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Dr.a. Juliana Lopes AlmeidaMédica veterinária
Mestrado em ciências agrárias, reprodução equina (Universidade de Brasília - UNB)Doutorado em patologia comparativa, reprodução equina (University of California, Davis, EUA, UCDAVIS)
Pós doutorado em Biotecnologia da reprodução (Universidade de Fortaleza, UNIFOR)Diretora do Hospital Veterinário Metropolitano - HVM
Biotecnologia da reprodução compreende todas as técnicas utilizadas como ferramentas para aumentar a eficiência reprodutiva dos animais.
Viabilidade da criação de cavalos = sucesso na reprodução
Indústria do cavalo -movimenta cerca de R$ 7,5 bilhões anuais
3,2 milhões de empregos diretos e indiretos
Investimento no melhoramento genético
Caracterização da Reprodução da égua: Poliéstricas estacionais:▪ Foto-período dependentes;▪ Duração variável (Hafez, 1995, Romano et al. 1998);
Puberdade - 12 a 18 meses; Maturidade sexual - 24 meses:▪ Variabilidades (McKinnon, 1993);
HIPOTÁLAMO
HIPÓFISE
OVÁRIO
ÚTERO(Placenta)
GNRH +
LH/FSH +
ESTRÓGENOFSH - / LH +
INIBINAFSH -
PGF2 alfa
PINEAL
AUMENTO
MELATONINA -
PMSGProgesterona Estrógeno
Gestação 315 360 dias; Reconhecimento materno:▪ Previne regressão do CL (Stanbenfeld & Edqvist, 1996);
Fixação Embrionária:▪ 16o dia pós ovulação;▪ Cálices endometriais a partir de 35 dias:▪ Gonadotropina Coriônica Eqüina ou PMSG: Função:
Corpos Lúteos Acessórios;▪ Função;▪ Geralmente são formados 3 a 5 por ovário;▪ Formados pela ação da PMSG;▪ Persistem até 180 dias;
Hormônio Ação Indicação Produtos Dosagem ObservaçãoGNRH Ovulação - Indireta Indução de Ovulação em
36 horasDeslorelina
1,0 mg IV ou 1,5 mg IM
Folículo maior ou igual a 35 mm e edema de útero
Luteinização de CL
Ocitocina contratilidade uterina - miométrio
Limpeza do útero Ocitocina 10UI/ml
20UI Im ou IV Pré sensibilizado por estrógenos
Retenção de placenta Expulsão da placenta e lóquios
20UI Im ou IV
Indução de parto Parto 40 a 100 UI IM
Estrógenos - Benzoato ou cioponato de estradiol
Indução de cio coleta de sêmen ou cio silencioso
ECP, Sincrodiol, Gonadiol, estrogin
1 a 5 mg Verficar ausência de CL e Progesterona
Relaxamento de cérvice ou cio sem edema uterino
Presença de folículos mas sem edema uterino ou aberuta de cérvice
Indução de edema Indução de edema em éguas em anestro
10 a 15 mg divididos em 3 dias ou dose única
Protocolo de anestro uso com Progesterona
Progesterona Preparo do útero para receber o embrião
Éguas em anestro Progesterona 300 mg IM semanal, Altrenogest
1500 mg Protocolo de anestro uso com Progesterona
Complemento de progesterona endógena
Éguas gestantes com sinais de pouca progesterona endógena ou receptoras para receber embrião
Sinais de edema, Cl hipoecogênico, útero flácido
Supressão de cio Éguas em prova
Hormônio Ação Indicação Produtos Dosagem ObservaçãohCG Ovulação - direta Indução de ovulação em
36 horasVetecor, chorulon
1500UI
Luterinização de CL
Prostaglandina F 2 alfa
Regressão de Cl Indução de cio Lutalyse, Sincrocio, Preloban, Sincrosin
dinoprost 7,5 mg
5 dias após ovulação
Sincronização receptoras intervalo de 0 a 2 diasCL persistenteAborto ou Absorção Até 60 dias de gestaçãoIndução de parto
EPE Gonadotropina Superovulação EPE 8 mg IM BID Trata um ciclo pós PGF por 6 dias
Anestro persistenteOvulação - direta Indução de Ovulação em
36 horas6 mg IV
Entende-se por inseminação artificial o depósito mecânico de sêmen no aparelho reprodutivo da fêmea
Vantagens da utilização de um programa de I.A. na espécie equina.
