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ESTUDIO CITOGENÉTICO : I. Cultivo Celular II. Análisis Cromosómico
Lic.TM. Héctor Herrera Reynoso Esp: Citogenética y Biología Molecular
CULTIVO CELULAR
Los cultivos celulares son un procedimiento tecnológico de mantenimiento y estudio de células vivas en un medio artificial que permite reproducir, de manera bastante fiable, las condiciones biológicas que las células tienen en su lugar de origen.
Potencialmente todas las células son cultivables, pero cada una de ellas presenta peculiaridades y requerimientos específicos.
Cultivo Celular: Estudio CitogenéticoMEDIOS DE CULTIVO CELULAR
Son compuestos que contienen : Todos los aminoóacidos, vitaminas,cofactores, coenzimas, enzimas, sales, iones, indicadores de pH.
Existen distintos medios de cultivo los cuales se seleccionan dependiendo del tipo de muestra ó tipo de célula a cultivar y lograr que estos respondan adecuadamente con un crecimiento celular.
Los medios de cultivo celular se seleccionan dependiendo del tipo de estudio citogenético a realizar (Cultivo de alta resolución, Estudio de fragilidad cromosómica, etc) o del tipo de anomalía cromosómica a demostrar (Estudio de X frágil).
Cultivo Celular: Estudio Citogenético
ESTUDIO CITOGENETICO
MEDIO DE CULTIVO BASE
MEDIO DE CULTIVO ESPECIFICO
SANGRE PERIFERICA RPMI 1640, Mc Coy’S Modified, Tc 199
PB Max Karyotiping Medium, Createst Lynfocitos
MEDULA OSEA RPMI 1640, Mc Coy´S Modified
Marrou Max Karyotiping Medium
LIQUIDO AMNIOTICO HAM F-10, HAM F-12 AMNIOMAX, Chang B+C
RESTOS ENDOUTERINOS HAM F-12, HAM F-10 AMNIOMAX, Chang B+C
PIEL RPMI 1650 Chang B+C
Cultivo Celular: Estudio citogenéticoSUPLEMENTOS.- Además del medio de cultivo base, las células requieren para su crecimiento y división celular de suplementos, los cuales serán utilizados dependiendo del tipo de células que se desea cultivar y del tipo de estudio citogenético requerido.
1.- SUERO BOVINO FETAL (SBF) : se utiliza a diferentes concentraciones: 5% para el estudio de cromosoma X frágil
20% para el cultivo de SP y MO 30% para el cultivo de células fetales 30% para el cultivo de tumores2.- PENICILINA + ESTREPTOMICINA: utilizado como antibióticos para evitar la
contaminación bacteriana.3.- ANTIMICOTICOS: como la Fungizona para evitar el crecimiento de hongos, si
es que fuera necesario.
Cultivo Celular: Estudio CitogenéticoSUPLEMENTOS:4.- L- GLUTAMINA: Es un aas que en su forma levógira mejora el crecimiento
celular.5.- ESTIMULANTE MITOGENICO: Utilizado para estimular el proceso de mitosis en
el cultivo de linfocitos. Como: - Fitohemaglutinina (PHA) - Concavalina A (ConA) - Pockeweed Mitogen Además se utilizan suplementos o reactivos específicos cuando se requieren realizar estudios citogenéticos especiales como:.- Estudio Cromosoma X frágil: Se cultiva la SP (linfocitos) en medio TC 199 ó RPMI 1640 pero deficientes en ácido fólico, más L-glutamina ó bien utilizando la Fluorodeoxiuridina (FUdR) ó Metotrexate (MTX) que son inhibidores de las enzimas que participan en la síntesis de novo del ácido fólico.
Cultivo Celular: Estudio Citogenético
Medios de Cultivo y Suplementos. Formas de presentación diferentes.. Medio Líquido y en polvo. Microcultivo
Cultivo Celular: Estudio Citogenético
Preparacion de los Medios de Cultivo . Pesar el medio. Diluir en agua destilada. Agitar. Añadir Suplementos P+S L-Glutamina SBF. Ajustar el pH
Cultivo Celular: Estudio Citogenético
Esterilización de los Medios de Cultivo. Sistema de filtración al vacio. Filtros millipore 0,22um. Bomba de vacío. Alicuotar en frascos estériles. Control de esterilidad en estufa a 37ºC por 48 hrs.
