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V o l . 5 3 , N o . 4P P L I E D AND ENVIRONMENTAL M I C R O B I O L O G Y , A p r . 1 9 8 7 , p . 8 7 2 - 8 7 80 0 9 9 - 2 2 4 0 / 8 7 / 0 4 0 8 7 2 - 0 7 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 1 9 8 7 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

A n t i g e n i c C h a r a c t e r i z a t i o n o f P e n i c i l l i u m c a m e m b e r t i a n d R e l a t e dCommon C h e e s e C o n t a m i n a n t sL U C I A N O P O L ON E L L I, l * GIULIA MORACE,' R O B E R T A R O S A , 1 M ASS I M O CASTAGNOLA 2 A N D

JENS C . F R I S V A D 3I s t i t u t o d i M i c r o b i o l o g i a l a n d I s t i t u t o d i C h i m i c a , 2 F a c o l t a d i M e d i c i n a e C h i r u r g i a " A . G e m e l l i , " U n i v e r s i t a C a t t o l i c ad e l S a c r o C u o r e , 0 0 1 6 8 Rome, I t a l y , a n d D e p a r t m e n t o f B i o t e c h n o l o g y , Food T e c h n o l o g y , T h e T e c h n i c a l U n i v e r s i t y o fD e n m a r k , D K - 2 8 0 0 L y n g b y , D e n m a r k 3R e c e i v e d 4 A u g u s t 1 9 8 6 / A c c e p t e d 2 3 December 1 9 8 6

T w e n t y - f o u r i s o l a t e s o f P e n i c i l l i u m ( i n c l u d i n g a g r e e n - s p o r e d m u t a n t f r o m a F r e n c h B r i e c h e e s e , P e n i c i l l i u mc a m e m b e r t i ) w i t h a p r o p o s e d r e l a t i o n s h i p t o t h e w h i t e c h e es e m o l d P . c a m e m b e r t i were i n v e s t i g a t e d b yi m m u n o l o g i c a l p r o c e d u r e s . T h e s e p e n i c i l l i a , w h i c h ar e r e p r e s e n t a t i v e o f s p e c i e s t h a t h a v e c a u s e d c o n s i d e r a b l et a x o n o m i c c o n f u s i o n , h a d common m i c r o m o r p h o l o g y ( t e r v e r t i c i l l a t e p e n i c i l l i w i t h r o u g h a n d s m o o t h s t i p e s a n ds m o o t h e l l i p s o i d a l t o s u b g l o b o s e [ ( 3 t o 5 ) x 2 1 / 2 t o 4 1 / 2 , u m ] c o n i d i a ) ; g r o w t h r a t e s ; g o o d g r o w t h on c r e a t i n esucrose agar, c h e e s e , a n d o t h e r p r o d u c t s w i t h a h i g h amount o f p r o t e i n a n d l i p i d as a p r i m a r y h a b i t a t ;p r o d u c t i o n ( w i th t h e e x ce p t i o n o f P e n i c i l i u m s o l i t u m ) o f c y c l o p i a z o n i c a c i d ; a n d t h e a b i l i t y t o g r o w a t l o wt e m p e r a t u r e s a n d w a t e r a c t i v i t i e s . T h e i s o l a t e s t h a t w e r e i n v e s t i g a t e d p r o v e d t o b e s t r i c t l y a n t i g e n i c a l l y r e l a t e d .A b s o r b e d a n t i s e r u m o f t h e g r e en - s p o r e d m u t a n t o f P . c a m e m b e r t i s h o w e d a s p e c i f i c p r e c i p i t i n b a n d when t e s t e db y i m m u n o d i f f u s i o n e i t h e r w i t h i t s h o m o l o g o u s r e f e r e n c e a n t i g e n or w i t h t h e e x o a n t i g e n s o b t a i n e d f r o md i f f e r e n t i s o l a t e s . T h e p r e c i p i t i n b a n d was n o t p r e s e n t i n an y P . c a m e m b e r t i s t a r t e r c u l t u r e b u t i n manyu n w a n t e d c h e es e c o n t a m i n an t s . T h e p r e c i p i t i n b a n d c an b e u s e d i n t h e p u r i t y c o n t r o l o f P . c a m e m b e r t i s t a r t e rc u l t u r e spore p r e p a r a t i o n s . A n a l y s i s o f t h e e x o a n t i g e n s o f a l l t h e c u l t u r e s b y r e v e r s e d p h a s e h i g h - p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y a l l o w e d u s t o s u b d i v i d e t h e s e p e n i c i l l i a i n t o n i n e groups b e l o w t h e s p e c i e s l e v e l . T h er e s u l t s i n d i c a t e t h a t P . commune Thom i s t h e w i l d - t y p e a n c e s t o r o f P . c a m e m b e r t i .

I n 1 9 1 0 C . Thom ( 2 1 ) i n t r o d u c e d t h e t a x o n P e n i c i l l i u mcommune f o r t h e m o s t common c h e e s e c o n t a m i n a n t i n t h eU n i t e d S t a t e s . T h i s t a x o n w a s a c c e p t e d b y S a m s o n e t a l . ( 1 9 )a n d c i t e d a s a n uncommon m o l d , b u t i t w a s r e d u c e d t o t h es y n o n y m o f P . p u b e r u l u m B a i n i e r b y P i t t ( 1 4 ) . T h e s e t w og r o u p s o f t a x o n o m i s t s a g r e e d o n t h e s y n o n y m y o f t h ei m p o r t a n t w h i t e c h e e se s t a r t e r c u l t u r e s P . c a s e i c o l u mB a i n i e r a n d P . c a m e m b e r t i ( 1 4 , 1 8 ) , b u t t h e y d i s a g r e e d o nt h e p l a c e m e n t o f P . b i f o r m e T h o m . T h e l a t t e r w a s p l a c e d i nP . v e r r u c o s u m D i e r c k x v a r . c y c l o p i u m ( W e s t l i n g ) S a m s o n ,S t o l k e t H a d l o k b y S a m s o n e t a l . ( 1 9 ) , a n d S a m s o n ( 1 7 )p r o p o s e d t h a t P . v e r r u c o s u m v a r . c y c l o p i u m m i g h t b e t h ea n c e s t o r o f P . c a m e m b e r t i . P i t t ( 1 4 ) d i d n o t i n d i c a t e a na n c e s t o r f o r P . c a m e m b e r t i , b u t c i t e d a s t r a i n f r o m s p o i l e dc h e d d a r c h e e s e (FRR 2 1 6 0 ) a s a w i l d - t y p e s t r a i n o f t h i ss p e c i e s . P . v e r r u c o s u m v a r . c y c l o p i u m e m b r a c e s t h r e e d i s -t i n c t g r o u p s o f f u n g i , h o w e v e r : ( i ) P . c r u s t o s u m , a f r u i t -r o t t i n g f u n g u s t h a t p r o d u c e s p e n i t r e m s , r o q u e f o r t i n e s ,i s o f u m i g a c l a v i n e s , t e r r e s t r i c a c i d , a n d v i r i d i c a t i n ; ( i i ) P .a u r a n t i o g r i s e u m , P . c y c l o p i u m , a n d P . v i r i d i c a t u m , w h i c ha r e c l o s e l y r e l a t e d c e r e a l s t r a i n s t h a t p r o d u c e p e n i c i l l i c a c i d ,p u b e r u l i c a c i d , v i r i d i c a t i n , x a n t h o m e g n i n s , S - t o x i n , b r e v i a n -a m i d e s , p e n i t r e m s , a n d t e r r e s t r i c a c i d ; a n d ( i i i ) t h e g r o u p o fi n t e r e s t h e r e , P . c o m m u n e , P . p a l i t a n s , P . s o l i t u m , a n d P .c am em b e r t i , w h i c h a r e c l o s e l y r e l a t e d t a x a f r o m c h e e s e ,m e a t , a n d n u t s p r o d u c i n g t h e a m i n o a c i d - r e l a t e d s e c o n d a r ym e t a b o l i t e s c y c l o p i a z o n i c a c i d , r u g u l o v a s i n e s , v i r i d i c a t i n ,a n d t h e p o l y k e t i d e s c y c l o p a l d i c a c i d a n d p a l i t a n t i n ( 7 ) .B e c a u s e t h e s e t a x a a p p e a r n e a r l y a l i k e u n d e r a l i g h t m i c r o -s c o p e , o t h e r c l a s s i c a l t a x o n o m i c a l c r i t e r i a , i n c l u d i n g c o l o n y

