DPNI sur Plateforme Ion Torrent - eACLF• Recrutement partagé de cas de T21 et d’euploïdies...

DPNI sur Plateforme Ion TorrentN. Chatron Laboratoire de Cytogénétique Constitutionnelle Hospices Civils de Lyon

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2

2

Principe technologique

1. Préparation de la banque • Ligation (barcoding) + end repair

!!!!!

!• 10 cycles PCR + purification de PCR Etape semi-automatisée à Lyon, automatisable à plus grande

échelle.

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Amorces « universelles »

Barcode

Séquence d’intérêt

4

Principe technologique

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Principe technologique3. Enrichissement

2. Amplification clonale !!

3. !!!!

4. Chargement de la puce

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Principe technologique3. Enrichissement

2. Amplification clonale !!

3. !!!!

4. Chargement de la puce

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Principe technologique3. Enrichissement

Etapes 2, 3 et 4 automatisées sur IonChef (2 puces)

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Principe technologique5. Séquençage : technologie semi-conducteur

!!!!!!!

!L’incorporation d’un dNTP entraîne la libération d’un

proton. Le signal à interpréter est une différence de potentiel

électrique. Capacité de la puce Proton P1 ≈ 80M de reads Echantillons multiplexés par 5 pour le moment (WG : 0,6 -

0,8x)

6

6

Etape Temps total (h) Hands-on (h)

Extraction ADN 2 1

Préparation library 4,5 2,5

Quantification Bionalyzer 1 0,5

Ion Chef 12 0,5

Proton 7 2

TOTAL 26,5 6,5

7

Temps technique : pour 2 puces

Etape Temps total (h) Hands-on (h)

Extraction ADN 2 1

Préparation library 4,5 2,5

Quantification Bionalyzer 1 0,5

Ion Chef 12 0,5

Proton 7 2

TOTAL 26,5 6,5

7

Temps technique : pour 2 puces

Avantages : + Coût + Disponibilité + Rapidité de séquençage + Flexibilité + Débit modéré avec la P1 + Reads longs

Inconvénients : + Coût + Débit modéré avec la P1 + Erreurs de séquençage

Workflow : TaT = 3j• Prélèvements sur tube STRECK • Préparation plasma • Extraction d’1mL d’ADN plasmatique

Qiagen circulating DNA • Vérification de la présence d’ADN par dosage Qubit

ADN = 1ng/µL • Préparation de banques barcodées (ADN déjà fragmentés) :

Library Builder + 10 cycles PCR + purif manuelle !• Quantification + normalisation Bioanalyzer !• Ion Chef • Proton : objectif 10M de reads par patiente !• Analyse bioinformatique 8

Bat

ch d

e 10

éch

anti

llons

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Principe technologique

9

Principe technologique

Analyse bioinformatique

Analyse bioinformatique• Différents algorithmes publiés, initialement développés pour

des données Illumina • TorrentSuite : BAM « filter duplicates » • Tests en cours de Wisecondor (WIthin-SamplE COpy Number

aberration DetectOR)

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- Fragmentation du génome en bin - Nécessite un set de référence pour établir une

liste de bin « jumeaux » (avec correction GC) !

- Echantillon à tester - Z-score par bin - Z-score de stouffer - Réponse binaire sur aneuploidies

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Etat des lieux : littérature

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Oct 2014

Puce PGM 318 ; N=13

Janv. 2013

Etat des lieux : littérature

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Oct 2014

Puce PGM 318 ; N=13

Janv. 2013

Etat des lieux : littérature

• Puce Proton P1

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Oct 2014

Puce PGM 318 ; N=13

Janv. 2013

Etat des lieux : littérature

• Puce Proton P1• N = 155• 10 échantillons par puce

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Oct 2014

Puce PGM 318 ; N=13

Janv. 2013

Juillet 2014• Earlier this month, the China Food and Drug

Administration said it approved two next-generation sequencing-based diagnostic products developed by BGI : BGISEQ-100 and BGISEQ-1000. !

• The BGISEQ-100 system is based on Ion Torrent semiconductor sequencing. Although the instrument is similar to and uses the same chemistry as the Proton, it is manufactured by BGI, not Thermo Fisher, according to a Thermo Fisher spokesperson.

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Collaboration nationale : Consortium H+• Recrutement partagé de cas de T21 et

d’euploïdies pour atteindre une puissance statistique suffisante, prélèvements réalisés en parallèle d’un test invasif

!• Objectif : ▫ 500 patientes testées dont 50 T21 ▫ Uniformisation de l’ensemble du protocole ▫ Transfert diagnostique ▫ Valorisation scientifique !

!• Bilan janvier 2015 : ▫ 240 échantillons testés ▫ Se = Sp = 1 14

Collaboration nationale : Consortium H+• Recrutement partagé de cas de T21 et

d’euploïdies pour atteindre une puissance statistique suffisante, prélèvements réalisés en parallèle d’un test invasif

!• Objectif : ▫ 500 patientes testées dont 50 T21 ▫ Uniformisation de l’ensemble du protocole ▫ Transfert diagnostique ▫ Valorisation scientifique !

!• Bilan janvier 2015 : ▫ 240 échantillons testés ▫ Se = Sp = 1 14

Merci de votre attention