TECNICAS DE ESTUDIO
CITOGENETICO
Algo de historia
primer mapa de los patrones de bandas Gde cromosomas humanos publicado (1971)
grupos cromosómicos
(1956)
J.H.Tjio
(1966)Lejeune
Pateau(1961)
Técnica Convencional
Cariotipo humano: 46 XY
Bandeo Cromosómico: Bandas GTG
metaphase
DNA replication
chromosomes condense
nuclear envelope breaks down
chromosomes aligned on spindle fibers
Técnicas de Estudio Citogenètico
Estudio Citogenético: Estudio Cromosómico Células estén división celular (Mitosis) Análisis cromosómico (morfología y patrón de bandas) en Metafase. Algunas células normalmente en proceso de proliferación y diferenciación por lo que NO necesitan de un estimulante mitogénico para que entren división. Otras células ya diferenciadas requieren de un estimulante mitógeno para que entren en mitosis. Cultivos Indirectos y Cultivos Directos Cultivos a corto plazo y cultivos a largo plazo
Cultivo Celular
A.- Cultivo Celular Indirecto1.- Cultivo de Linfocitos .- Cultivo a corto plazo (72 horas) .- Muestra: Sangre Periférica .- Se realiza para detectar cualquier alteración
cromosómica constitucional. .- Se utiliza para detectar las autosomopatías
(Sindromes Down, Patau, Edwards, etc) y las Gonosomopatias (Síndromes de Turner,
Triple X, Klinefelter, etc)
Técnica de cultivo de linfocitos(sangre periférica)
Toma de muestra
Siembra
Cosecha
Preparación de laminas
Coloración y observación metafases
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
Toma de Muestra. Condiciones de ascepcia. Anticoagulante heparina. Volumen de muestra
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
Eliminar el paquete de GR dejando la interfase y el plasma. La mezcla de la interfase (Linfocitos)
con el plasma.
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
Volumen del medio de cultivo (5-10 ml) Mayor esterilidad posible. Frascos de cultivo (Falcon flask, vidrio)
RPMI-1640 es un medio de cultivo que fue desarrollado por Moore et al. en el Roswell Park Memorial Institute, de ahí el acrónimo RPMI. Este medio contiene una gran cantidad de fosfato y está formulado para su uso en una atmósfera de dióxido de carbono 5%.
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
Volumen de muestra Mezcla de Interfase
plasma 1.0 – 1.5 ml Sangre total 0.5 ml ó 30 gotas. Microcultivo V gotas. Mezclar suavemente e incubar
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
Incubar a 37ºc por 70 a 72 horas
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
Después de las 72 horas sacar el frasco de cultivo la estufa.
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
COSECHA1. Colchicinización. Agregar Colchicina 0.1 ugr/ml : 50 –100 ul.. Mezclar suavemente. Incubar
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
Incubar a 37ºC por 50 a 60 minutos
El colcemid es un análogo de la colchicina que despolimeriza los microtúbulos del citoesqueléto, impidiendo la formación del huso mitótico, y por lo tanto bloqueando la mitosis en la etapa de metafase
• Por su unión reversible con la tubulina citoplasmática impide su polimerización dentro de los microtúbulos celulares, quedando inhibida la metafase de la división celular.
Sacar el frasco de la estufa, trasvasar a un tubo y centrifugar
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
. Centrifugar a 1000 rpm por l0 minutos.
. Con una pipeta pasteur eliminar el sobrenadante.. Trabajar siempre con el sedimento
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
2. Hipotonización. Adicionar solución hipotónica: Cloruro de Potasio 0.075 M
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
. Adicionar 6 ml de ClK 0.075M
. Agitar con pipeta pasteur
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
. Incubar a 37ºC por 10 a 15 minutos.
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)3.- PREFIJACION: Sacar el tubo de la estufa y agregar 10 gotas de fijador. Solo para parar la acción de la solución hipotónica. Centrifugar a 1000 rpm por 10 minutos
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
4. FIJACIÓN: . Adicionar Fijador (5ml) . Fijador: Metanol (1Vol) + Acido Acético Glacial (1Vol)
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
. Adicionar 5 ml de fijador
. Mezclar con pipeta pasteur
. Dejar a TA por 20 minutos o dejar en refrigeración a + 4ªC por días a semanas.. Centrifugar
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
. Se realizan 2 ó 3 lavadosEl sedimento se resuspende con 1 a 2 ml de fijador.