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .

t e x t u r e a n d c o n i d i a l c o l o r e n m a s s e , h a v e b e e n o v e r e m p h a -s i z e d , l e a d i n g t o u n d e r s t a n d a b l e t a x o n o m i c c o n f u s i o n a n dmany m i s i d e n t i f i c a t i o n s ( s e e T a b l e 1 ) . T h e c e r e a l s t r a i n s a r ee a s i l y r e c o g n i z e d b y t h e i r p o o r g r o w t h o n c r e a t i n e - s u c r o s ea g a r ( 5 ) a n d t h e i r y e l l o w o b v e r s e a n d r e v e r s e o n YE S a g a r( 4 ) . P . c r u s t o s u m i s r e c o g n i z a b l e b y i t s a b i l i t y t o r o t p o m a -c e o u s f r u i t s , i t s h i g h g r o w t h r a t e s o n s o l i d m e d i a , a n d t h ep r o d u c t i o n o f e n o r m o u s a m o u n t s o f c o n i d i a o n m o s t s u b -s t r a t e s ( 6 ) . We w a n t e d t o e v a l u a t e w h e t h e r i m m u n o l o g i c a lp r o c e d u r e s m i g h t g i v e a n i n s i g h t i n t o t h e i n t r i c a t e t a x o n o m -i c a l p r o b l e m s i n t h e v e r y i m p o r t a n t g r o u p s o f t h e s e p e n i c i l l i a( 1 5 ) . Two o t h er i m p o r t an t c h e e s e t a x a , P . r o q u e f o r t i Thoma n d P . v e r r u c o s u m D i e r c k x , w e r e n o t t a k e n i n t o c o n s i d e r -a t i o n b e c a u s e t h e y a r e q u i t e u n r e l a t e d t o t h e f u n g i m e n t i o n e da b o v e a nd a r e q u i t e d i s t i n c t i v e .M A T E R I A LS AND M E T H ODS

C u l t u r e s . T h e f u n g a l s t r a i n s u s e d i n t h i s s t u d y a r e l i s t e d i nT a b l e 1 . T h e y r e p r e s e n t e d P . c a m e m b e r t i ( f o r s y n o n y m s ,s e e r e f e r e n c e s 1 4 a n d 1 8 ) ; P . commune [ = P . l a n o s o v i r i d eThom = P . o c h r a c e u m B a i n i e r v a r . m a c r o s p o r u m Thom =P . f u s c o g l a u c u m B i o u r g e = P . a u s t r a l i c u m S o p p e x v a nBeyma = P . c y c l o p i u m v a r . a l b u m G . S m i t h = P . v e r -r u c o s u m v a r . a l b u m ( G . S m i t h ) S a m s o n , S t o l k , e t H a d l o k =P . a l b u m ( G . S m i t h ) S t o l k e t S a m s o n ] ; P . p a l i t a ns W e s t l i n g( = P . m a j u s c u l u m W e s t l i n g , P . f l a v o g l a u c u m B i o u r g e = P .p s i t t a c i u m Thom = P . r o q u e f o r t i v a r . p u n c t a t u m A b e ) ; a n dP . s o l i t u m W e s t l i n g [ = P . c a s e i v a r . c o m p a c t u m Abe = P .m a l i N o v o b r a n o v a = P . m a l i G o r l e n k o e t N o v o b r a n o v a =P . v e r r u c o s u m v a r . m e l a n o c h l o r u m S a m s o n , S t o l k , e tH a d l o k = P . m e l a n o c h l o r u m ( S a m s o n , S t o l k , e t H a d l o k )F r i s v a d ] . T h e s t r a i n X X 1 0 2 , w h i c h i s a l s o known a s s t r a i n s

8 7 2

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A N T I GE N IC CHARACTERIZATION O F P . CAMEMBERTI 8 7 3T ABLE 1 . P e n i c i l l i u m i s o l a t e s i n v e s t i g a t e d a n d t h e i r s o u r c e s a n d m y co t o x i n p r o d u c t i o n

S p e c i e s F o r m e r name S t r a i n a S o u r c e b M y c o t o x i n ( s ) p r o d u c e dP . c a m e m b e r t i P . c a m e m b e r t i I M I 2 8 5 5 0 6 C B r i e , DK C y c l o p i a z o n i c a c i d

P . c a m e m b e r t i PD B r i e , F C y c l o p i a z o n i c a c i dP . c a m e m b e r t i BB B r i e , DK C y c l o p i a z o n i c a c i dP . c a m e m b e r t i DK C a m e m b e r t , DK C y c l o p i a z o n i c a c i dP . c a m e m b e r t i G r i n A l p e C o n t a m i n a t e d c r e a m C y c l o p i a z o n i c a c i dc h e e s e , DK

P . commune P . c a m e m b e r t i I I XX102 ( I M I 2 9 3 1 7 8 ) C B r i e , F C y c l o p i a z o n i c a c i d , r u g u l o v a s i n e A ,c y c l o p a l d i c a c i dP . b i f o r m e N R R L 6 4 9 7 C a n n e d p e a r , US C y c l o p i a z o n i c a c i d , r u g u l o v a s i n e A ,c y c l o p a l d i c a c i dP . c a m e m b e r t i F R R 2 1 4 0 C h e d d a r c h e e s e , N Z C y c l o p i a z o n i c a c i d , r u g u l o v a s i n e A ,c y c l o p a l d i c a c i dP . v i r i d i c a t u m Q u i n t . 1 3 9 7 A c o r n , E C y c l o p i a z o n i c a c i d , r u g u l o v a s i n e A ,c y c l o p a l d i c a c i dP . c a m e m b e r t i I I MRA 5 5 E a r l y g a r d e n t u r n i p s , C y c l o p i a z o n i c a c i d , r u g u l o v a s i n e A ,DK c y c l o p a l d i c a c i dP . c a m e m b e r t i I I X 0 0 6 C h e e s e , DK C y c l o p i a z o n i c a c i d , r u g u l o v a s i n e A ,c y c l o p a l d i c a c i dP . c a m e m b e r t i I I I M I 2 8 5 5 0 7 C L i q u o r i c e r o o t , T C y c l o p i a z o n i c a c i d , r u g u l o v a s i n e A ,c y c l o p a l d i c a c i d

