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HPLC a UPLC ¿Como conseguir una buena transferencia de
métodos?
IV Reunión de Usuarios de Sistemas UPLC
24 Enero 2012, Madrid.
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¿Como conseguir una buena transferencia de métodos?
Escalado Geométrico
Escalado Químico
Herramientas disponibles para facilitar la transferencia – Columns Selectivity Chart
– Acquity Columns Calculator
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Parámetros a Modificar Dimensiones de columna Acquity UPLC™
Columna habitual HPLC 4,6 x 150 mm, 5 µm Longitud de columna (L) = 150 mm = 150000 µm Tamaño de partícula (dp)= 5 µm
Mantener capacidad de separación entre columna HPLC y columna UPLC
Capacidad de Separación: Relación entre Longitud y tamaño de partícula
Elegir columna UPLC con la misma relación L/dp que columna
HPLC
L = 150000 = 30000 dp 5
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Escalado de HPLC a UPLC™ - L/dp constante
HPLC
UPLC™
2,5 µm – 75 mm Inyección = 2,5 µL Caudal = 0,5 mL/min Rs (2,3) = 2,34
5 µm – 150 mm Inyección = 5,0 µL Caudal = 0,2 mL/min Rs (2,3) = 2,28
3,5 µm – 100 mm Inyección = 3,3 µL Caudal = 0,3 mL/min Rs (2,3) = 2,32
1,7 µm – 50 mm Inyección = 1,7 µL Caudal = 0,6 mL/min Rs (2,3) = 2,29
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Escalado Geométrico Método inicial
Temperatura: 30°C Caudal: 1.50 mL/min Analitos: Cafeina (100 µg/mL)
Hidroquinidina (33 µg/mL) 3-Aminobenzofenona (39 µg/mL)
Pesos moleculares: Menores de 500 Diluyente de muestra: DMSO Volumen de inyección: 10 µL Detección: 254 nm Fase móvil: A: 0.05% TFA en agua
B: 0.05% TFA en acetonitrilo
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Ejemplo Características de la Columna inicial
Fase estacionaria: XTerra® MS C18
Tamaño de partícula (dp):5 µm
Diámetro interno (id): 4,6 mm
Longitud (L): 150 mm
Cálculo: dp 150,000 µm
5 µm = = 30,000 L
Calculamos la relación L/dp como medida de resolución Con este dato, seleccionamos las dimensiones adecuadas de la columna de UPLC™
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Ejemplo Resultado Inicial
Abs
orba
nce
254
nm
Minutos
1
2 3
0 10 20 30
Columna: 4,6 x 150 mm, 5 µm L/dp = 30.000 Resolución (1,2) = 12 Resolución (2,3) = 28
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Ejemplo Gradiente inicial
Etapa Tiempo
(min)
Caudal
(mL/min)
%A %B Curva
Inicial 0 1,5 95 5 *
2 15 1,5 5 95 6
lineal
3 20 1,5 5 95 1
Regeneración
4 30 1,5 95 5 1
Re-equilibrado
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Ejemplo Características del Instrumento inicial
Waters Alliance® 2695 Solvent Manager – Una única bomba
– Gradiente con mezcla en baja presión
Waters Alliance® 2695 Sample Manager
Waters 2487 TUV a 254 nm
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Cálculo del volumen de inyección
Volumen de inyección inicial X Volumen de columna UPLC Volumen de columna HPLC
Escalamos el volumen de inyección de 10 µL en una columna de 4,6 x 150 mm a una columna de 2,1 x 50 mm
0,068 0,17 2,49
=
10 µL x 3,14 x (0,105 cm)2 x 5 cm 3,14 x (0,23 cm)2 x 15 cm
=
10 µL x 10 µL x
= 0,7 µL
Cálculo del volumen de inyección
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Escalado del volumen de inyección
4,6 x 150 mm
2,1 x 50 mm
20 µL inyección/2,49 mL = 0,8%
20 µL inyección/0,17 mL = 12%
2,49 mL
0,17 mL
El volumen de inyección debe ser menos del 5% del volumen de la columna. Intentar por debajo del 1% y determinar experimentalmente si se puede aumentar según condiciones cromatográficas.