5. Preparado Cromosómico. Adicionar 3 a 4 gotas sobre una lámina portaobjetos helada.. Secar al calor de un mechero.. Guardar en una gradilla
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
Cromosomas sin bandeo Cromosomas con Bandas G
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
Elaboración del Cariograma
CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)
ANALISIS CROMOSOMICO
Patrón de Bandas GTG de Cromosomas
Cultivo Celular
B. Cultivo Celular Directo: 1.- Cultivo de Líquido Orgánico: .- No se hace un cultivo celular propiamente dicho .- Se realiza directamente un choque hipotónico de las células y
posterior fijación. .- Permite demostrar alteraciones cromosómicas numéricas y/o
estructurales que indican la presencia de células neoplásicas. 2.- Cultivo de Médula Osea: .- Cultivo a corto plazo (24-48-72 horas) .- Muestra: Aspirado de Médula Osea .- Realizado para el estudio cromosoómico en pacientes con desordenes mieloproliferativos (Síndromes Mielodisplásicos, Leucemias)
Estudio Citogenético de Líquidos Orgánicos
Obtención de la Muestra Volúmen de Obtención Anticoagulante Heparina Conservación de la
MuestraCaracterísticas Físicas Color Aspecto
Criterios de Malignidad1. Alteraciones Numéricas (ploidía) Hipodiploidía : N° Cr < 46 Hiperdiploidía : 69 > N° Cr > 46 Poliploidía : N° Cr > 69
Estudio Citogenetico de Liquidos Orgànicos
2. Alteraciones Estructurales .- Ring,Translocaciones, deleciones, etc. .- Cromosomas marcadores (mar) .-Dobles minutes (Dm) .- Figuras Trirradiadas, Tetrarradiadas. .- Rupturas Cromosomicas (gap,cap)
CULTIVO DE MEDULA OSEA
CULTIVO MEDULA OSEA
Cultivo Celular3.- Cultivo de Piel .- Cultivo largo plazo (14-21 días) .- Muestra: Biopsia de piel (Cultivo de fibroblastos) .- Realizado generalmente cuando se sospecha de un mosaicismo
cromosómico no detectado en Cultivo de Linfocitos.
4.- Cultivo de Tumores: .- Cultivo largo plazo (14-30 días) .- Muestra: Biopsia del tumor ó la pieza quirúrgica del tumor .- Realizado para demostrar la presencia de una alteración numérica
y/o estructural de los cromosomas que estén asociados a la presencia de células tumorales ó células neoplásicas.
.- Brindan información sobre el diagnóstico, estadiaje, pronóstico y evaluación del tratamiento de los tumores.
Cultivo Celular5.- Cultivo de Células Fetales.- Cultivo a largo plazo (10-14 días).- Muestra: Liquido Amniótico obtenido por Amniocentesis alrededor de la 16ª semana de gestación..- Se efectúa para hacer el diagnóstico prenatal de una alteración cromosómica.6.- Cultivo de Vellosidades Coriales: .- Cultivo corto plazo (24 –48 horas) y Cultivo largo plazo (10-14 dias) .- Muestra: Biopsia aspiración de Vellosidades Coriónicas alrededor de la 10ª
semana de gestación..- Se efectúa para hacer el diagnóstico prenatal de una alteración cromosómica.7.- Cultivo de Restos Endouterinos: .- Cultivo largo plazo (10-14 días) .- Muestra: Legrado uterino y/o producto abortado .- Se realiza para detectar una anomalía cromosómica del producto.
Imagen en la pantalla del ultrasonido
Amniocentesis
Cultivo de Vellosidades Coriales
Cultivo de vellosidades corialesBiopsia transcervical Biopsia transabdominal
MUCHAS GRACIAS herrerahh7@yahoo.es
M
BANDEO CROMOSOMICO
Existen varias técnicas de bandeo cromosómico, que nos permiten identificar individualmente los cromosomas, lo cual facilita la identificación de una alteración cromosómica numérica y especialmente demostrar la presencia de alteraciones cromosómicas estructurales.
• Permite precisar la localización de genes aportando información al llamado mapeo genético.