P . p a l i t a n s P . p a l i t a n s N R R L 2 0 3 3 ? , N C y c l o p i a z o n i c a c i d , p a l i t a n t i n ,f r e q u e n t i nP . c a m e m b e r t i I I I I M I 2 9 3 2 1 0 C h e e s e , DK C y c l o p i a z o n i c a c i d , p a l i t a n t i nP . c a m e m b e r t i I I I A M A S 4 H o u s e a i r , DK C y c l o p i a z o n i c a c i d , p a l i t a n t i nP . p a l i t a n s MAYO 1 2 G r a v y , DK V i r i d i c a t i n , p a l i t a n t i nP . s o l i t u m P . m a l i CBS 5 0 0 . 7 3 A p p l e , R V i r i d i c a t i n ( w e a k )P . p a l i t a n s N R R L 9 1 4 P e a r , US V i r i d i c a t i nP . m e l a n o c h l o r u m JOSC 2 S o i l , S V i r i d i c a t i nP . m e l a n o c h l o r u m FTLS 1 9 3 A p p l e , DK V i r i d i c a t i nP . m e l a n o c h l o r u m A E b l e LME1 A p p l e , DK V i r i d i c a t i nP . m e l a n o c h l o r u m G 1 , 2 (FRR 3 1 2 1 ) B a k e r y e a s t , DK V i r i d i c a t i nP . m e l a n o c h l o r u m OF13 P a p e r , DK V i r i d i c a t i nP . m e l a n o c h l o r u m BE 9 , 1 S a l a m i , DK V i r i d i c a t i n

a A b b r e v i a t i o n s : I M I , C o m m o n w e a l t h M y c o l o g i c a l I n s t i t u t e , K e w , G r e a t B r i t a i n ; F R R , C o m m o n w e a l t h S c i e n t i f i c a n d I n d u s t r i a l R e s e a r c h O r g a n i s a t i o n ,D i v i s i o n o f F o o d R e s e a r c h , S y d n e y , A u s t r a l i a ; N R R L , N o r t h e r n R e g i o n a l R e s e a r c h L a b o r a t o r y , P e o r i a , I l l . ; C B S , C e n t r a a l b u r e a u voor S c h i m m e l c u l t u r e s ,B a a r n , T h e N e t h e r l a n d s ; Q u i n t . , J . A . Q u i n t a n i l l a , C o m p a n i a s d e A g r i c o l a s , V a l l a d o l i d , S p a i n ; a l l o t h e r s t r a i n s a r e f r o m t h e D e p a r t m e n t o f B i o t e c h n o l o g y ,T e c h n i c a l U n i v e r s i t y o f D e n m a r k , L y n g b y , D e n m a r k .b A b b r e v i a t i o n s : DK, D e n m a r k ; F , F r a n c e ; N Z , N ew Z e a l a n d ; N , N o r w a y ; S , S w e d e n ; E , S p a i n ; R , R u s s i a ; T , T h a i l a n d ; U S , U n i t e d S t a t e s .R e f e r e n c e s t r a i n .

I M I 2 9 6 9 3 8 a n d F R R 3 1 1 2 , was o b t a i n e d f r o m a c u l t u r e o f P .c a m e m b e r t i i s o l a t e d f r o m a F r e n c h b r i e c h e e s e . T h i s s e c t o ri n t h e w h i t e P . c a m e m b e r t i c u l t u r e ( I M I 2 9 3 1 7 8 , w h i c h i s t h esame as A T C C 5 8 6 0 9 ) was o n l y r e c o g n i z a b l e b y i t s greenc o n i d i a . T h e c u l t u r e i s l i s t e d as P . commune b e c a u s e o f i t sg o o d c o n i d i u m p r o d u c t i o n a n d t h e f u l l p r o f i l e o f s e c o n d a r ym e t a b o l i t e s ( c y c l o p i a z o n i c a c i d , c y c l o p a l d i c a c i d ,r u g u l o s a v i n e A ) known f r o m t h e w i l d - t y p e s p e c i e s .M y c o t o x i n p r o d u c t i o n . A l l s t r a i n s were examined f o r p r o -d u c t i o n o f c y c l o p i a z o n i c a c i d , v i r i d i c a t i n , c y c l o p e n i n , andc y c l o p a l d i c a c i d on CYA a g a r , YES a g a r , or b o t h b y t h em e t h o d s d e s c r i b e d b y F r i s v a d a n d F i l t e n b o r g ( 8 ) .T a x o n o m y . The i s o l a t e s were c h a r a c t e r i z e d b y t h e m e t h -o d s d e s c r i b e d b y F r i s v a d ( 5 , 6 ) i n t o P . camemberti ( P .c a m e m b e r t i c h e m o t y p e I ) , P . commune ( P . camembertic h e m o t y p e I I ) , P . p a l i t a n s ( P . camemberti c h e m o t y p e I I I ) ,a n d P . s o l i t u m ( P . m a l i ) b a s e d on d i f f e r e n c e s i n c o n i d i a t i o na n d c o l o r onYE S a g a r , c o n i d i u m c o l o r , c o n i d i u m h y d r o p h o -b i c i t y ( P . s o l i t u m h a s h y d r o p h i l i c c o n i d i a ) , and p r o d u c t i o n o fp r o f i l e s o f s e c o n d a r y m e t a b o l i t e s .C o n t r o l a n t i g e n . The p r o c e d u r e used f o r p r o d u c i n g t h er e f e r e n c e a n t i g e n s was t h a t recommended b y t h e C e n t e r s f o rD i s e a s e C o n t r o l , A t l a n t a , G a . , f o r p r o d u c i n g a n t i g e n s f o r

d i a g n o s i n g a s p e r g i l l o s i s b y a m i c r o d i f f u s i o n t e s t ( 1 3 ) . B r n e f l y ,t h e c o n t r o l a n t i g e n s we r e o b t a i n e d f r o m a c e t o n e - t r e a t e dS a b o u r a u d d e x t r o s e b r o t h c u l t u r e s o f P . c a m e m b e r t i I M I2 8 5 5 0 6 , P . commune ( t h e P . c a m e m b e r t i g r e e n - s p o r e d mu-t a n t ) I M I 2 9 6 9 3 8 ( X X 1 0 2 ) , a n d P . commune I M I 2 8 5 5 0 7 . F o re v a l u a t i n g o p t i m u m a c t i v i t y , t h e s o l u b i l i z e d a n t i g e n wasa d j u s t e d b y c o n c e n t r a t i o n or d i l u t i o n w i t h s t e r i l e d i s t i l l e dw a t e r t o c o n t a i n 1 , 5 0 0 or 4 , 0 0 0 , u g o f c a r b o h y d r a t e s p e r m lb e f o r e t e s t i n g .C o n t r o l a n t i s e r a . T h e p r o d u c t i o n o f r e f e r e n c e a n t i s e r a wasc a r r i e d o u t b y i m m u n i z i n g a l b i n o r a b b i t s . T h e a n i m a l s w e r ei n j e c t e d s u b c u t a n e o u s l y w i t h t h e r e f e r e n c e a n t i g e n s ( 4 , 0 0 0, u g / m l ) i n F r e u n d a d j u v a n t on t h e f i r s t 3 d a y s a n d i n t r a v e -n o u s l y a t 1 a n d 2 w e e k s a f t e r t h e f i r s t i n o c u l a t i o n . T h er a b b i t s we r e b l e d f r o m t h e h e a r t 7 d a y s a f t e r t h e l a s ti n t r a v e n o u s i n j e c t i o n .E x o a n t i g e n p r o d u c t i o n . C e l l - f r e e a n t i g e n s ( e x o a n t i g e n s ) o ft h e 2 4 P e n i c i l l i u m i s o l a t e s were p r o d u c e d b y t h e t e c h n i q u ed e s c r i b e d b y K a u f m a n a n d S t a n d a r d ( 1 0 ) f o r t h e s e r o l o g i c a li d e n t i f i c a t i o n o f C o c c i d i o i d e s i m m i t i s a n d H i s t o p l a s m ac a p s u l a t u m c u l t u r e s . B r i e f l y , c u l t u r e s s h o w i n g l u x u r i a n tg r o w t h on S a b o u r a u d d e x t r o s e a g a r ( 1 0 d a y s ) were c o v e r e dw i t h 8 m l o f an a q u e o u s s o l u t i o n o f M e r t h i o l a t e ( t h i m e r o s a l ;