Melhor aproveitamento do Garanhão
Evita doenças transmissíveis através da cobertura
Evita ferimentos durante a cobertura do garanhão e da égua
Volume de 020 a 100 mL
Aparência: leitosa, cremosa, opalescente ou aquosa
Cor: branco opalescente a leitoso
Odor: “sui-generis”
Motilidade: proporção de sptz móveis em umaamostra de semen
Vigor: velocidade do movimento de sptz com motilidade progressiva (0-5)
Porque é desejável refrigerar o sêmen?
o metabolismo do sptz a temperatura corporal e ambiente é máximo.
produtos do catabolismo do sptz (ác. lático e/ou CO2) aumentam a acidez do meio causando danos as células espermáticas.
peroxidação das membranas lipídicas causam danos as células espermáticas.
Limitações
Choque térmico: alterações no espermatozóidesquando eles são rapidamente resfriados da temperatura corporal até próximo a 0°C
Choque osmótico
SPTZ para cada 15° C de redução, o metabolismo é reduzido em 45%.
SPTZ armazenados a 5°C: requerimentos metabólicos serão apenas de 10%
Faixa crítica = 19 a 8°C
SPTZ são insensíveis a velocidade de resfriamento até atingir 19°C
A partir de 19ºC; veloc. 0,05°C/min.
Diluição 1:1 –Utilização 24-48 h
Diluidor mais utilizado: diluidor de Kenney (1975) Glicose -49g Leite desnatado -24g Bicarbonato de sódio a 10% -7,5ml Gentamicina -200mg Água bidestilada -1000ml
Doses inseminates: 109, 10 a 30 mL
Refrigeração computadorizada
Unidades de refrigeração e conservação (contêiner):
Equitainer I, II e III
ExpectaFoal
Equine Express
Salsbro Box (contêiner sueco)
Celle container (container alemão)
Botutainer, Botubox (containers brasileiros)
Grande vantagem de conservação de sêmen por tempo indeterminado
Forma de seguro reprodutivo do animal
Causa graves lesões ao espermatozóide
Apenas 24% dos garanhões apresentam boas taxas de concepção
Não existe um protocolo ideal
Diluidores
Tampão, antibióticos, gema ou leite, açucares e crioprotetor
Avanços na composição dos diluidores
▪ Açucares: lactose, rafinose e trealose
▪ AA: glicina
Lipoproteínas de baixa densidade da gema, lecitina de soja
Redução do glicerol em combinação com as amidas nos meios comerciais
A centrifugação amortecida: Composto iodado não iônico, chamado = iodixanol, é utilizado como
gradiente de densidade ou como amortecedor na centrifugação do sêmen.
Ausência de lesões causadas pelo processo de centrifugação.
Centrifugação com solução de partículas de sílica silanizada
Utilização de um filtro específico feito de membrana hidrofílica sintética
Preparo para I.A.
24 hs antes da ovulação
Folículo pré-ovulatório (35 mm ou maior)
Uso de 2500 a 3300 UI de hCG
Ovulação em 24-48 h
Inseminação histeroscópica
o sêmen depositado próximo ao oviduto, sobre a junção útero-tubárica (papila), através de um aparelho de endoscopia via lumen uterino
Fibroendoscópio
Redução da quantidade de espermatozóides: 5 a 40 x 106
Deposição ipsilateral da ovulação
Sêmen sexado
Éguas em competição; Éguas novas (2 anos); Éguas com méritos genéticos; Vários potros ou éguas; Éguas com problemas reprodutivos; Éguas com problemas não-reprodutivos; Pesquisa Espécies em extinção
Éguas jovens, reprodutivamente saudáveis 3-10 anos de idade, 1-2 potros Ciclo estral normal, livre de fluido uterino Qualidade do endométrio
Boa mãe Tamanho da égua capacidade lactante bom temperamento
Três tipos de receptoras: Éguas intactas (mais comum) Ovariectomizadas, éguas tratadas com progesterona Não cíclicas, éguas tratadas com progesterona
Quando: D6: vitrificação, criopreservação, bissecção; D7-8: maioria das lavagens; D9: maior índice de recuperação, embrião
facilmente degenerado;
Contenção;
Cateter inserido na sonda e preenchido com ar (selamento de os interno);
Lavagem (1 a 2 L por égua);
Fluido passado por filtro de 75μm;
Repetir 2 a 3 vezes.