• Tener un mayor conocimiento acerca de la estructura cromosómica y de los reordenamientos que se producen en las distintas alteraciones tales como:
Fusiones y fisiones céntricas Translocaciones recíprocas y en tandem Inversiones peri y paracéntricas Deleciones Duplicaciones Constricciones secundarias Fracturas cromosómicas, etc.
BANDAS CROMOSÓMICAS Los bandeos cromosómicos pueden clasificarse en
morfológicos y dinámicos:
A.-LOS BANDEOS MORFOLÓGICOS: se obtienen basándose en técnicas inherentes a la
heterogeneidad de la cromatina. Existe una relación con proteínas (histónicas y no histónicas) e interacciones ADN. A su vez clasificados en:
Técnicas de tinción diferencial Métodos de tinción selectiva Coloraciónes con fluorocromos específicos aislados o
combinados con colorantes no fluorescentes y tinciones con Anticurpos fluorecentes.
B.-LOS BANDEOS DINÁMICOS: Basados en: técnicas que implican la incorporación de
una base análoga, bromo-deoxiuridina (BrdU), en el ADN durante la fase S del ciclo celular. Se denomina también bandeo de replicación debido a la relación existente entre el tiempo de incorporación del BrdU y el patrón de replicación.
Al incorporar BrdU durante la fase de replicación temprana se obtiene un patrón de bandeo R destacándose las regiones ricas en G-C. Luego , los cromosomas pueden visualizarse utilizando distintos métodos de tinción que emplean colorante como el Giemsa o el naranja de Acridina o utilizando Anticuerpos específicos.
TIPOS DE BANDEO CROMOSOMICO
Técnicas de bandas QTécnicas de bandas G (GTG)Técnicas de bandas RTécnicas de bandas C
Técnica de bandas Q
• Fue la primera metodología de bandeo cromosómico ( llamado así por la sustancia fluorescente empleada la quinacrina)
• 1970, Casperson y colaboradores la desarrollaron.• 1971 - (Conferencia en Paris) fue denominada como
la técnica de banda Q.
UTILIDAD• Demostrar la porción distal del brazo largo del cromosoma Y
que se tiñe con mas intensidad que los demás cromosomas.• Las regiones pericentroméricas de los cromosomas 3 y 4 , y
las regiones satelitales y pericentroméricas de los cromosomas acrocéntricos muestran variaciones significativas conocidos como polimorfismo o heteromorfismos demostrados con estas técnicas.
• La fluorescencia mayor depende del ADN, si la región es mas rica en adenosina y timina (A-T) habrá mayor fluorescencia, pero si es el ADN rico en (G-C) la fluorescencia tiende a apagarse.
DESVENTAJA
• Es el uso de la fluorescencia , que después de que es usada desaparece progresivamente y es por ello que la observación, el análisis cromosómico así como la toma de microfotografía debe ser rápida para su observación en el microscopio.
SOLUCIONES:
1. Buffer Sorensen´s a pH 5.62. Colorante Dihidrocloruro de
Quinacrina al 1%
PROCEDIMIENTO :
1. Se tiñen las láminas con el colorante de Quinacrina por 15 a 20´ en oscuridad.2. Se lavan las láminas con Buffer Sorensen´s.3. Se monta con una laminilla con
el Buffer.4. Examinar al microscopio de
fluorescensia utilizando una luz de longitud de onda de 450 a 500nm
Bandeo Q (quinacrina)
Tinción con Mostaza de quinacrinaBandeo Q
Tecnica de bandas G
• La técnica de bandas G ( Giemsa ) obtenidas por digestión proteolítica con el uso de la enzima tripsina, es la mas usada y considerada como una técnica estándar.
• Es una técnica conocida como GTG (Bandas G por tripsina usando Giemsa), es un mecanismo aun no aclarado.
Clark y Coleg.
Histonas ricas en Arginina
En las bandas GTG
No tanto con la perdida de
ADN y proteina de cromosomas durante
el tx con tripsina
Dos tipos de bandas
Bandas G +(oscuras)
Bandas G -(claras))
Distribución de las prot. Cromosómicas y de ADN
Relativamente ricas en prot.
DisulfuroSulfihidrilos
Tecnica de Tecnica de bandas Gbandas G
• El patrón de bandas es similar entre (G-Q)• Es de uso rutinario• La banda G obtenida por GTG es muy
superior en la resolución,comparada con aquellas técnicas que utilizan Fluorocrómos.