V O L . 5 3 , 1 9 8 7

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3/7

8 7 4 P O L O N E L L I E T A L .1 : 5 , 0 0 0 ) a n d k e p t f o r 2 4 h a t 2 5 C . A f t e r t h i s p e r i o d , 5 m l o ft h e e x t r a c t was c o n c e n t r at e d 5 0 t i m e s b y l y o p h i l i z a t i o n .S e r o l o g i c a l t e s t s . A n agar g e l d o u b l e d i f f u s i o n ( I D ) t e s t wasu s e d f o r s e r o l o g i c a l t e s t s . The medium a n d t h e m e t h o d o l o g yu s e d were t h o s e r e c o m m e n d e d b y t h e C e n t e r s f o r D i s e a s eC o n t r o l f o r t h e s e r o l o g i c a l d i a g n o s i s o f h i s t o p l a s m o s i s b yi m m u n o d i f f u s i o n ( 1 3 ) . T h e e x o a n t i g e n ( 1 , 5 0 0 , u g / m l ) wast e s t e d b y u s i n g t h e r e f e r e n c e a n t i g e n a n d a n t i s e r u m asc o n t r o l s .C o m p a r i s o n o f t h e a n t i g e n i c p a t t e r n o f e a c h i s o l a t e wasc a r r i e d o u t b y u s i n g a c r o s s e d i m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s t e c h -n i q u e w i t h i n t e r m e d i a t e g e l ( C I E I G ) ( 1 ) . B r i e f l y , e a c h r e f e r -en c e a n t i g e n ( 1 , 5 0 0 , u g / m l ) was f i r s t s u b j e c t e d t o an e l e c t r i cf i e l d i n an agarose g e l . A f t e r t h e d i f f e r e n t a n t i g e n i c d e t e r m i -n a n t s m i g r a t e d , t h e g e l was r e m o v e d a n d a p p l i e d t o t h eb o t t o m o f a n o t h er s l i d e , on w h i c h a m i d d l e a n d a t o p g e lwere p r e s e n t . I n t h e m i d d l e l a y e r , N a C l or h e t e r o l o g o u sserum d i f f u s e d , w h i l e t h e h o m o l o g o u s s e r u m d i f f u s e d i n t h et o p l a y e r . When an o r t h o g o n a l e l e c t r i c f i e l d was a p p l i e d , t h esystem w i t h N a C l i n t h e m i d d l e l a y e r d e v e l o p e d t h e a n t i -g e n i c p a t t e r n o f t h e a n t i g e n - a n t i s e r u m r e f e r e n c e systemb e i n g i n v e s t i g a t e d . T h e o t h e r s y s t e m , w i t h h e t e r o l o g o u ss e r u m i n t h e m i d d l e g e l , r e v e a l e d t h e common a n t i g e n i cd e t e r m i n a n t s t h a t r e a c t w i t h t h e h e t e r o l o g o u s a n t i s er u m a n dt h e s p e c i f i c d e t e r m i n a n t s t h a t r e a c t w i t h t h e h o m o l o g o u ss e r u m .A b s o r p t i o n o f a n t i s e r a . E a c h r e f e r e n c e a n t i s e r u m s a m p l e( 0 . 5 m l ) was a b s o r b e d b y a d d i n g 0 . 5 m l o f e a c h h e t e r o l o g o u sr e f er e nc e a nt i g en ( 1 , 5 0 0 , u g / m l ) s e p a r a t e l y a n d was a l l o w e dt o s t a nd o v er n i g h t a t 4 C . T h e a n t i g e n - a n t i s e r u m m i x t u r e swere t h e n c e n t r i f u g e d a t 1 2 , 0 6 3 x g f o r 1 0 m i n . T h es u p e r n a t a n t s were d e c a n t e d , a n d t h e i r i n i t i a l v o l u m e s werer e s t o r e d w i t h c o n c e n t r a t o r s ( M i n i c o n M a c r o s o l u t e B 1 5 ;A m i c o n C o r p . , L e x i n g t o n , M a s s . ) . T h e a b s o r p t i o n proce-d u r e was r e p e a t e d , a n d t h e s u p e r n a t a n t s were t e s t e d b yi m m u n o d i f f u s i o n f o r e v i d e n c e o f a b s o r p t i o n .R e v e r s e d p h a s e h i g h - p e r f o r m an c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y .A l l common r e a g e n t s u s e d f o r r e v e r s e d p h a s e h i g h -p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y (RPHPLC) were a n a l y t -i c a l g r a d e . T h e A c e t o n i t r i l was Chroma s o l g r a d e p u r c h a s e df r o m H o e c h s t - R o u s s e l P h a r m a c e u t i c a l s I n c . ( S o m e r v i l l e ,N . J . ) ; t r i f l u o r o a c e t i c a c i d ( T F A ) was o b t a i n e d f r o m S i g m aC h e m i c a l C o . ( S t . L o u i s , M o . ) ; a n d t h e h i g h - p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h i c ( H P L C ) water was d o u b l e d i s t i l l e da n d was f i l t e r e d ( p o r e s i z e , 0 . 4 5 , u m ; G A 6 M e t r i c e l mem-b r a n e f i l t e r ; G e l m n a n S c i e n c e s , I n c . , Ann A r b o r , M i c h . ) p r i o rt o use. A t o t a l o f 5 m l o f e a c h l y o p h i l i z e d e x o a n t i g e n wasd i s s o l v e d i n 0 . 1 0 m l o f t h e s o l v e n t A s o l u t i o n ( s e e b e l o w ) f o rHPLC; 0 . 0 1 0 m l was t h e n u s e d f o r e a c h HP L C a n a l y s i s . TheHPLC c o n d i t i o n s were as f o l l o w s . A n A q u a p o r e RP300

F I G . 1 . I D t e c h n i q u e d e t e r m i n a t i o n o f P . camemberti I MI2 8 5 5 0 6 . W e l l c o n t e n t s : C , r e f e r e n c e a n t i s e r u m ; 1 and 4 , r e f e r e n c ea n t i g e n ; 2 a n d 3 , P . cormmune I M I 2 8 5 5 0 7 r e f e r e n c e a n t i g e n ; 5 a n d6 , P . commune ( P . c a m e m b e r t i m u t a n t ) XX102 r e f e r e n c e a n t i g e n .

F I G . 2 . CIEIG t e c h n i q u e d et e r m i na t i o n o f P . c a m e m b e r t i I M I2 8 5 5 0 6 . G e l c o n t e n t s : A l , A 2 , a n d A 3 , r e f e r e n c e a n t i g e n ; B i , s a l i n e ;B 2 , P . commune I M I 2 8 5 5 0 7 r e f e r e n c e a n t i s e r u m ; B 3 , P . commune( P . c a m e m b e r t i m u t a n t ) XX102 r e f e r e n c e a nt i s e r um ; C l , C 2 , a n dC 3 , r e f e r e n c e a n t i s e r u m .

c o l u m n ( 2 2 0 b y 4 . 1 mm; B r o w n l e e L a b s , S a n t a C l a r a , C a l i f . )a n d a g u a r d c o l u m n ( 3 0 b y 4 . 1 mm) w e r e u s e d f o r HPLC.T h e g r a d i e n t t h a t w a s a p p l i e d w a s 0 % a t 0 t o 1 m i n , wasi n c r e a s e d l i n e a r l y t o 70% a t 1 t o 1 8 m i n , a n d w a s h e l d a t 70%f o r 2 m i n . S o l v e n t A c o ns i st e d o f w a t e r - a c e t o n i t r i l e ( 9 0 : 1 0v o l / v o l ) w i t h 0 . 1 % ( w t / v o l ) TFA, a n d s o l v e n t B c o n s i s t e d o f1 0 0 % a c e t o n i t r i l e - 0 . 1 % TFA. T h e UV d e t e c t o r w a v e l e n g t hw a s 2 2 0 n m , a n d t h e a b s o r b a n c e s c a l e w a s 1 . 2 8 0 a b s o r b a n c eu n i t s , f u l l s c a l e . T h e f l o w r a t e w a s s e t a t 1 . 4 n l l / m i n . At w o - p u m p HPLC a p p a r a t u s ( L C 1 0 ; The P e r k i n - E l m e rC o r p . , N o r w a l k , C o n n . ) e q u i p p e d w i t h a s p e c t r o p h o t o m e t r i cr e c o r d e r ( L C 8 5 U V - V i s ) a n d a n a u t o c o n t r o l ( L C ) c o n n e c t e dt o a t w o - c h a n n e l r e c o r d e r ( L K B I n s t r u m e n t s , I n c . ,R o c k v i l l e , M d . ) was u s e d .