Si se inyecta demasiado, puede generare una mala forma de pico debido a sobrecarga
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Escalado geométrico del flujo
d2 Col. UPLC d2
Col HPLC
Caudal = Caudal inicial x π x r2 col UPLC π x r2 col HPLC
Esta ecuación se reduce a:
Caudal = Caudal inicial x
1,5 mL/min X 2,12
4,62 = 0,31 mL/min
Escalamos el caudal de 1,5 mL/min en una columna de 4,6 x 150 mm a una columna de 2,1 x 50 mm
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Escalado del gradiente inicial
Etapa Tiempo
(minutos) Caudal %A
%B
Curva Duración
(min)
Duración del
gradiente (cv)
Inicial 0 1,5 95 5 * 0 0
2 15 1,5 5 95 6
Lineal 15
3 20 1,5 5 95 1
Regeneración 5
4 30 1,5 95 5 1
Re-equilibrado
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Duración del gradiente Expresado en función del volumen de columna
Etapa 2: Tiempo de gradiente de 15 min a 1,5 mL/min en una columna de 4,6 x 150 mm
Volumen de gradiente = Caudal x Tiempo = 1,5 mL/min x 15 min = 22.5 mL
Volumen de columna = π x r2 x L = 3,14 x 0,232 x 15 = 2,49 mL
Duración del gradiente (cv) = Volumen de gradiente Volumen de columna
Duración del gradiente = 22,5 mL 2,49 mL
= 9,03 cv
Nota: etapa 3 : 5 min = 3,01 cv y etapa 4 : 10 min = 6,02 cv
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Escalado del gradiente inicial
Etapa Tiempo
(min) Caudal %A %B Curva
Tiempo de gradiente
(min)
Duración del
gradiente (cv)
Inicial 0 1,5 95 5 * 0 0
2 15 1,5 5 95 6 15 9.03
3 20 1,5 5 95 1 5 3.01
4 30 1,5 95 5 1 10 6.02
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Escalado del gradiente inicial Manteniendo constante la duración del gradiente (cv)
Etapa 2 en HPLC: 15 min @ 1,5 mL/min con una duración en volúmenes de columna de 9.03 cv Cálculo de etapa 2 en UPLC: Se mantiene constante la duración del gradiente en volúmenes de columna 9.03 cv Volumen de columna UPLC = π x r2 x L = 3,14 x 0,1052 x 5,0 = 0,17 mL Volumen de gradiente UPLC = duración del gradiente (cv) x Volumen de columna = 9,03 cv x 0,17 mL = 1,54 mL Tiempo de gradiente (min) = Volumen de gradiente / Caudal = 1,54 mL / 0,31 mL/min = 5 min
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Escalado del gradiente inicial Columna de 2,1 x 50 mm
Etapa Tiempo
(min) Caudal*
%A
%B Curva Tiempo
gradiente (min)
Tiempo de gradiente
(cv)
Initial 0 0,31 95 5 * 0 0
2 5 0,31 5 95 6 5,0 9,03
3 6,67 0,31 5 95 1 1,67 3,01
4 10 0,31 95 5 1 3,33 6,02
Ajustamos el flujo para una columna de 2,1 x 50 mm manteniendo constante la velocidad lineal (*Escalado geometrico del flujo)
Ajustamos el tiempo manteniendo constante la duración del gradiente en volúmenes de columna
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Curvas de van Deemter (PM<500)
0
5
10
15
20
25
30
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Linear Velocity [mm/s]
HETP
(µ
m)
5 µm SunFire™ C18
3.5 µm SunFire™ C18
1.8 µm ACQUITY UPLC® HSS T3
1.7 µm ACQUITY UPLC® BEH C18
Diámetro Caudal de trabajo (mL/min)
4.6 mm 0.70 1.40 2.10 2.80 3.50 4.20 4.90 5.60 6.30 7.00 7.70 8.40
2.1 mm 0.15 0.30 0.45 0.60 0.75 0.90 1.05 1.20 1.35 1.50 1.65 1.80
1.0 mm 0.04 0.07 0.11 0.14 0.18 0.21 0.25 0.28 0.32 0.35 0.39 0.42
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Gradiente optimizado
Etapa Tiempo (min)
Caudal %A
%B
Curva Tiempo de gradiente
(min)
Tiempo de gradiente
(cv)
Inicial 0 0,6 95 5 * 0 0
2 2,61 0,6 5 95 6 2,61 9,03
3 3,48 0,6 5 95 1 0,87 3,01
4 5,22 0,6 95 5 1 1,74 6,02
Seleccionamos el flujo en UPLC™ y ajustamos el tiempo manteniendo constante el número de volúmenes de columna
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Escalado Químico
¿Que condiciona la selectividad de una columna?
