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1
Fenêtre de mutationapport du modèle animal
le couplepneumocoque - fluoroquinolones
P ChavanetDépartement d’Infectiologie
EA 562, LMI-LQRFDijon
2
Infections respiratoires « basses »le sketch
fréquence
Br.aigue 73%
EA.BPCO 16%
Pneumonie 11%
Antibiothérapie = 96%
3
Infections respiratoires « basses »le sketch
fréquence hospitalisation
Br.aigue 73% 0.3%
EA. BPCO 16% 2.2%
Pneumonie 10% 12%
4
Infections respiratoires « basses »le sketch
fréquence hospitalisation mortalité
Br.aigue 73% 0.3% 0
EA. BPCO 16% 2.2% 0.4%
Pneumonie 10% 12% 10-15%
6
S. pneumoniae : mécanismes de R aux FQ• Modification de cible:
– mutations ponctuelles successives QRDR+++» (rarement mosaïque)
• Topoisomérase IV (C2E2)– Sous-unité C (parC)– Sous-unité E (parE)
• Gyrase (A2B2)– Sous-unité A (gyrA)– Sous-unité B (gyrB)
• Efflux actif augmenté– pmrA
• FQ “hydrophiles” (Cipro, Norflo)• Inhibé par la réserpine
– Autres pompes ?
7
S. pneumoniae : résistance aux FQ (IRBA) en France
36 (3,7)8 (0,8)01 (0,1)17 (1,7)10 (1,0)9802004
28 (3,1)9 (1,0)02 (0,2)8 (0,9)9 (1,0)9682003
37 (3,8)14 (1,5)01 (0,1)8 (0,8)14 (1,5)9652002
24 (3,5)7 (1,0)02 (0,3)6 (0,9)9 (1,3)6752000 - 2001
TotalParC+GyrAGyrAParC+EffluxEffluxParC
Mécanisme de résistance (%)
N souchesAnnée
2 - ≥8-0,50,12 - 0,25Moxifloxacine
4 – 32-2 – 161 – 2LévofloxacineCMI extrêmes, mg/L
A détecter sur l’antibiogrammeà l’aide de la norfloxacine (Ca-SFM)
8
Pneumocoque vs fluoroquinolonesdonnées françaises (CNR)
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
0,25 0,5 1 2 4 8 16 >=32
CMI (mg/l)
%
WTParC+GyrA
échecsuccès
9
Une antibiothérapie « inadéquate » => mortalité accrue
Ibrahim EH, Chest 2000,118:146-55; Alvarez-Lerma F, Intensive Care Med 1996,22:387-94; Rello J, Am J Respir Crit Care Med, 1997,156:196-200; Kang CI, CID 2004;39:812-8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
mor
talit
é (%
)
adaptée inadaptée
septicémie(Ibrahim) PnP noso-VAP(Alvarez) PnP noso-VAP (Rello) Septi Enterobacter Kang) septic Pyo
S R
10
Une antibiothérapie « inadéquate » => mortalité accrue
Ibrahim EH, Chest 2000,118:146-55; Alvarez-Lerma F, Intensive Care Med 1996,22:387-94; Rello J, Am J Respir Crit Care Med, 1997,156:196-200; Kang CI, CID 2004;39:812-8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
mor
talit
é (%
)
adaptée inadaptée
septicémie(Ibrahim) PnP noso-VAP(Alvarez) PnP noso-VAP (Rello) Septi Enterobacter Kang) septic Pyo
S R
11
Pneumocoque vs fluoroquinolonesdonnées françaises (CNR)
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
0,25 0,5 1 2 4 8 16 >=32
CMI (mg/l)
%
WTParC+GyrA
échecsuccès
12
Pneumocoque vs fluoroquinolonesdonnées françaises (CNR)
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
0,25 0,5 1 2 4 8 16 >=32
CMI (mg/l)
%
WTEffluxParCParC+EffluxParC+GyrA
échecsuccès
13
Les concentrations critiques
CMI (mg/l)Cipro 1 2 4
levo ≤0.25 1 ≥2
moxiflo ≤0.12 0.25 ≥0.5
gatiflo ≤0.25 0.5 ≥1
14
Fréquence des mutations « bas niveaux »_______________________________________________________________
% avec ≥ 1 mutation CMI (mg/l) .Cipro 1 2 4
21 16 52levo ≤0.25 1 ≥2
0-14 6-27 5-100moxiflo ≤0.12 0.25 ≥0.5
9 53 75gatiflo ≤0.25 0.5 ≥1
10 52 80________________________________________________
Chavanet P, MMI 2006
16
Traitement humaniséPompe pilotée
-1
0
1
2
3
4
5
6
0 30 60 90 120
Time (min
Ln [
Obtained LN [
Elimination pha
Distribution pha
Calculated LN ordinateur
PK individuelle
17
Pneumonie expérimentale
choix des traitementsTraitement humanisé:CiprofloxacineIV: 400mg x 2levofloxacine po: 500mg x 2gatifloxacine po: 400mg x 1moxifloxacine po: 400mg x 1
01234567
0 6 1 2 1 8 2 4 3 0 3 6 4 2 4 8
t i m e ( h )
mg/
l
m o x i " h " m o x i " l a p "
0
1
2
3
4
0 12 2 4 3 6 48
tim e (h)
mg/
l
01234
5678
0 6 12 18 24 30 36 42 48
lévo "h" lévo "lap"
0
1
2
3
4
5
0 4 8 12 16 20 24time (h)
Free
ser
um C
once
ntra
tions
(mg.