RESULTSP r e c i p i t a t i n g a n t i b o d i e s w e r e o b s e r v e d i n a l l t h e s e r u ms a m p l e s f r o m r a b b i t s t h a t w e r e i m m u n i z e d w i t h t h e r e f e r -e n c e a n t i g e n s . T h e r e f e r e n c e s y s t e m , r e p r e se n t ed b y e a c hTABLE 2 . R e l a t i o n s h i p s o f p r e c i p i t i n b a n d s p r o d u c e d b yP . c a m e m b e r t i a n d P . commune r e f e r e n c e a n t i s e r a a n d r e f e r e n c ea n t i g e n s b y t h e i m m u n o d i f f u s i o n t e c h n i q u e

R e f e r en c e a n ti s e r u m p r e c i p i t i nb a n d s f o r a :R e f e r e n c e a n t i g e n P . c a m e m b e r t i I M I 2 8 5 5 0 6

1 2 3P . c a m e m b e r t i I M I 2 8 5 5 0 6 + + +P . commune I M I 2 8 5 5 0 7 + + +P . commune XX102 + +

P . commune I M I 2 8 5 5 0 71 2 3 4 5

P . commune I M I 2 8 5 5 0 7 + + + + +P . c a m e i n b e r t i I M I 2 8 5 5 0 6 - + + -P . commune XX102 + + + +P . commune XX102

1 2 3 4 5 6P . commune XX102 + + + + + +P . c a m e m b e r t i I M I 2 8 5 5 0 6 - - + + - +P . commune I M I 2 8 5 5 0 7 - + + + +

a S y m bo l s: + , b a n d o f i d e n t i t y ; + , b a n d o f p a r t i a l i d e n t i t y ; - , n o r e a c t i o n .

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .

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4/7

A N T I GE N IC CHARAC TERIZ ATION O F P . C A M E MB E R T I 8 7 5T AB L E 3 . R e l a t i o n s h i p s o f p r e c i p i t i n b a n d s p r o d u c e d b y P .c a me m b e r t i a n d P . commune r e f e r e n c e a n t i s e r a a n d e x o a n t i g e n sb y t h e i m m u n o d i f f u s i o n t e c h n i q u e

R e f e r e nc e a n t i se r u mp r e c i p i t i n b a n d s f o r " :E x o a n t i g e n P . c a m e m b e r t i I M I 2 8 5 5 0 61 2

P . c a m e m b e r t i I M I 2 8 5 5 0 6P . c a m e m b e r t i G r s d n A l p eP . c a m e m b e r t i DKP . c a m e m b e r t i BBP . c a m e m b e r t i PDP . commune F R R 2 1 6 0P . commune N R R L 6 4 9 7P . commune 1 3 9 7P . commune X 0 0 6P . commune MRA 5 4P . p a l i t a n s MAYO 1 2P . p a l i t a n s I M I 2 9 3 2 1 0P . p a l i t a n s N R R L 2 0 3 3P . p a l i t a n s AMAS 4P . s o l i t u m O F 1 3P . s o l i t u m G 1 , 2P . s o l i t u m A E b l e L M E ,P . s o l i t u m CBS 5 0 0 . 7 3P . s o l i t u m N R R L 9 1 4P . s o l i t u m JOSC 2P . s o l i t u m FTLS 1 9 3P . s o l i t u m BE 9 , 1

P . commune I M I 2 8 5 5 0 7P . c a m e m b e r t i G r 0 n A l p eP . c a m e m b e r t i DKP . c a m e m b e r t i BBP . c a m e m b e r t i P DP . commune FR R 2 1 6 0P . commune N R R L 6 4 9 7P . commune 1 3 9 7P . commune X 0 0 6P . commune MRA 5 4P . p a l i t a n s MAYO 1 2P . p a l i t a n s I M I 2 9 3 2 1 0P . p a l i t a n s N R R L 2 0 3 3P . p a l i t a n s AMAS 4P . s o l i t u m O F 1 3P . s o l i t u m G 1 , 2P . s o l i t u m A E b l e L M E ,P . s o l i t u m CBS 5 0 0 . 7 3P . s o l i t u m N R R L 9 1 4P . s o l i t u m JOSC 2P . s o l i t u m FTLS 1 9 3P . s o l i t u m BE 9 , 1

P . commune X X 1 02P . c a m e m b e r t i G r 0 n A l p eP . c a m e m b e r t i DKP . c a m e m b e r t i BBP . c a m e m b e r t i P DP . commune F R R 2 1 6 0P . commune N R R L 6 4 9 7P . commune 1 3 9 7P . commune X 0 0 6P . commune MRA 5 4P . p a l i t a n s MAYO 1 2

++++++++++++++++++++++

+

++

++

+

+++

P . commune I M I 2 8 5 5 0 71 2 3+ + ++ + ++ -+

+ ++ -++ ++ -++ -++ + ++ -++ -++ -++ - ++ -++ + ++ -++ -++ + ++ -++ -++ -++ + +

P . commune X X 1 0 21++++++++++

T AB L E 3 - C o n t i n u e dR e f e r e nc e a n t i se r u mp r e c i p i t i n b a n d s f o r a :E x o a n t i g e n P . commune X X 1 0 2

1 2P . p a l i t a n s I M I 2 9 3 2 1 0 - +P . p a l i t a n s N R R L 2 0 3 3 +P . p a l i t a n s AMAS 4 + +P . s o l i t u m OF13 + +P . s o l i t u m G 1 , 2 +P . s o l i t u m A E b l e L M E , +P . s o l i t u m CBS 5 0 0 . 7 3 + +P . s o l i t u m N R R L 9 1 4 + +P . s o l i t u m JOSC 2 - +P . s o l i t u m FT LS 1 9 3 + +P . s o l i t u m BE 9 , 1 + +

a S y m b o l s : + , b a n d o f i d e n t i t y ; , b a n d o f p a r t i a l i d e n t i t y ; - , n o r e a c t i o n .

r e f e r e n c e a n t i g e n a n d h o m o l o g o u s a n t i s e r u m s a m p l e , wast e s t e d e i t h e r w i t h t h e h e t e r o l o g o u s a n t i g e n s b y I D ( F i g . 1 ) o rw i t h h e t e r o l o g o u s a n t i s e r a b y C I E I G ( F i g . 2 ) . T h e C I E I Gt e c h n i q u e was u s e d o n l y f o r t h e r e f e r e n c e s y s t e m s t o b e t t e rv i s u a l i z e common a n d s p e c i f i c a n t i g e n i c d e t e r m i n a n t s , w h i l et h e I D t e c h n i q u e was e x t e n d e d t o t h e e x o a n t i g e n s o b t a i n e df r o m a l l t h e s t r a i n s s t u d i e d . T h e t h r e e r e f e r e n c e s t r a i n s( c h e e s e i s o l a t e s f r o m D e n m a r k a n d F r a n c e a n d a s o i l [ l i c o -r i c e r o o t ] i s o l a t e f r o m T h a i l a n d ) p r o v e d t o b e a n t i g e n i c a l l yr e l a t e d o n t h e b a s i s o f n u m e r o u s c r o s s - r e a c t i o n s when t e s t e dr e c i p r o c a l l y ( T a b l e 2 ) . S t r i c t a n t i g e n i c r e l a t i o n s h i p s w e r ea l s o o b s e r v e d b y t h e r e a c t i o n o f a l l t h e e x o a n t i g e n s o f t h ei s o l a t e s c o n s i d e r e d i n t h i s s t u d y w i t h e a c h r e f e r e n c e a n t i -s e r u m s a m p l e ( T a b l e 3 ) . A f t e r a b s o r p t i o n o f e a c h a n t i s e r u ms a m p l e w i t h t h e h e t e r o l o g o u s r e f e r e n c e a n t i g e n s , o n l y P .commune X X 1 0 2 - a b s o r b e d a n t i s e r u m r e a c t e d w i t h i t s h o -m o l o g o u s a n t i g e n b y p r o d u c i n g a s p e c i f i c p r e c i p i t a t i n g b a n d( F i g . 3 ) . T h e a b s o r b e d ( s p e c i f i c ) r e f e r e n c e a n t i s e r u m s a m p l ew a s u s e d f o r t e s t i n g t h e e x o a n t i g e n s o b t a i n e d f r o m a l l t h ei s o l a t e s i n v e s t i g a t e d . B y t h e e x o a n t i g e n t e c h n i q u e ( F i g . 4 ) ,1 1 d i f f e r e n t i s o l a t e s ( w i l d - t y p e i s o l a t e s o f P . c o m m u n e , P .p a l i t a n s , a n d P . s o l i t u m b u t n o t P . c a m e m b e r t i ) c o u l d b ea s c r i b e d t o P . commune XX102 ( T a b l e 4 ) .T h e e x o a n t i g e n s o f a l l t h e i s o l a t e s i n v e s t i g a t e d b y t h eRPHPLC t e c h n i q u e ( F i g . 5 ) w e r e g r o u p e d i n t o n i n e d i f f e r e n t