– Fase enlazada
– Partícula
– Unión de la fase enlazada
– Endcapping
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Fase Enlazada
Diferentes tipos: – C18 - C8 – CN – Amide –PFP....
Diferentes enlaces: – Trifuncional
– Monofuncional
– Embeeded Group
Diferentes densidades
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Evolución del tamaño de partícula
10 min
80’s hasta hoy Partículas esféricas micro-porosas de 3.5 – 5 µm 1500 – 4000 psi 50.000 – 80.000 platos/metro Columnas de 3,9 x 150 – 300 mm
70’s (finales) Partículas Irregulares micro-porosas de 10µm 1000 – 2500 psi 25.000 platos/metro Columnas de 3,9 x 300 mm
10 min
70’s (inicio) recubrimiento pelicular no-poroso de 40µm 100 – 500 psi 1.000 platos/metro Columnas de 1m
10 min
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Fases Híbridas
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Evolución de las partículas
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End Capping
Si
CH3
CH3
CH3
Si
CH3
CH3
CH3 Cl
Es un proceso que implica una segunda derivatización con trimetilclorosilano ( C1), que bloquea los grupos hidroxilo libres, haciéndolos inaccesibles a nuestros analitos Primera Derivatización C18 Quedan ~ 50% OH Segunda Derivatización C1 Quedan ~ 40% OH.
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Waters Selectivity Chart
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Rellenos columnas BEH UPLC® BEH C18
– Relleno C18 trifuncional – Primera elección en columna UPLC – Máxima eficacia y óptima simetría de
picos
BEH C8 – Relleno C8 trifuncional – Nuevo proceso de endcapping – El mayor rango de pH
BEH Shield RP18
– Relleno monofuncional – Grupo polar embebido – Selectividad alternativa
BEH Phenyl
– Relleno Fenilo trifuncional – Combinación única de partícula y
ligando – Amplio rango pH
BEH HILIC – Partícula BEH sin funcionalizar – Relleno para bases muy polares
BEH Amide
– Relleno trifuncional con grupo amida – Modo Hilic para ácidos muy polares y
azúcares
Tipo Ligando Densidad Ligando
Carga Carbono
Endcapping Rango pH
Trifuncional C18 3.1 µmol/m2 18% Proprietary 1-12
Trifuncional C8 3.2 µmol/m2 13% Proprietary 1-12
Monofuncional Grupo Polar Embebido
3.3 µmol/m2 17% TMS 2-11
Trifuncional C6 Fenil 3.0 µmol/m2 15% Proprietary 1-12
Sin ligando --- --- --- 1-8
Trifuncional Amide 7.5 µmol/m2 12% None 2-11
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Rellenos columnas HSS UPLC® HSS T3
– Tecnología T3 de enlazado y endcapping – Mayor retención para compuestos polares
HSS C18 – Alta cobertura, relleno C18 trifuncional – Universal, relleno C18 de altas
prestaciones – Proceso de endcapping patentado para
picos óptimos
HSS C18 SB – SB: Selectividad para Bases – Sin encapping: selectividades silanólicas
alternativas – Diseñada para desarrollo de métodos
HSS PFP – Selectividad excepcional para isómeros
posicionales, compuestos halogenados y compuestos polares
HSS CN – Estable, compatible con RP & NP, química
CN reproducible
– Baja hidrofobicidad y selectividad única comparada con ligando C18
Tipo Ligando Densidad Ligando
Carga Carbono
Endcapping Rango pH
Trifuncional C18 1.6
µmol/m2 11% Proprietary 2-8
Trifuncional C18 3.2
µmol/m2 15% Proprietary 1-8
Trifuncional C18 1.6
µmol/m2 8% None 2-8
Trifuncional Propilfluorofenil
3.3 µmol/m2 7.5% None 2-8
