View
296
Download
0
Category
Tags:
Preview:
Citation preview
Simplified flow cytometric immunophenotyping panel
for multiple myeloma, CD56/CD19/CD138(CD38)/CD 45,
to differentiate neoplastic myeloma cells from reactive plasma cells
Tae-‐dong Jeong,Chan-‐Jeong Park, Hyoeun Shim, Seongsoo Jang, et al
Jurnal Hematologi I
Korean Journal of hematology 2012;47:260-‐266
Verna B / Paulus B. N Senin,16 September 2013
1
Pendahuluan
2
Mieloma multipel ( MM ) : neoplasma klonal sel B --> hasil akumulasi dari sel plasma neoplastik di sumsum tulang ( BM )
Mayoritas kasus MM memproduksi protein monoklonal : paraprotein abnormal
Diagnosis MM = adanya sel plasma neoplastik di BM , terdeteksinya protein monoklonal di darah atau urine.
....Pendahuluan
3
Mayoritas sel plasma pada penderita MM: - sel mieloma neoplastik, - sel plasma normal atau reaktif : % sedikit
--> dimana bertanggung jawab untuk menjaga fungsi sistem imun.
Flowsitometri ( FCM) : dasar dari imunofenotipe, telah menjadi alat diagnostik utama untuk membedakan sel plasma neoplastik dengan sel plasma reaktif secara laboratoris
....Pendahuluan
4
Penelitian sebelumnya : Antigen pada sel plasma diekspresikan secara bervariasi --> CD19, CD20, CD27, CD33, CD38, CD45, CD56,CD117 dan CD 138
Profil immunophenotypic : sel plasma neoplastik dan sel plasma reaktif berbeda
....Pendahuluan
5
Sel plasma reaktif
Sel plasma neoplastik
Forward / Side Scatter (FSC/SCC) rendah ;
CD 19 +/CD 56-
CD 38: ekspresi tinggi
FSC/SCC tinggi ; CD 19 - / CD 56 +
CD 38: ekspresi relatif rendah
....Pendahuluan • The European Myeloma Network (EMN)
merekomendasikan penggunaan antigen yang paling berguna untuk mendeteksi plasma sel aberrant di MM
• Rekomendasi terdiri dari 3 klasifikasi : 1. “ essential “ : CD19 dan CD 56 2. “ recommended “ : CD117, CD20, CD28, CD27 3. “suggested “ : CD 81 dan CD 200 diagnosis dan monitoring
6
Tujuan PeneliGan
• Mengevaluasi panel yang disederhanakan dari CD 56 / CD19/ CD138( CD38 ) / CD45 untuk menganalisis mieloma multiple.
7
Bahan dan Metode • Jumlah sampel : 70 penderita - 62 penderita yang baru terdiagnosis MM ( blm diterapi ) - 8 penderita telah dilakukan analisis BM, sebagai
pemantauan terapi MM. • April 2010 – Juli 2011 • Diagnosis MM berdasarkan klasifikasi WHO • Penelitian ini disetujui oleh Asan medical center dan
semua penderita dilakukan informed concent sebelum pengambilan spesimen BM
8
FCM immunophenotyping • FCM immunophenotyping secara multiparameter
menggunakan antibodi monoklonal terhadap CD56, CD19, CD138 (CD38), dan CD45.
9
Aspirat BM + EDTA
Cuci dgn Phosphate –
Buffered Saline ( PBS )
Resuspensi dalam PBS + 1 % serum
bovin albumin
WBC 1-2 x 10 6/mL
.... FCM immunophenotyping 10
100 µl BM yg telah dicuci, vortek 3 dtk
Anti CD 138 dikonjugasi dgn PerCP
Anti CD 19 dikonjugasi dgn PE
10 μl
Anti CD 56
dikonjugasi dgn FITC
Anti CD 38 dikonjugasi dgn PerCP
Anti CD 45 dikonjugasi dgn APC
Inkubasi selama 25 menit , suhu kamar, di ruang
gelap
+ Lysis Solution, vortek segera 10 menit, inkubasi 10 menit , di ruang gelap
Cuci dgn PBS, sel difiksasi dgn +
500 µl PBS formaldehyde 1%
.... FCM immunophenotyping
• Didapatkan 50.000 sel berinG dan analisis dengan menggunakan FACS Canto II flowsitometri (BD Bioscience, San Jose, CA, USA)
• Sel plasma awalnya diidenGfikasi CD138 dan side sca4er, kemudian sel di gated dgn CD138 + dan dianalisis untuk CD56, CD19, dan CD45
11
Fig 1.Typical laboratory protocol for distinguishing neoplastic plasma cells (CD56+or-/CD19-/CD138+/CD45-) from reactive plasma cells (CD56-/CD19+/CD138+/CD45+) in patients with multiple myeloma.