2

+

+ F I G . 3 . S p e c i f i c i t y o f t h e I D t e c h n i q u e f o r P . c o m m u n e ( P .c a m e m b e r t i m u t a n t ) X X 1 0 2 . W e l l c o n t e n t s : C , a b s o r b e d r e f e r e n c ea n t i s e r u m ; 1 a n d 4 , r e f e r e n c e a n t i g e n ; 2 a n d 3 , P . c a m e m b e r t i I M I2 8 5 5 0 6 r e f e r e n c e a n t i g e n ; 5 a n d 6 , P . commune I M I 2 8 5 5 0 7 r e f e r -C o n t i n u e d e n c e a n t i g e n .

V O L . 5 3 , 1 9 8 7

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5/7

8 7 6 P O L O N E L L I E T A L .c l a s s e s ( T a b l e 5 ) b as e d o n q u a l i t a t i v e s i m i l a r i t i e s o f t h ec h r o m a t o g r a p h i c p e a k s , b u t q u a n t i t a t i v e d i f f e r e n c e s w e r en o t c o n s i d e r e d . C y c l o p i a z o n i c a c i d p r o d u c e r s w e r e p l a c e d i nc l a s s e s A , D , E , F , a n d H , w h i l e v i r i d i c a t i n p r o d u c e r s w e r ep l a c e d i n c l a s s e s B , C , G , a n d I .T h e f o u r t a x a d i s t i n g u i s h e d h e r e w e r e c l o s e l y r e l a t e d a n dw e r e d i f f i c u l t t o s e p a r a t e b y c l a s s i c a l t a x o n o m i c c h a r a c t e r -i s t i c s . P . c a m e m b e r t i i s o l a t e s h a d a l a n o s e c o l o n y t e x t u r e , ah i g h p r o p o r t i o n o f i r r e g u l a r p e n i c i l l i w i t h s m o o t h s t i p e s ,r a t h e r p o o r c o n i d i u m p r o d u c t i o n , a n d w h i t e c o n i d i a ( i n t w oi s o l a t e s , t h e y b e c a m e l i g h t g r a y i s h g r e e n w i t h a g e ) ; a n d t h e yo n l y o c c u r r e d o n c h e e s e . A l l o r s o m e o f t h e s e c h a r a c t e r i s t i c sh a v e b e e n i f o u n d i n i s o l a t e s o f a l l t h e o t h er t a x a a s w e l l ,h b w e v e r ( 0 . F i l t e n b o r g a n d J . C . F r i s v a d , u n p u b l i s h e do b s e r v a t i o n s ) , e s p e c i a l l y i n c h e e s e i s o l a t e s . P . communeh a d a l a n o s e o r o f t e n f i n e l y g r a n u l a r c o l o n y t e x t u r e , h y d r o -p h o b i c c o n i d i a w e r e p r o d u c e d ( i n l a r g e a m o u n t s i n m o s tc a s e s ) t h a t w e r e a g r e e n i s h g r a y t o o l i v a c e o u s g r a y o ro c c a s i o n a l l y d u l l g r e e n c o l o r , c o n i d i u m p r o d u c t i o n w a s p o o ro n YES a g a r , a n d a b r o w n t o b l a c k s o l u b l e p i g m e n t w a sp r o d u c e d i n YES a g a r . P . p a l i t a n s w a s c h a r a c t e r i z e d b y al a n o s e o r , m o r e o f t e n , f i n e l y g r a n u l a r c o l o n y t e x t u r e ; d a r kg r e e n t o d u l l g r e e n c o n i d i a ; h y d r o p h o b i c c o n i d i a p r o d u c e d i nm o d e r a t e a m o u n t s ; a c a d m i u m y e l l o w r e v e r s e ; a n d g o o dc o n i d i u m p r o d u c t i o n o n YE S a g a r . P . s o l i t u m h a d a l a n o s e ,f u n i c u l o s e , o r m o s t o f t e n , v e l u t i n o u s c o l o n y t e x t u r e ;h y d r o p h i l i c a n d v e r y d a r k g r e e n ( s o m e t i m e s w i t h a b l u i s he l e m e n t , e s p e c i a l l y o n YES a g a r ) c o n i d i a ; m o s t l y g o o d p o r u l a t i o n o n YES a g a r ; a n d a c a d m i u m y e l l o w t o o r a n g eo b v e r s e a n d r e v e r s e o n YE S a g a r . T h e l a s t t h r e e s p e c i e s h a da r a t h e r h i g h p r o p o r t i o n o f r o u g h - w a l l e d s t i p e s ( e x p e c i a l l y i ng o o d s p o r u l a t i n g s t r a i n s ) a n d o c c a s i o n a l l y h a d f i n e l y r o u g h -e n e d c o n i d i a .T h e f o u r t a x a w e r e a l s o c l o s e l y r e l a t e d w i t h r e g a r d t o t h e i rp r o d u c t i o n o f s e c o n d a r y m e t a b o l i t e s ( T a b l e 1 ) . C y c l o p i a -z o n i c a c i d w a s p r o d u c e d i n a l l t a x a e x c e p t f o r P . s o l i t u m a n do n e s t r a i n o f P . p a l i t a n s , w h i l e v i r i d i c a t i n w a s p r o d u c e d b yP . s o l i t u m a n d P . p a l i t a n s MAYO 1 2 . R u g u l o v a s i n e a n dc y c l o p a l d i c a c i d w e r e s p e c i f i c f o r P . c o m m u n e , w h i l ep a l i t a n t i n w a s s p e c i f i c f o r P . p a l i t a n s . P . c a m e m b e r t i w a sc h a r a c t e r i z e d b y i t s c o n s i s t e n t p r o d u c t i o n o f c y c l o p i a z o n i ca c i d a n d n o o t h e r s e c o n d a r y m e t a b o l i t e s , a n d P . s o l i t u m w a s

_ g F -

F I G . 4 . S p e c i f i c i t y o f ID e x o a n t i g e n t e c h n i q u e f o r P . commune( P . c a m e m b e r t i m u t a n t ) X X 1 0 2 . W e l l c o n t e n t s : C , a b s o r b e d a n t i -s e r u m ; 1 a n d 4 , r e f e r e n c e a n t i g e n ; 2 a n d 3 , P . c a m e m b e r t i P De x o a n t i g e n ; 5 a n d 6 , P . commune F R R 2 1 6 0 e x o a n t i g e n .