Volume de efluente: >90% recuperação Ocitocina Massagem transretal
Qualidade do efluente Turvo: endometrite Hemorrágico: massagem muito vigorosa e
manipulação de cateter
Égua: Idade > 14 anos: redução RE Patologia de oviduto, útero Morte embrionária precoce
Número de ovulações ovulações múltiplas
Histórico reprodutivo Aborto, Morte embrionária precoce, subfertilidade
Manejo
Exercício: reduzida taxa de recuperação embrionária
Dia da tentativa de recuperação ▪ embrião entra no útero D 5.5-6 ▪ As taxas de recuperação D6 menor ▪ Falha de entrar no útero
Lavagem: Passagem por 3 gotas de
solução de manutenção
Avaliação: Tamanho Qualidade Estágio de desenvolvimento
(mórula, blastocisto inicial, blastocisto expandido)
Maior índice de recuperados( grau 1 e 2)
grau categoria aparência caracteristicas
1 excelente esférico embrião ideal, célulasuniformes, cor e
textura uniforme
2 bom Imperfeiçõespequenas
Poucos blastômerosextrusados, forma
irregular, separação de trofoblasto
3 razoável Problemas visíveis Blastômerosextrusados, células
degeneradas, blastocele degenerada
4 ruim Problemas severos, irregular
Blastocele colapsada, muitos balstômerosextrusados, célulasdegeneradas, com
massa celular
Cirúrgica: Linha ventral; Laparotomia de flanco;
Não cirúrgica: Transcervical Espéculo Pipeta de inseminação Bainha e inovulador
Injeção intra-uterina guiadapor ultra-som
Historicamente, técnicacirúrgica resultava em maioresíndices 70-75% (Squires et al.) >90% (Wilsher et al.)
Recentemente, semelhantes ou melhores resultados com técnica nao-cirúrgica 81% (Losinno et al.) 85% (Wilsher et al.)
Embrião Idade das doadoras Qualidade Maturidade
Receptoras Tônus do utero e cervix antes da transferência Idade da receptora
Manejo técnicas de transferência sincronização
Vantagens: Sem necessidade de manejo de receptoras Transporte a longas distâncias criopreservação de embriões
Meios Ham’s F-10 Vitrocell Botuembryo
Dispositivo de refrigeração passiva para armazenar embriões em 5° C por até 24 horas;
Taxas de prenhez similares a embriões 'frescos’;
Não houve diferenças significativas em viabilidade entre embriões D7 e D8
Maiores embriões D7 mais resistentes do que o menores embriões D7
Porque? Preservar material genético Importação/exportação Receptoras não disponíveis Armazenamento até a doadora
provar seu valor em competicões
Como? técnicas convencionais de
congelamento índices de gestação: 50-60% embriões < 250 μm
vitrificação criopreservação
Altas conc de crioprotetores Baixa conc de crioprotetores
< 15 min para terminar 1.5 horas para completar
Sem material especial Material especial
Descongelamento: transferência direta Descongelamento: diluição antes de transferência
< 300 μm < 250 - 300 μm
índices de gestação: 60% índices de gestação: 50 - 60%
Razões para o fracasso da superovulação: Anatomia do ovário Insensibilidade do receptor de FSH
equino Indisponibilidade de produtos
confiáves que induzam múltipla ovulações;
Benefícios: Aumentar a eficiência TRA Aumento a progênie Avanço da primeira ovulação
eCG, GnRH, pFSH, Hormônio de crescimento Não eficiente
Imunização contra inibina Efeitos colaterais
EPE (extrato de pituitaria equina) índices de ovulação (2-4 ovulações por ciclo) recuperação embrionária: 2 (50%)
eFSH semelhante a EPE
ReFSH
eFSH (BID) quando o maior folículo for 20-23 mm
PGF2α segundo dia Parar quando folículo atingir 33-35 mm Aguardar 24-36 hrs hCG Inseminação
Indicações:
Fêmeas acometidas por afecções ovarianas, uterinas e cervicais;
Éguas que não apresentam bons resultados na Monta Natural (MN), Inseminação Artificial (IA) e/ou Transferência de Embriões (TE), sem causa definida ; ou