L-1)
MIC
gatifloxacine
moxifloxacinelevofloxacine
ciprofloxacine
18
Pneumocoque vs efficacité FQ in vivoconcentration bactérienne pulmonaire résiduelleà l ’issue du traitement
0123456789
sauvage efflux parC parC parC,gyrA
CFU/
g po
umon
CTRL cipro levoflo gatiflo moxi
CMI ………………. …. ….S/R Cipro 0.5Levo 0.5 1 2 2Gati 0.125 0.25 1 1 4Moxi 0.125 0.125 1 1 4
Souche inductrice initiale ->
19
Pneumocoque vs efficacité FQ in vivoSurvivants résistants à l ’issue du traitement
CMI ………………. …. ….S/R Cipro 0.5Levo 0.5 1 2 2Gati 0.125 0.25 1 1 4Moxi 0.125 0.125 1 1 4
sauvage efflux parC parC parC,gyrA
CTRL cipro levoflo gatiflo moxi9
012345678
CFU
/g p
oum
on
résistants
Souche inductrice initiale ->
20
Pneumocoque vs efficacité FQ in vivoSurvivants résistants à l ’issue du traitement
CMI ………………. …. ….S/R Cipro 0.5Levo 0.5 1 2 2Gati 0.125 0.25 1 1 4Moxi 0.125 0.125 1 1 4
CTRL cipro levoflo gatiflo moxi9
012345678
sauvage efflux parC parC parC,gyrA
CFU
/g p
oum
on
résistants
Souche inductrice initiale ->
21
Pneumocoque vs efficacité FQ in vivoSurvivants résistants à l ’issue du traitement
CMI ………………. …. ….S/R Cipro 0.5Levo 0.5 1 2 2Gati 0.125 0.25 1 1 4Moxi 0.125 0.125 1 1 4
CTRL cipro levoflo gatiflo moxi9
012345678
sauvage efflux parC parC parC,gyrA
CFU
/g p
oum
on
résistants
Souche inductrice initiale ->
22
Pneumocoque vs efficacité FQ in vivoSurvivants résistants à l ’issue du traitement
CMI ………………. …. ….S/R Cipro 0.5Levo 0.5 1 2 2Gati 0.125 0.25 1 1 4Moxi 0.125 0.125 1 1 4
CTRL cipro levoflo gatiflo moxi9
012345678
sauvage efflux parC parC parC,gyrA
CFU
/g p
oum
on
résistants
Souche inductrice initiale ->
23
Pneumocoque vs efficacité FQ in vivoSurvivants résistants à l ’issue du traitement
CMI ………………. …. ….S/R Cipro 0.5Levo 0.5 1 2 2Gati 0.125 0.25 1 1 4Moxi 0.125 0.125 1 1 4
CTRL cipro levoflo gatiflo moxi9
012345678
sauvage efflux parC parC parC,gyrA
CFU
/g p
oum
on
résistants
Souche inductrice initiale ->
24
PnP pneumocoque vs Fluoroquinolonesapport du modèle expérimental
Conclusion 1a• Un traitement par fluoroquinolone• d ’ une pneumonie à pneumocoque
– sauvage exposée à cipro– ou– avec résistance à bas niveau exposée à levo ou moxiflo
• s ’accompagne:– d ’une faible réduction bactérienne– de la sélection de mutants résistants
• Danger d’une préexposition par une fluoroquinolone peu active
25
concentration critique in vitro vs concentration critique clinique ?ou
dépistage de la résistance à bas niveau ?