12
.... FCM immunophenotyping
• Kasus CD 138 -‐, BM dilabel kembali dengan panel CD 56/CD 19 / CD38/ CD 45.
• Sel plasma di ga6ng menggunakan CD 38 dan side sca4er.
• Sel CD 38 + dengan low side sca4er dilakukan ga6ng ulang untuk hasil ekspresi CD 45 negaGf atau intermediate
13
Fig.2 Flow cytometric immunophenotyping of 2 cases (A and B) with CD138-negative neoplastic plasma cells.Plasma cell were gated with CD38+ and low side scatter, followed by selectionof CD 45-dim(A) and CD45-negative(B)cells. In both cases ( A and B), neoplastic plasma cell showed CD 19- and CD 56+ expression( A,dim and B, intermediate )
14
• Definisi : - CD 138 : deteksi sel neoplastik dan reaktif - Sel plasma neoplastik : CD 138+ / CD56 - atau + / CD
19 - / CD 45 - - Sel plasma reaktif : CD 138 +/ CD 56 - / CD 19 + / CD
45+ • Komponen monoklonal serum ( Komponen M ) - Konfirmasi protein monoklonal --> elektroforesis
protein - Persentase dari protein monoklonal diukur dgn
densitometer - Konsentrasi absolut dari protein monoklonal dihitung
dgn total konsentrasi protein serum
15
Analisis staGsGk • Data kontinu : mean ± SD dan dibandingkan dengan
tes Mann-Whitney U . • Data kategori : tes Fischer’s exact • Analisis korelasi : identifikasi kuatnya hubungan
antara komponen monoklonal dan fraksi sel plasma neoplastik atau proporsi sel berinti dari BM seperti yg telah ditentukan oleh flowsitometri.
• Semua analisis : SPSS 18.0 , P< 0.05 = signifikan
16
Table 2. Comparison of overall positive expression rates for CD56, CD19, CD138, and CD45 in neoplastic myeloma cells between the untreated and treated patients. 18
Table 3. Clinical and laboratory characteristics of 2 cases with CD138-negative neoplastic plasma cells according to FCM immunophenotyping.
19
Table 4. Comparison of the proportion of neoplastic plasma cells between the untreated and treated patients.
20
Fig 3. Comparison of the monoclonal immunoglobulin component (M-component) and the tumor burden of neoplastic plasma cells (PCs) in bone marrow (BM) aspirates according to flow cytometry (FCM).
21
(A) A weak positive correlation (r=0.15) was noted between the fraction of neoplastic PCs according to FCM and the M-component, but this was not statistical significant (P=0.245). (B) The proportion of neoplastic PCs in BM aspirates, i.e., fraction of neoplastic
PCs according to FCM×percentage of PCs among the total number of nucleated cells in the BM aspirates according to differential cell count, showed a statistically significant positive correlation with the M-component (r=0.26, P=0.045).
Diskusi • Sel plasma neoplastik sebelumnya telah diidentifikasi
sesuai dengan CD38 + + / CD45- atau ekspresi dim. • CD 38 : - petanda non-spesifik untuk sel plasma --> memiliki distribusi yang luas , ditampilkan pada permukaan sel hematopoietik dan nonhematopoietik. - sebagian besar ekspresi pada sel limfosit B dan
limfosit T. • Penelitian sebelumnya: mieloma mengekspresikan CD
45 +
22
...Diskusi • CD138 : ü identifikasi awal sel plasma --> hanya sel plasma yg
mengekspresikannya. ü petanda untuk identifikasi dan isolasi populasi analisis
FCM. ü Gating CD138 --> identifikasi populasi sel myeloma
lebih homogen daripada gating CD38. ü digunakan untuk analisis FCM pada kedua kelompok
pasien krn tdk ada perbedaan signifikan secara imunofenotipe sel myeloma.
23
...Diskusi
• Akan tetapi, ada komponen sel plasma yang tidak mengekspresikan CD 138
• Penelitian ini : - 68 penderita ( 97.1% ) = CD 138 + - 2 penderita ( 2.9 % ) = CD 138 - , namun CD38 +
untuk kelompok ini. ü Tak ada perbedaan profil immunophenotypic
(CD 56+/CD19-/CD45+) antara gating menggunakan CD 138 dgn CD38 + .
24
...Diskusi
• EMN : CD 138 saja tidak adekuat sebagai petanda untuk peng gating primer sel plasma.
• Deteksi simultan kedua CD 138 dan CD 38 digunakan sebagai rekomendasi --> meningkatkan presisi dan mengurangi variasi antara pengamat
• Penelitian ini gagal mendeteksi subpopulasi sel plasma neoplastik dengan gating CD 138 saja ( ekspresi dim sampai negatif ) .