Animais com anormalidades adquiridas durante a vida reprodutiva: oclusões de oviduto, Infecções uterinas e lacerações cervicais
Coleta de ovócito: Éguas eutanaziadas Aspiração transvaginal
• Aspiração e lavagem dos folículos via transvaginal, guiada por ultrassonografia (TVA)
• Punções pelo flanco
• Laparotomia com exposição dos ovários e aspiração dos folículos
Ovocito maduro em estágio de Metafase-II
Unidade de reprodução assistida Hospital Quiron de Barcelona
Revista Brasileira de Ginecologia e ObstetríciaOn-line version ISSN 1806-9339Rev. Bras. Ginecol. Obstet. vol.30 no.7 Rio de Janeiro July 2008
GIFT clássica caracteriza-se pela deposição de ovócitos maduros e espermatozóidescapacitados diretamente no oviduto
Índices de coleta: 70-80% (24 h após hCG ouGnRH)
Transferência imediata
MIV por 12 h a 16 h
Transferência cirúrgica de ovócito de doadora ao oviduto de receptoras Receptoras inseminadas normalmente Sptz colocado no oviduto no mesmo
momento do ovócito
índices de gestação: 32-40% (éguasvelhas)
índices de gestação: 20-92% (éguasjovens)
A qualidade e o tipo de conservação do sêmen interferem nos resultados,
Pouco sucesso
2 embriões produzidos de FIV (ambos os casos os ovócitos foram coletados de folículos pré-ovulatórios conseqüentemente maturados in vivo)
Maiores obstáculos: a capacitação in vitro e pouco conhecimento sobre sistema de maturação e cultivo embrionário in vitro
Tx prenhez de 60% (Choi et al., 2002)
Ovócitos são obtidos, maturados, desnudos e em seguida aqueles com o primeiro corpúsculo polar aparente são utilizados
Amostra de sêmen fresco ou descongelado é lavada e colocada em meio com polivinilpirrolidona.
A cauda do espermatozóide é seccionada e a cabeça injetada dentro do oócito, sendo este ativado ou não quimicamente e cultivado in vitro ou transferido para o oviduto de uma receptora (Squires et al., 1996)
Precisa capacitação espermática
Qualidade do sêmen é insuficiente
Garanhões subférteis
Requer um oócito maduro
Cultivo in vitro de embriões (para o estágio de blastocisto)
No Brasil, a empresa In Vitro Clonagem, por meio da Dra. Perla Fleury, noticiou o primeiro nascimento de um equino (fêmea) por esta técnica no ano de 2012. Os ovócitos foram obtidos do ovário de uma égua quarto de milha, após sua morte
Porque? Um sexo mais desejado Expansão genética mais rápida Superovulação ICSI
Como? índices de separação 40% (20%
de em X e 20% emY) Sucesso:80-90%
O primeiro potro produzido a partir de sêmen sexado originou-se da inseminação cirúrgica diretamente no oviduto de 150.000 espermatozoides (LINDSEY et al., 2001).
Inicialmente, foram encontradas grandes dificuldades no desenvolvimento da técnica de transferência nuclear tanto na taxa de fusão entre oócitos e células dos doadores, quanto na taxa de clivagem, que eram menores que 15% (Hinrichs, 2006)
0.7% a 2.7% de embriões reconstruídos resultam em nascimento
A partir de 2006 houve o nascimento de vários potros clonados.
A empresa líder mundial na produção de clones equinos é a ViaGen, com sede no estado do Texas, e com um laboratório em Alberta, no Canadá.
No Brasil, os primeiros clones equinos nasceram em 2012, e são da raça Mangalarga. Foram desenvolvidos pela empresa In Vitro Clonagem Animal, de Mogi Mirim, SP. Um dos clones é do lendário reprodutor Turbante JO, que renasce aos 43 anos.
Banco de células
Os potros nascidos não apresentaram os problemas relatados nas demais espécies domésticas
O potro clonado não seráa cópia idêntica do cavalooriginal
Vários fatores causamdiferentes fenótipos e comportamentos
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