T AB L E 4 . R e l a t i o n s h i p s o f t h e p r e c i p i t i n b a n d p r o d u c e d b y P .commune XX102 a b s o r b e d a n t i s e r u m a n d e x o a n t i g e n s b y t h ei m m u n o d i f f u s i o n t e c h n i q u eE x o a n t i g e n R e a c t i o n '

P . commune XX102 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .P . c a m e m b e r t i I M I 2 8 5 5 0 6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .P . commune I M I 2 8 5 5 0 7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .P . c a m e m b e r t i G r 0 n A l p e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .P . c a m e m b e r t i DK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .P . c a m e m b e r t i B B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .P . c a m e m b e r t i PD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .P . commune F R R 2 1 6 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .P . commune N R R L 6 4 9 7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .P . commune 1 3 9 7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .P . commune X 0 0 6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .P . commune MRA 5 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .P . p a l i t a n s MAYO 1 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .P . p a l i t a n s I M I 2 9 3 2 1 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .P . p a l i t a n s N R R L 2 0 3 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .P . p a l i t a n s A M A S 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .P . s o l i t u m O F 1 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .P . s o l i t u m G 1 , 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .P . s o l i t u m i E b l e L M E 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .P . s o l i t u m CBS 5 0 0 . 7 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .P . s o l i t u m N R R L 9 1 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .P . s o l i t u m JOSC 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .P . s o l i t u m FT LS 1 9 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .P . s o l i t u m BE 9 , 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

+

+

+++++

++++

a S y m b o l s : + , b a n d o f i d e n t i t y ; - , n o r e a c t i o n .

c h a r a c t e r i z e d b y i t s p r o d u c t i o n o f f e w s e c o n d a r y m e t a b o -l i t e s , w h i l e P . p a l i t a n s a n d e s p e c i a l l y P . commune p r o d u c e da l a r g e n u m b e r o f d i f f e r e n t s e c o n d a r y m e t a b o l i t e s ( t h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h i c r e s u l t s w e r e r e p o r t e d h e r e ; HPLC r e s u l t sa r e t o b e p u b l i s h e d b y J . C . F r i s v a d ) .DISCUSSION

T h e r e s u l t s o b t a i n e d i n t h i s s t u d y s h o w t h a t t h e i s o l a t e st h a t w e r e i n v e s t i g a t e d a r e s t r i c t l y a n t i g e n i c a l l y r e l a t e d . Bya b s o r p t i o n o f r e f e r e n c e a n t i s e r u m w i t h t h e h e t e r o l o g o u sa n t i g e n s , i t was p o s s i b l e t o d i f f e r e n t i a t e t h e w i l d - t y p e b a c km u t a n t f r o m F r e n c h b r i e c h e e s e P . commune XX102 f r o m P .c a m e m b e r t i s t a r t e r c u l t u r e s . T h i s i s v e r y i m p o r t a n t , a s t h ew i l d t y p e p r o d u c e d s e v e r a l s e c o n d a r y m e ta b o l i t e s w i t hd i f f e r e n t p h a r m a c o l o g i c a l a n d t o x i c o l o g i c a l e f f e c t s( c y c l o p a l d i c a c i d , c y c l o p o l i c a c i d , r u g u l o v a s i n e s A a n d B ) ,w h i c h a r e u n d e s i r a b l e i n c h e e s e . Two p r e c i p i t i n b a n d s( b a n d s 1 a n d 2 ) w e r e p r o d u c e d d i f f e r e n t l y when P . communeXX102 r e f e r e n c e a n t i s e r u m r e a c te d w i t h t h e e x o a n t i g e n so b t a i n e d f r o m t h e P . c a m e m b e r t i i s o l a t e s i n v e s t i g a t e d i n t h i ss t u d y ( T a b l e 3 ) . P r e c i p i t i n o g e n 2 p r o v e d t o b e s p e c i f i c f o ri s o l a t e s r e f e r r e d t o a s P . commune X X 1 0 2 , a s i t w a s t h e o n eo b s e r v e d a f t e r a b s o r p t i o n ( T a b l e 4 ) . T h e m o r e d e t a i l e dg r o u p i n g o b t ai n e d b y RPHPLC a n a l y s i s o f t h e e x o a n t i g e n sc o r r e l a t e s p e r f e c t l y w i t h t h e I D r e s u l t s . A l l t h e e x o a n t i g e n st h a t r e a c t e d w i t h t h e a b s o r b e d P . commune X X 1 0 2 - s p e c i f i ca n t i s e r u m g r o u p e d i n t o h o m o g e n e o u s c h r o m a t o g r a p h i cc l a s s e s ( c l a s s e s C , D , E , G , H , a n d I ) . E v e n t h o u g h t h eX X 1 0 2 - s p e c i f i c a n t i g e n w a s n o t p r e s e n t i n P . c a m e m b e r t i ,i n d i c a t i n g t h e p o s s i b i l i t y o f d e t e c t i n g u n d e s i r a b l e b a c k mu-t a t i o n s i n w h i t e c h e e s e s t a r t e r c u l t u r e s , i t w a s o n l y p r e s e n t i nsome i s o l a t e s o f t h e w i l d - t y p e s p e c i e s ( P . c o m m u n e , P .p a l i t a n s , a n d P . s o l i t u m ) . A l l s t r a i n s f r o m c h e e s e (FRR 2 1 6 0 ,X006, I M I 2 9 3 2 1 0 , a n d X X 1 0 2 ) c o n t a i n e d t h e XX102 a n t i -g e n , h o w e v e r .

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .

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ANTIGENIC CHARACTERIZATION O F P . CAMEMBERTI 8 7 7

A2 20A~1 0 . 2 Me'

I ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 1 1 5 t itime ( m i n )

F I G . 5 . R e v e r s e d p h a s e h i g h - p r e s s u r e l i q u i d c h r o m a t o g r a m s o f e x o a n t i g e n s w i t h i n t h e P . c a m e m b e r t i , P . c o m m u n e , P . p a l i t a n s , a n d P .s o l i t u m c o m p l e x ( s e e T a b l e 5 f o r t h e member s t r a i n s o f e a c h g r o u p ) s u b d i v i d e d i n t o n i n e g r o u p s , A t o I . I n p a n e l E , t h e b a r i n d i c a t e s t h ea b s o r b a n c e u n i t ( 0 . 2 ) ; t h e a b s c i s s a i n d i c a t e s t h e m i n u t e s o f a n a l y s i s , a n d t h e d i a g o n a l l i n e r e p r e s e n t s t h e c h r o m a t o g r a p h i c g r a d i e n t a p p l i e d .M e , M e r t h i o l a t e .E v e n t h o u g h t h e i s o l a t e s t r e a t e d i n t h i s s t u d y w e r e c o l -l e c t e d f r o m w i d e l y d i f f e r e n t s o u r c e s a n d g e o g r a p h i c r e g i o n s ,t h e y w e r e a l l a n t i g e n i c a l l y r e l a t e d , i n d i c a t i n g t h a t P . c o m -mune i s t h e w i l d - t y p e s p e c i e s o f t h e d o m e s t i c a t e d f o r m o f P .c a m e m b e r t i a n d h a s a c l o s e r e l a t i o n s h i p w i t h P . p a l i t a n s a n dP . s o l i t u m , a s p r o p o s e d b y F r i s v a d ( 6 ) . H e r m a n s e n e t a l . ( 9 )i n c l u d e d b o t h P . commune a n d P . p a l i t a n s ( a s P . camem-b e r t i c h e m o t y p e I I ) i n o n e s p e c i e s a n d a n i s o l a t e o f P .commune ( P . t e r r e s t r e A TCC 3 2 0 2 8 ) c l u s t e r e d w i t h P .s o l i t u m ( P . m e l a n o c h l o r u m ) ; t h e y w e r e c l e a r l y s e p a r a t e d

