Next Generation Sequencing -...

Next Generation Sequencing

Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung

96 Spuren x 900 Basen = ca. 90 000 Basen in 2,5 Std.

Microfabricated capillary array electrophoresis (µCAE)

Seperation length: 15,9 cm

~ 430 bp reads max -> 800 bp

24 min run time, 5 x of Sanger

0,01% error on 80% read length

Next Generation Sequencing

(Nature Reviews; 2009)

Next Generation Sequencing – Solid/ABI sequencing byligation

ABI - Solid- Plattform

Next Generation Sequencing – Solid/ABI sequencing by ligation

Next Generation Sequencing – Solid/ABI sequencing by ligation

Solid/ABI sequencing by ligation: Decoding

Roche - FLX- Plattform

Next Generation Sequencing - Pyrosequenzierung

DNA template, Primer, DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase, apyrase, adenosine 5´ phosphosulfate (APS) and luciferin (no dNTPs)

(DNA)n + dNTP (DNA)n+1 + PPiPolymerase

One dNTPs is added

Nucleotide detection

Incubation Degradation of unincorporated dNTPs and excess ATP

Pyrogram

Addition of dNTPs is performed one at a time

Nucleotide sequence is determined from the signal peak in the pyrogram

The light produced in the luciferase-catalyzed reaction is detected by a CCD camera

Next Generation Sequencing – Polonysequencing

- kurze Leseweiten

- Diffusion der Polymerase

- langsame Einbaurate

- Probleme vor allem bei homopolymeren Regionen

- relativ kurze Leseweiten (<400 bp)

- Probleme bei repeats > 5 bp

- geringe Fehlerrate

- optimal zur Detektion von SNPs

Next Generation Sequencing – Emulsion PCR

Life technologies – Ion Torrent

NGS Platforms – Ion Torrent

- sehr schnell- Recht hohe Leseweiten

Beim Einbau eines Nukleotides wird ein H+ frei-gesetzt.

Auf Halbleitertechnologie basierende ionen-Sensoren Messen die pH-Änderung in den Micro-Well-Platten

Illumina - HiSeq 2000 - Plattform

Next Generation Sequencing – Gene Analyzer Illumina/Solexa

Illumina/Solexa - Bridge Amplification

Cluster Generation: Bridge Amplification

Illumina/Solexa - Bridge Amplification

NGS Platforms – Pacific Biosciences

PacBio RSSMRT® Technology (single molecule real time)

NGS Platforms – Pacific Biosciences

NGS Platforms -Nanopore

NGS Platforms

Sequenzierung „kurzer“ DNA-Fragmente:

Klonierung der DNA in einen Standard-Vektor, z.B. pUC 18oder Amplifikation der DNA per PCR, wenn bereits Sequenz-

abschnitte bekannt sind

MCS

MCS

Sequenzierung mit Standard-oder bereits bekannten Primern

Bei Integrat-Längen bis 1000 - 1500 bp ist es möglich, mit zwei Sequenzierungsreaktionen die vollständige

Basenabfolge zu ermitteln.

Univ. Seq.

Rev. Seq.

Sequenzierung „kurzer“ DNA-Fragmente: