencontre avec Ag

0 7 14 >30Jours après l’exposition

Nom

bre

de c

ellu

les

BSp

écifi

ques

à l’

antig

ène Reconnaissance

Présentation

B naïve

Élimination

Immunité

Mémoire

B mémoireB activé

Expansion Clonale

Activation

Réponses Immunes: 1re et 2e Rencontres

60

ÉlémentÉlément Réponse primaireRéponse primaire Réponse secondaireRéponse secondaire

Réponse maximale Plus faible Plus forte

Isotype d’Ac

Habituellement commence avec

IgM ensuite passe à IgG

Augmentation des IgG (on passe directement

à IgG)

Nombre d’antigène requis

Relativement élevée Faible

Latence Entre 10-21 jours Entre 1-3 jours

Types d’Immunités Humorales

61

Naturelle

Active Passive

Artificielle

Active Passive

Immun. Acquise Naturelle Active/Passive

• Exposition naturelle à l’antigène– En général se fait de façon naturelle

• Ex. Une infection

• Défense humorale active: – L’individu monte ses propres défenses – Mémoire acquise

• Défense humorale passive: – Réponse humorale chez hôte 1– Transfert naturel des Ac de hôte 1 à hôte 2– Pas de mémoire acquise

• Ex. IgG transmit dans le lait maternel62

Immun. Acquise Artificielle Active/Passive

• Exposition artificielle à l’antigène– En général se fait avec intervention humaine

• Ex. Vaccination, transfusion• Défense humorale active:

– L’individu monte ses propres défenses– Mémoire acquise

• Défense humorale passive: – Réponse humorale chez hôte 1– Transfère artificiel des Ac à un autre hôte

• Ex. Les antivenins; générés chez les chevaux et administré à l’homme

– Aucune mémoire acquise

63

• Pour des antigènes endogènes– Ag fabriqués à l’intérieur de la cellule

• Ex. une cellule infectée par un virus et qui fabrique les protéines du virus à l’intérieur

• Tout les antigènes endogènes sont présentés sur le CMHI

• Le CMHI présente les antigènes aux lymphocytes Tc

64

Réponse Acquise à Médiation Cellulaire

Réponse Acquise à Médiation Cellulaire

65

1. Choisir un lymphocyte Tc avec un RCT qui à le bon paratope pour reconnaitre un épitope de l’antigène associé au CMHI d’une cellule infectée

– Sélection clonale

2. Activation du lymphocyte Tc– Armement par cellules TH1 préalablement activées

• Reconnaissance par RCT approprié d’épitopes complexés au CMHII de CPA

– Amplification clonale– Tuer cellule infectée

Lymphocytes Tc

• Récepteur cellulaire – RCT– Reconnaissance du non-soi présenté par

CMHI– Un lymphocyte Tc possède un RCT capable

de reconnaître un épitope associé au CMHI

• Tc naïfs doivent être armés– Deux signaux sont requis :

• Reconnaissance par un RCT d’un épitope spécifique associé au CMHI

• Cytokines activatrices produites par TH166

RCT

TcCD8

Réponse à Médiation Cellulaire

• Habituellement initié par cellules dendritiques– Associées aux tissus connexes aux

surfaces externes• Poumons, peau, tractus gastro-

intestinal, etc.

– Possède des récepteurs qui permettent l’infection par la majorité des virus

– Expriment CMHI( ) et CMHII( )– Font la présentation d’antigènes

exogènes et endogènes67

Réponse à Médiation Cellulaire

68

Infection Présentation d’épitopes endogènes sur CMHI

Phagocytose

Présentation d’épitopes exogènes sur CMHII

T A

CD 4 Reconnaissance par RCT de TH1 - activation

T A

CD 4

TcCD8TcCD8

Reconnaissance par RCT de Tc - armement

TcCD8

TcCD8Tc

CD8TcCD8 Tc

CD8TcCD8

Amplification clonale de Tc armée

Attaque par les Cellules TC Armées

69

Survol des Réponses Immunes Acquises

70

Antigène

Phagocytose par CPA

Présentation d’épitopes

Activation de cellule T auxiliaire

Cellule T auxiliaire activéeEndocytose par cellule B

Plasmocytes

Anticorps

Infection cellulaire

Cellule T cytotoxique

Cellule T cytotoxique activée

Tuer

Réponse humorale Réponse cellulaire

Interaction des Systèmes Innée et Acquis

71

Immunité Innée

Barrières Physiques Barrières ChimiquesCellules

GranulocytesMonocytes et Macrophages

Cellules NK

Anticorps

Lymphocytes B Lymphocytes T

Immunité Acquise

Cytokines

CytokinesCyto

kine

s