PROCEDIMIENTO :
1. Se coloca en baño Maria a 37ºC el frasco Nº 1 de solución de tripsina 1%
2. Se coloca las láminas con la preparación cromosómica (menos de una semana) en el frasco Nº1 x 10´´.
3. Enjuagar las laminas en el frasco Nº2 de solución salina fisiológica.
4. Se colocan las laminas en el frasco Nº3 de colorante Giemsa 4% x 6 a 8´.
5. Lavar con agua corriente y dejar secar y observar en el microscopio.
SOLUCION :
1. Solución de trIpsina al 1%2. Solución salina fisiológica 3. Colorante Giemsa 4%
. Bandeo GTG: - Tripsina 1% (buffer) - Solución Salina Fisiolog. - Giemsa 4%
bandas G-pálidas bandas G-oscuras DNA rico en GC DNA rico en AT replicación temprana replicación tardía Muchos genes Pocos genes
Esta imagen muestra cada cromosoma humano normal comparado con su idiograma, o mapa, de bandas G, un esquema acordado internacionalmente para los patrones de bandas.
Técnica de bandas R• Se hace el tratamiento de las laminas a altas
temperaturas en varios buffer• Tinción con Acridina Oramge o Giemsa• Las bandas que producen estas técnica en los
cromosomas humanos son el reverso de bandas G o Q es decir que las bandas claras en Q o G son bandas oscuras en R.
VENTAJAS• Que la regiones teloméricas de los cromosomas
son mas teñidas, a diferencia de las técnicas de bandas Q y G en las que no son tan claras.
• El tratamiento con calor induce denaturación de las proteínas cromosómicas así como de las secuencias del ADN ricas en nucleótidos(A-T), mientras que el ADN rico en G-C de las bandas R en una configuración nativa.
PROCEDIMIENTO :
1. Preparar el buffer sorensen´s en un koplins y llevar a baño Maria 85ºC
2. Colocar las láminas preparadas(1-2 sem) en el buffer sorensen´s durante 10´.
3. Lavar las laminas de buffer S.4. Colocar en colorante de
Giemsa por 5´.5. Lavar, dejar secar y observar al
microscopio
SOLUCION:
1. Buffer sorensens(0.06,pH6.59)
2. Colorante de Giemsa.
CROMOSOMAS HUMANOS: BANDAS RGT
Bandas R-útil para teñir los extremos distáles de los cromosomas (deleciones o reorganizaciones distales)
Propiedades diferenciales entre las bandas G y R
G RComposición bajo contenido G+C Alto contenido G+CReplicación tardía tempranaSecuencias repetidas Line (L1) Sines (alu)Quiasmas Raros AbundantesNº de genes Escaso AbundantesClase de genes Específicos Domésticos
Tecnica de bandas C
• La técnica de bandas C produce una tinción selectiva de la heterocromatina constitutiva ,estas bandas están localizadas en la región pericentromérica de los cromosomas humanos.
• 1971- Fue un método descrito por Arrighi y Hsu.
APLICACION
Demuestra variación de tamaño de la región de heterocromatina constitutiva presente en las regiones pericentroméricas de los cromosomas.
Para los cromosomas 1,9,16 y brazos largos del cromosoma Y.
Polimorfismos. Inversiones pericentroméricas.
Desnaturalizar
Extraer el material cromosómico Alcali
Incubado en solución salina
GIEMSA
Tecnica de Tecnica de bandas Cbandas C
SOLUCION :
• HCL 0.2N• Ba (OH)2 5%• Solución saluria de
citrato de sodio(2xSSC)• Giemsa
PROCEDIMIENTO :
• Tratar la laminas con HCL 0.2N X 20´´ a Tº ambiente
• Lavar lamina con H2O destilada.• Tratar las laminas con sol.
Ba(OH)2 al x 5%x 1a2´.• Lavar con H2O destilada hasta
eliminar el exceso de bario.• Colocar las laminas en soluc. 2 x
SSC a 60ºC X 2 horas .• Lavar con H2O destilada• Teñir con Giemsa 5% en Buffer
sorensen’s a pH 7.0 x 15´• Lavar con H2O destilada y
observar al microscopio.
Bandeo C tiñe específicamenteregiones centroméricas
DETERMINACION DEN Nº DE BANDAS CROMOSOMICAS
MUCHAS GRACIAS herrerahh7@yahoo.es
M
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