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Claudia Alpini, Laboratorio Analisi Chimico Cliniche,
Fondazione I.R.C.C.S. Policlinico “San Matteo”
Pavia
L’evoluzione tecnologica dell’immunofluorescenza:
verso la completa automazione degli ANA – IFI
CENNI STORICI
1948
1957
1950
Anti-nuclear antibodies: Contemporary techniques and clinical application to
connective tissue diseases
G. A. McCarty, D. W. Valencia and M. J. Fritzler
Oxford University Press, Oxford, 1984
1980
La storia della diagnostica autoimmune
inizia negli anni ‘40 e ‘50
Antigen
Renato Tozzoli LigandAssay 15 (4) 2010
Metodi di dosaggio degli autoanticorpi
Tra i metodi “convenzionali di prima generazione” l’IFI rappresenta la
prima tecnica per la rivelazione degli autoanticorpi e nella sua
applicazione principale (ANA-IFI) rappresenta anche il primo esempio
di test “Multiplex” nella storia.
Figure 1
The evolution of technologies for autoantibody detection: the role of automation (see text for legends).
Tozzoli et al.: Current state of diagnostic technologies in the autoimmunology laboratory
Nell’ultimo ventennio, la ricerca ha prodotto una vera rivoluzione nell’ambito delle
tecnologie diagnostiche dirette alla rivelazione/quantificazione degli autoanticorpi,
che si è tradotta
• in un aumento esponenziale della capacità analitica
• in un rapido incremento numerico delle richieste
L’evoluzione delle tecnologie : la determinazione degli ANA
• un aumento esponenziale della capacità analitica
L’evoluzione delle tecnologie : la determinazione degli ANA
Journal of Immunology Research
• un rapido incremento numerico delle richieste
ANA anno 2013
Statistica richieste ANA
A
S
L
B
E
L
G
C
C
H
I
R
Incremento ANA negli anni
A
S
L
E
M
A
T
INF
A
M
B
A
P
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D REU
Laboratorio Analisi Chimico Cliniche,
Fondazione I.R.C.C.S. Policlinico “San Matteo” Pavia
M
E
D
.
I
N
T
Anticorpi anti-antigeni nucleo-citoplasmatici : ANA
Definizione
■ sono autoanticorpi appartenenti a tutte le classi di immunoglobuline,
più spesso IgG, diretti verso i normali costituenti e compartimenti cellulari, comuni
a tutti i tipi di cellule,rappresentati da acidi nucleici, macromolecole, proteine associate
acidi nucleici, enzimi e loro cofattori;
■ sono presenti in modo stabile nel nucleo e nelle principali strutture cellulari
(membrana, nucleoplasma e cromatina, nucleolo);
■ migranti dal nucleo al citoplasma, durante le fasi del ciclo cellulare;
■ sono presenti in modo stabile nel citoplasma;
■ sono la conseguenza della perdita, da parte dell’organismo, della tolleranza
verso antigeni “self ”.
“ANA”
- Sono un test di screening utilizzato per la diagnosi di quasi tutte la malattie
reumatiche autoimmuni, e in alcuni casi , ne rappresentano un parametro
diagnostico/classificativo .
- Utili da un punto di vista clinico/diagnostico in altre patologie autoimmuni e non.
Journal of Immunology Research
Volume 2014, Article ID 315179, 18 pages
ANA new technologies
ANA-IFI
……rapido incremento numerico delle richieste
……disponibilità di tecnologie ad elevato throughput
ANA test ??
“vecchio”
ANA-IFI “nuovo”
ANA test Screening
► Consolidamenti in atto: necessità di
assorbire aumentati carichi di lavoro
► Esigenza di integrazione ed accentramento
su stazioni analitiche multiparametriche
► Aumento richieste esami
Ma..il problema:
► del controllo della qualità
( riproducibilità, sensibilità, specificità);
► dell’interpretazione clinica dei risultati ;
► dell’accuratezza dei metodi
Ha evidenziato crescenti preoccupazioni circa l’adozione
unilaterale di questi nuovi metodi .