CMI ………………. …. ….S/R Cipro 0.5Levo 0.5 1 2 2Gati 0.125 0.25 1 1 4Moxi 0.125 0.125 1 1 4
CTRL cipro levoflo gatiflo moxi9
012345678
sauvage efflux parC parC parC,gyrA
CFU
/g p
oum
on
résistants
Souche inductrice initiale ->
26
Pneumocoque vs efficacité FQ in vivo(réduction bactérienne)
0123456789
sauvage efflux parC parC parC,gyrA
CFU
/g p
oum
on
CTRL cipro levoflo gatiflo moxi
CMICipro 0.5Levo 0.5Gati 0.125Moxi 0.125
27
Concentration minimale inhibitrice (CMI) in vitro
Concentration de prévention de la mutation (CPM) in vitro
CMI CPM
inoculum (log CFU/ml) 5-6 >10105-6 10>10
incubation (h) 24 48(72)
au delà mutants pas de mutant
30
Concentration de Prévention de Mutation-CPM
0
1
3
5
7
9
11
C1 C2 C3 C4 C5 C6
R
concentration
Con
cent
r atio
n b a
ctér
ienn
e
> 48h
0
1
3
5
7
9
11
31
Activité intrinsèque: MIC vs MPC« côté molécule »
Xilin Zhao and Karl Drlica, CID 2001; 33(Suppl 3):S147–56
32
Pneumo
MIC90 MPC90
Moxi 0.25 2
Gati 0.5 4
Trova 0.25 4
Grepa 0.5 8
Levo 1 8
moxi
gati
trova
grepa
levo
Blondeau, AAC 2001
33
MIC vs MPC Impact de la 1ere marche de résistance
« côté bactérie »
Wild type vs parC
sauvage
parC
34
Pneumo: au départ c’est lequel ?
Triangle vide: MICTriangle plein: MPC
10 logCFU
Rond vide : MoxiRond plein : Levo
WT
parC
gyrA
Li, AAC 2002
35
Pneumo vs moxiflo in vitro
Zinner SH, JAC 2003
Pk vs fenetre Effet antibactérien Sensibilité post-TT
37
CPM
CMI
Temps (h)
Con
cent
ratio
n (m
g/l
Ciprofloxacine
Levofloxacine
CMI
CPM
Temps (h)
Con
cent
ratio
n (m
g/l moxiflo
CMI
gatiflo
CMI
38
Pneumocoque vs efficacité FQ in vivo(réduction bactérienne)
0123456789
sauvage efflux parC parC parC,gyrA
CFU
/g p
oum
on
CTRL cipro levoflo gatiflo moxi
CMICipro 0.5Levo 0.5Gati 0.125Moxi 0.125
39
CMI, CPMpneumocoque « sauvage »
0,01
0,10,060,04
0,02
10,60,4
0,2
1064
2
2030
50
sauv
age
sauv
age
sauv
age
sauv
age
sauv
age
cipro levo gati moxi gemi
mg/
l
Cmax: ---Cmax: ---
CMI
CPM
40
PnP pneumocoque vs Fluoroquinolonesapport du modèle expérimental
Conclusion 2a
• Un traitement par fluoroquinolone• d ’ une pneumonie à pneumocoque
• sensible et• sans résistance à bas niveau (sauvage)
• s ’accompagne:– d ’une faible réduction bactérienne– de mutants résistants
• si les concentrations sont « dans la fenêtre de mutation»– sous la CPM
– ex: ciprofloxacine
41
Pneumocoque vs efficacité FQ in vivo(réduction bactérienne)
CMI ………………. …. ….S/R Cipro 0.5Levo 0.5 1 2 2Gati 0.125 0.25 1 1 4Moxi 0.125 0.125 1 1 4
CTRL cipro levoflo gatiflo moxi9
012345678
sauvage efflux parC parC parC,gyrA
CFU
/g p
oum
on
résistants
Souche inductrice initiale ->
42
Concentration minimale inhibitrice (CMI)Concentration de prévention de la mutation (CPM)pneumocoque « parC »
0,01
0,10,060,04
0,02
10,60,4
0,2
1064
2
2030
50
sauv
age
efflu
x
parC
gyrA
sauv
age
efflu
x
parC
gyrA
sauv
age
efflu
x
parC
gyrA
sauv
age
efflu
x
parC
gyrA
sauv
age
efflu
x
parC
gyrA
cipro levo gati moxi gemi
mg/
l
Cmax: ---Cmax: ---
CMI
CPM
43
PnP pneumocoque vs Fluoroquinolonesapport du modèle expérimental