Monofuncional Diisopropil Ciano
2.0 µmol/m2
5.5%
None
2-8
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Rellenos columnas CSH UPLC®
CSH C18 — Media/alta cobertura trifuncional C18
— Superior forma pico para productos básicos en fases móviles de baja fuerza iónica
— Menor retención para bases (vs. BEH C18)
CSH PFP Fluorofenil — Forma pico excepcional y baja retención para
bases con grandes diferencias en selectividad
— Elevada reproducbilidad
CSH Fenil Hexil — Excepcional forma de pico para compuestos
básicos
— Selectividad complementaria para compuestos aromáticos
Tipo Ligando Densidad Ligando
Carga Carbono
Endcapping Rango pH
Trifuncional C18 2.3 µmol/m2 15% Proprietary 1-11
Trifuncional Propilfluorofenil 2.3 µmol/m2 10% None 1-8
Trifuncional C6 Fenil 2.3 µmol/m2 14% Proprietary 1-11
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UPLC Columns calculator
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Condiciones Cromatográficas HPLC
Condiciones Cromatográficas HPLC : Columna: XTerra® MS C18 4,6 x 150 mm, 5 µm Fase Móvil A: 0,1% TFA en agua Fase Móvil B: 0,08% TFA en acetonitrilo Caudal: 1,0 mL/min Perfil Gradiente: Tiempo Perfil (min) %A %B curva 0,0 92 8 2,0 92 8 6 32,0 50 50 7 35,0 10 90 6 36,0 92 8 6 41,0 92 8 6 Vol. inyección: 10 µL Conc. muestra: 100 µg/mL Temperatura: 40 oC Detección: UV @ 330 nm Velocidad adquisición datos: 5 pts/sec Constante Tiempo: 1,0 Instrumento: Módulo Separación Alliance® 2695 con 2996 PDA
©2012 Waters Corporation 35
AU
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
Minutos 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00
Método HPLC original: Derivados de ácido cafeico en Echinacea Purpurea
Pc = 94
1 2 3
4
5
Nombre Tiempo Retención Resolución USP 1. Acido caftárico 5,71 2. Acido clorogénico 7,07 4,20 3. Cinarina 13,96 21,19 4. Equinacosida 16,54 10,16 5. Acido cicoico 20,32 17,14
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AU
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
Minutes 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
AU
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
Minutos 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00
Opción 1: Escalado geométrico del gradiente a la misma velocidad lineal de HPLC
HPLC
UPLC™
Pc = 94
Pc = 99
35.00
NameRetention Time
USP Resolution
caftaric acid 5.71chlorogenic acid 7.07 4.20cynarin 13.96 21.19echinacoside 16.54 10.16cichoic acid 20.32 17.14
NameRetention Time
USP Resolution
caftaric acid 1.99chlorogenic acid 2.38 3.97cynarin 4.85 25.00echinacoside 5.93 15.09cichoric acid 7.11 19.62
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AU
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
Minutos 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00
Opción 2: Escalado geométrico del gradiente a velocidad lineal de UPLC
NameRetention Time
USP Resolution
caftaric acid 5.71chlorogenic acid 7.07 4.20cynarin 13.96 21.19echinacoside 16.54 10.16cichoic acid 20.32 17.14
HPLC
NameRetention Time
USP Resolution
caftaric acid 0.71chlorogenic acid 0.87 3.96cynarin 1.72 22.12echinacoside 2.06 11.40cichoric acid 2.44 14.28
UPLC™
Pc = 94
Pc = 85
AU
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
Minutos 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00
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