Alla domanda : “ Quale metodo utilizzare?”
Comitati internazionali ad hoc, come:
- IUIS/WHO/AF/CDC Comitato per la standardizzazione di autoanticorpi correlati a malattie autoimmuni
- Task Force della American College of Rheumatology (ACR)
Meroni et al. BMC Medicine2014, 12:38
Journal of Immunology Research
Volume 2014, Article ID 315179, 18 pages
ANA-IFI deve la sua riaffermata superiorità ad una elevata sensibilità.
Sensibilità non riscontrabile nei metodi alternativi e caratteristica fondamentale
ed obbligatoria in un saggio destinato ad essere utilizzato come “screening”.
●
●
●
●
Nella pratica clinica, una corretta interpretazione del test ANA deve essere
d’aiuto a stabilire…
“Qual è la probabilità di un paziente di avere la malattia quando il test di
laboratorio è positivo o non avere la malattia quando il test di laboratorio è
negativo” …. difficile in termini di specificità e sensibilità
PVN di SPA è inferiore al PVN di IFI
Negli ultimi anni si sono intensificati gli sforzi per
migliorarne in modo significativo i principali svantaggi
4
5
3
2
1 2
3
4 5
Piattaforme tecnologiche
avanzate per l’automazione
di ANA-IFI
Piattaforme tecnologiche
avanzate per la lettura e
l’interpretazione di ANA-IFI
1
4
Piattaforme tecnologiche avanzate
per l’automazione di ANA-IFI
LIS
LIS
Oggi: stato dell’arte
Piattaforme tecnologiche
avanzate per la lettura e
l’interpretazione di ANA-IFI
Questi “Sistemi Intelligenti” utilizzano:
microscopi automatizzati con sorgente luminosa a LED;
vassoi porta vetrini robotizzati;
video camere ad alta sensibilità;
hardware e software diversi dedicati all’acquisizione,
alla analisi e alla valutazione dell’immagine ANA-IFI.
Metodo robusto nello screening
dei campioni positivi/negativi;
Criticità sono state rilevate:
■ interpretazione di alcuni quadri fluoroscopici;
■ pattern con reattività multiple.
Tale interpretazione errata può avere
implicazioni in ambito clinico,
sottolineando
la necessità e l’ importanza dell’interpretazione
dell’ esperto.
18 falsi negativi*
22 falsi positivi●
* 2 sieri “critici” anche per operatori esperti;
16 sieri 50% pattern citoplasmatici (1 Jo1non riconosciuto da 4/6)
50% pattern inusuali
errore 3,3% con sens.media 96,7%
● % errori calcolata sul totale delle osservazioni pari al 10,8%
65% con titolo ≤1:160 (1/3 pattern citoplasmatico e 2/3 pattern inusuale)
35% con titolo ≥1:320 ( 60% pattern citoplasmatico e 40% pattern inusuale)
Complessivamente l’efficacia analitica dei sistemi
è notevole:
40/756 errori pari al 5,3%
Sensibilità 96,7%
Specificità 89,2%
Imprecisione analitica buona < 1,99% x< 25,26%
(manuale 39,12%)
Buona correlazione tra valore analitico del segnale e titolo manuale (titoli bassi e morfologia complessa penalizzano corretta classificazione)
…Interpretazione ANA-IFI
Corretta identificazione dei quadri morfologici “classici”
Difficoltà nell’interpretazione di quadri fluoroscopici “inusuali” e citoplasmatici
•Difficoltà nella corretta interpretazione di quadri fluoroscopici “misti”
L’interpretazione dei quadri fluoroscopici dipende :
■ limitazioni dichiarate dai produttori;
■ qualità del substrato;
■ preparazione vetrini .
*
*
*
• non sono stati valutati sieri con pattern“misti”
*
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A-IF
I
...verso la completa automazione degli ANA-IFI
….siamo vicini alla meta!
Standardizzazione e completa automazione
procedura di esecuzione
Armonizzazione dei risultati in IFI:
-riduzione soggettività;
-riduzione variabilità intra-inter laboratorio;
-throughput più elevato flusso di lavoro
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