Conclusion 2b
• Un traitement par fluoroquinolone• d ’ une pneumonie à pneumocoque
• sensible et• avec ou sans résistance à bas niveau
• s ’accompagne:– d ’une faible réduction bactérienne– de mutants résistants
– très fréquents en cas de parC initiale
• si les concentrations sont « dans la fenêtre de mutation »– sous la CPM
45
Temps dans la fenêtre de mutation (Tmsw ):réduction bactérienne in vivomutants
Log
10C
FU.g
-1
0
2
4
6
8
10
dose
Une souche vs doses variables
46
Temps dans la fenêtre de mutation (Tmsw ):réduction bactériennemutants
Log
10C
FU.g
-1
0
2
4
6
8
10
Concentration bactérienne totale
dose
Une souche vs doses variables
49
CPM
CMI
Temps (h)
Con
cent
ratio
n (m
g/l
« petite dose »
« forte dose »
CMI
Temps de concentration sérique dans la fenêtre« …. dose »
50
Temps dans la fenêtre de mutation (Tmsw ):réduction bactériennemutants
Log
10C
FU.g
-1
0
2
4
6
8
10
00 50 100 50
TMSW (%)
Concentration bactérienne totale
dose
Une souche vs doses variables
51
Temps dans la fenêtre de mutation (Tmsw ):réduction bactériennemutants
Log
10C
FU.g
-1
0
2
4
6
8
10
00 50 100 50
TMSW (%)
mutants
Concentration bactérienne totale
dose
Une souche vs doses variables
52
PnP pneumocoque vs Fluoroquinolonesapport du modèle expérimental
Conclusion 3
• Une régime thérapeutique prévenant les mutants existe in vivo– par exemple animaux
• infectés par pneumocoque parC• traités par moxifloxacine (doses humanisées croissantes)
– <=> Tmsw < 60% <=> ≥ 2 x dose normale
• Une fenêtre de mutation existe in vivo
• le concept de CPM « in vitro » prend toute sa valeur
53
In vivoTT humanisé vs pneumocoque de sensibilités variées aux fluoroquinolones
efficacité « globale »(concentration bactérienne totale dans les poumons)
2
4
6
8
1 0
2 0 4 0 6 0 8 00
levofloxacine
AUC0-24h libre /CMI
Log
CFU/g -4 log CFU/g
54
In vivoTT humanisé vs pneumocoque de sensibilités variées aux fluoroquinolones
efficacité « globale »(concentration bactérienne totale dans les poumons)
2
4
6
8
1 0
2 0 4 0 6 0 8 00
levofloxacine
AUC0-24h libre /CMI
gatifloxacine
0
2
4
6
8
1 0
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0
Log
CFU/g
Log
CFU/g
2
4
6
8
1 0
0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 00
moxifloxacine
Log
CFU/g
-4 log CFU/g
-6 log CFU/g
-6 log CFU/g
55
In vivoTT humanisé vs pneumocoque de sensibilités variés aux fluoroquinolones
efficacité « globale » (…)mutants résistants
2
4
6
8
1 0
2 0 4 0 6 0 8 00
levofloxacine
gatifloxacine
2
4
6
8
1 0
0
AUC0-24h libre /CMI5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 00
0
2
4
6
8
1 0
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0
moxifloxacine
Log
CFU/g
Log
CFU/g
Log
CFU/g
56
Modèle in vitro « pk bronches »:lévo vs moxiflo - Pneumo parC
C. Andrew DeRyke, JAC (2006) 58, 601–609
Bactericidal activity at 48 h as a function of exposure. Closed ircles, levofloxacin; open triangles, moxifloxacin; solid line, levofloxacin; dotted line, moxifloxacin.