25
...Diskusi
• Untuk mendeteksi sel mieloma dgn ekspresi CD 138 dim sampai negatif dapat dianalisis scr terpisah dari sel dgn CD 138 – dgn dasar ekspresi CD 38.
• Pengating awal menggunakan CD138 diikuti oleh CD38 : - hanya untuk sampel ekspresi CD 138 dim sampai negatif --> alur kerja yang disederhanakan untuk karakterisasi MM
26
...Diskusi
27
CD 38+/CD56+/CD19-
gating ulang sel dgn ekspresi CD 45 dim sampai negatif -->
eksklusi sel NK
Sel NK
...Diskusi • Semua kasus MM : - Antigen tunggal tidak dapat digunakan. - CD 138 terekspresikan tinggi --> tidak dapat
membedakan sel plasma neoplastik dgn sel plasma reaktif
- CD 56 terekspresikan terutama sel plasma neoplastik walaupun tidak di semua kasus
- CD 45 - /CD 45+ terdapat pada populasi sel plasma neoplastik
- CD 19 --> reaktif sel plasma ; pd sel plasma neoplastik ekspresi hanya negatif sampai dim 28
...Diskusi
• Mahmoud et al : Penegakkan ekspresi CD19 pada sel mieloma manusia akibat dari hambatan pertumbuhan dan mengurangi tumorigenisitas .
• PeneliGan ini : -‐ CD19 Gdak diekspresikan dalam sel plasma neoplasGk -‐-‐> jumlah penderita yg terbatas
-‐ hilangnya ekspresi CD19 dalam MM mewakili sel myeloma neoplasGk.
-‐ CD19 penanda paling berguna untuk membedakan sel plasma neoplasGk dari sel plasma reakGf.
29
...Diskusi
• Peran CD 45 pada MM masih kontroversial -‐-‐> adanya ekspresi yg berbeda-‐beda.
• MGUS = distribusi sama pada CD 45+ dan CD 45-‐ • Persentase sel plasma yg mengekspresikan CD 45 pd penderita MM baru atau relap -‐-‐> ekspresi nya lbh rendah daripada MGUS atau Smoldering myeloma.
• PeneliGan ini : >> sel plasma neoplasGk mempunyai pola ekspresi CD 56 -‐/+ dan CD 19 -‐ , dimana intensitas CD 45 bervariasi. ( negaGf sampai bright)
30
...Diskusi
• Sampai saat ini, Gdak ada kesimpulan yang pasG bisa ditarik mengenai CD45 ekspresi pada pasien MM, meskipun >> peneliGan setuju bahwa fenoGpe CD45 -‐ mewakili populasi sel plasma neoplasGk.
• CD 45 : -‐ Pola ekspresinya bervariasi -‐ Mempunyai keterbatasan -‐ Dikaitkan dgn hasil klinis yg buruk -‐ Berguna untuk analisis sel plasma dgn FCM
31
...Diskusi
• Restriksi sitoplasmik imunoglobulin rantai ringan terjadi akibat proliferasi sel plasma neoplasGk
• Pengukuran sitoplasmik imunoglobulin rantai ringan dgn FCM dapat menunjukkan pola restriksi -‐-‐> diagnosis MM.
• Metode FCM untuk deteks i s i top lasmik imunoglobul in ranta i r ingan mempunyai keterbatasan
32
...Diskusi
• Metode lain untuk mengukur sitoplasmik rantai ringan :
-‐immunohistochemical staining, -‐immunofixa6on electrophoresis, -‐serum free light chain assay.
• PeneliGan ini : dilakukan immunohistochemical staining pd spesimen BM untuk rantai ringan kappa dan lambda (data Gdak ditampilkan) untuk lebih mendukung idenGfikasi sel plasma neoplasGk.
33
Simpulan
• Panel ImunofenoGpe FCM : CD56/CD19/CD138 (CD38) / CD45, berguna untuk membedakan sel-‐sel myeloma neoplasGk dari sel plasma reakGf pada saat diagnosis dan selama pemantauan penderita MM
• CD19 merupakan anGgen yang paling penGng untuk mengidenGfikasi sel myeloma neoplasGk pada penderita MM
34
• CD 19.ppt • CD138.ppt • CD56_natural killer cell.ppt • Consensus internaGonal myeloma (2).ppt • cyyoplasmic imunoglobulin.ppt • enforced cd 19.ppt • EssenGal monoclonal gammopathy( MGUS).ppt • flowsitometri imunophenotyphing.ppt • imunohistokimia.ppt • MM.ppt • phenotypic plasma cell 1.ppt • ReacGve VS neoplasGc plasma cell.ppt • ImmunofixaGon.pptx • Serum-‐free light-‐chain measurement.pptx • CD45 expression by bone marrow plasma cells in.pptx • -‐PRINSIP PEMERIKSAAN FLOWCYTOMETRY PADA IMUNOPHENOTYPING.ppt
36
Recommended