57
La fenêtre de mutation existe pour tous les couples « bug-drug »
1- Mutations pré-existantes• M. tuberculosis 10-6-8
• => association• Règle de l’indépendance des mutations
2- Mutations pré-existantes• MPC• TT « hautes doses » > MPC
59
Mycobactéries MPC 50-90 (« côté molécule »)
Juan Carlos Rodr´ýguez International Journal of Antimicrobial Agents 24 (2004) 352–356
60
Association:Mycobacterium tuberculosis
moxi + ..(« côté molécule »)
---- :Moxi seule 2.5mg/l après 6 joursCarré vide :Drogue seuleCarré plein :Association avec moxi
Lu T, JAC 2003
Antagonisme => sélection « accrue » de mutants
INH
RMP
capreo
cycloserine
ETMB
% s
urviva
nts
-----------------------------
-----------------------------
-----------------------------
-----------------------------
-----------------------------
Concentration (mg/l)
61
Efficacité: données in vitroEtude de l’ADN gyrase de M. tuberculosis
Interaction avec les quinolones• Production hétérologue des
sous-unités A et B (His-tag) de M.tuberculosis chez E. coli
• ADN gyrase recombinante fonctionnelle
• Relation structure-activité des quinolones : C-8, N-1, F en C-6 et cycle en C-7
C2
3
N
O
COOH
AB
F
O-CH3
NNH
4567
H
H
moxifloxacine Aubry AAC 2004
Relation entre CMI et CI50 de 22 quinolones sur l'ADN
gyrase de M. tuberculosis
R2 = 0,9
1
10
100
1000
10000
0,1 1 10 100 1000CMI (mg/l)
CI50 (mg/l)
NalPip
Flu
EnoTem
Pe
Flé
BMS
Cip
OflGré
Lé
Mox
Cli
Gat
Oxo
Tos
Tro
Nor
Gém
SitSpx
62
Efficacité: données in vitro
Moxifloxacine
Sparfloxacine
Ofloxacine
Ciprofloxacine
Shandil, AAC, 2007
63
Données expérimentales « dans les macrophages »
Shandil, AAC, 2007(Balb-C, aerosol, T0= 4 semaines, TT= 4 semaines (3 pour Sparflo)
64
Données expérimentales in vivo modèle murin
Shandil, AAC, 2007(Balb-C, aerosol, T0= 4 semaines, TT= 4 semaines (3 pour Sparflo)
65
Moxiflo vs TB in vivoAlmeida D…Grosset, AAC 2007;51:4261Souris
Inhalation BKBK: CMI 0.5 – MPC 8
Moxiflo: 2 doses
# Pk « humaine »
67
Moxiflo vs TB in vivoAlmeida D…Grosset, AAC 2007;51:4261
% souris avec BK MFX-R
0%
0%
0%
0%
30%
16%
0%
50% à 10-5-6
AUC:MIC > 100
AUC:MIC < 50
69
Tuberculose résistante: délai de négativation des expectorations
Holtz TH Ann Intern Med 2006
Impact de la résistance initiale
Impact de l’inoculum initial
70
Phases du traitement de la tuberculosePopulations « BK »
A
B
c
A: multiplication rapide (caseum)B: multiplication lente (acidic)C: multiplication « sporadique »
INHPZARIF
EMBPZAINHRIF
INHRIF
Mois 1 2 3 4 5 6
induction maintenance
D’après Mitchison, Bull Int Union Tuberc 1985; Iseman 2000
71
Haemophilus:« côté molécule »: différences sans importance !!!
Rond plein : GarenoRond vide: CiproTriangle plein: LevoTriangle vide: Moxi
MPC << Cmax donc a priori pas de problème
72
Haemophilus:côté bactérie: au départ, c’est lequel !!Différences avec grande importance
Rond vide : WTRond vide: gyrATriangle vide: gyrA + parCTriangle plein: gyrA + parC + gyrA
Si double mutation: MPC >> Cmax !!! =>…….! Mutants enrichis !Li X, AAC 2004
75
Pyo cipro vs levo
Hansen GT, Drlica K, Blondeau JM,
MPC mg/l
N i
sola
tes
Cipro en noir, levo en blanc
0,5 1 2 4 8 16 32 64
100
80
60
40
30
0
76
Conclusionfluoroquinolones vs pneumonie à pneumocoque
• La CMI seule ne prédit l’activité in vivo
• Impact thérapeutique majeur d’un bas niveau résistance• Détection phénotypique, génotypique,… ?
• Adaptation des concentrations critiques ?
• Valeur prédictive de la CPM• Fenêtre de mutation vs apparition de résistances in vivo
77
Traitements antibactériens
• Résistance inéluctable
• TT => sélection……tôt ou tard
• => quels sont les objectifs thérapeutiques– …..– TT courts chez l’immunocompétent ?
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