f r o m P . c r u s t o s u m i n a p y r o l y s i s g a s c h r o m a t o g r a p h i c s t u d y( 2 0 ) . T h e c y c l o p i a z o n i c a c i d p r o d u c e r s i n t h i s g r o u p o fc h e e s e m o l d s a r e a l l v e r y c l o s e l y r e l a t e d a n d c o u l d b er e g a r d e d a s o n e s p e c i e s . T h i s i s n o t t o b e r e c o m m e n d e d ,h o w e v e r , a s t h e y a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t t o x i c o l o g i c a l l y . Av e r y s i m i l a r s i t u a t i o n e x i s t s i n t h e s u b g e n u s C i r c u m d a t is e c t i o n F l a v i o f t h e g e n u s A s p e r g i l l u s . E v e n t h o u g h A . f l a v u sa n d A . p a r a s i t i c u s a n d t h e i r r e s p e c t i v e d o m e s t i c a t e d f o r m sA . o r y z a e a n d A . s o j a e c a n b e r e g a r d e d a s o n e s p e c i e s b a s e do n t h e i r h i g h n u c l e i c a c i d r e l a t e d n e s s ( 7 2 t o 1 0 0 % DNA-DNA h o m o l o g y ) ( 1 2 ) , i t i s i m p o r t a n t t o k e e p t h e s e t a x as e p a r a t e d ( 1 1 ) : A . f l a v u s a n d A . p a r a s i t i c u s a r e h i g h l y

t o x i g e n i c f o r m s , w h i l e A . o r y z a e a n d A . s o j a e a r e u s e d i nf o o d f e r m e n t a t i o n s . A h i g h s e r o l o g i c a l r e l a t e d n e s s amongt h e s e s p e c i e s was e v i d e n t f r o m t h e r e s u l t s o f s t u d i e s o fP o l o n e l l i e t a l . ( 1 6 ) , b u t e a c h s p e c i e s h a d s p e c i f i c e x o a n -t i g e n s a s w e l l . K l i c h a n d P i t t ( 1 1 ) s h o w e d t h a t i t i s i n d e e dp o s s i b l e t o d i f f e r e n t i a t e t h e s e s p e c i e s b y c l a s s i c a l m o r p h o -l o g i c a l c r i t e r i a . C u r i o u s l y , t h e a b i l i t y t o p r o d u c e c y c l o -p i a z o n i c a c i d i s m a i n t a i n e d i n t h e d o m e s t i c a t e d f o r m s o f A .f l a v u s a n d P . commune ( A . o r y z a e a n d P . c a m e m b e r t i ,r e s p e c t i v e l y ) , w h i l e t h e a b i l i t y t o p r o d u c e o t h e r t o x i n s i sa p p a r e n t l y c o m p l e t e l y l o s t i n t h e d o m e s t i c a t e d f o r m s .I t i s i m p o r t a n t t o d i f f e r e n t i a t e n o t o n l y s p e c i e s b u t a l s oi n d i v i d u a l s t r a i n s , p o p u l a t i o n s , o r v e r y r e l a t e d g r o u p s o fs t r a i n s when d e a l i n g w i t h f e r m e nt a t i o n c u l t u r e s l i k e P .c a m e m b e r t i a n d P . r o q u e f o r t i . E n g e l a n d T e u b e r ( 3 ) s h o w e dt h a t P . r o q u e f o r t i s t r a i n s c a n b e d i f f e r e n t i a t e d b y t h e t h i n -l a y e r c h r o m a t o g r a p h i c p a t t e r n s o f t h e i r s e c o n d a r y m e t a b o -l i t e s . T h i s i s n o t p o s s i b l e i n P . c a m e m b e r t i , a s c y c l o p i a z o n i ca c i d i s t h e o n l y d e t e c t a b l e s e c o n d a r y m e t a b o l i t e i n t h a ts p e c i e s . T h e r e s u l t s o f t h i s s t u d y h a v e shown t h a t P .c a m e m b e r t i a n d P . commune s t r a i n s o r g r o u p s o f r e l a t e ds t r a i n s c a n b e d i f f e r e n t i a t e d b y t h e i r p r o f i l e o f e x o a n t i g e n s ,

VOL. 5 3 , 1 9 8 7

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7/7

8 7 8 P O L O N E L L I E T A L .TABLE 5 . G r o u p i n g o f c h e e s e p e n i c i l l i a a c c o r do f e x o a n t i g e n s aG r o u p S p e c i e sA P . c a m e m b e r t i

P. commune

P . p a l i t a n sP . s o l i t u m

c

D

P. solitum

P. commune

P. p a l i t a n sEFGHI

See Fig. 5.

P. commune

P. commune

P. p a l i t a n sP. p a l i t a n sP. s o l i t u m

i n g t o R PHPLCS t r a i n ( s )

I M I 2 8 5 5 0 6G r 0 n A l p eDKBBP DXX102I M I 2 8 5 5 0 7NRRL 6 4 9 7NRRL 2 0 3 3O F 1 3G 1 , 2A E b l e L M E ,FTLS 1 9 3CBS 5 0 0 . 7 3JOSC 2BE 9 , 1X 0 0 6MRA 5 4I M I 2 9 3 2 1 0FR 2 1 6 0Q u i n t . 1 3 9 7MAYO 1 2AMAS 4NRRL 9 1 4

as d e t e r m i n e d b y RPHPLC. S e r o l o g i c a l m e t h o d s c an b eu s e d i n t h e c o n t r o l o f c o n i d i u m s t a r t e r c u l t u r e p r e p a r a t i o n so f P . c a m e m b e r t i a n d P . r o q u e f o r t i . P . commune a n d P .p a l i t a n s ar e t h e most common c o n t a m i n a n t s i n t h e s ec o n i d i u m p r e p a r a t i o n s ( F i l t e n b o r g a n d F r i s v a d , u n p u b l i s h e do b s e r v a t i o n s ) . C o n t a m i n a t i n g c o n i d i a may b e d i f f i c u l t t od e t e c t i n s t a r t e r c u l t u r e c o n i d i u m p r e p a r a t i o n s , as t h e yo c c u r i n s m a l l c o n c e n t r a t i o n s ( 2 , 2 2 ) , b u t m e t h o d s b a s e d ons p e c i f i c a n t i b o d i e s ( e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y )c o u l d b e d e v e l o p e d f o r t h i s purpose, b a s e d on t h e r e s u l t sr e p o r t e d h e r e .

ACKNOWLEDGMENTT h i s s t u d y wa s s u p p o r t e d b y a g r a n t f r o m t h e M i n i s t e r o P u b b l i c aI s t r u z i o n e 4 0 % - 8 4 / 8 5 P r o g e t t o " M e c c a n i s m i c e l l u l a r i d i t o s s i c i t a ' al i v e l l o d i o r g a n i e s i s t e m i . "

L I T E R A T U R E CIT ED1 . A x e l s e n , N . H . , J . K r o l l , a n d B . W e e k e . 1 9 7 3 . A m a n u a l o fq u a n t i t a t i v e i m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s . M e t h o d s a n d a p p l i c a t i o n .S c a n d . J . I m m u n o l . v o l . 2 ( S u p p l . 1 ) .2 . E n g e l , G . , a n d M. T e u b e r . 1 9 7 8 . S i m p l e a i d i n t h e i d e n t i f i c a t i o no f P e n i c i l l i u m r o q u e f o r t i Thom. G r o w t h i n a c e t i c a c i d . E u r . J .A p p l . M i c r o b i o l . 6 : 1 0 7 - 1 1 1 .3 . E n g e l , G . , a n d M. T e u b e r . 1 9 8 3 . D i f f e r e n t i a t i o n o f P . r o q u e f o r t i

s t r a i n s b y t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y o f m e t a b o l i t e s . M i l c h w i s -s e n s c h a f t 3 8 : 5 1 3 - 5 1 6 .4 . F r i s v a d , J . C . 1 9 8 3 . A s e l e c t i v e a n d i n d i c a t i v e medium f o rg r o u p s o f P e n i c i l l i u m v i r i d i c a t u m p r o d u c i n g d i f f e r e n t m y c o -t o x i n s i n c e r e a l s . J . A p p l . B a c t e r i o l . 5 4 : 4 0 9 - 4 1 6 .5 . F r i s v a d , J . C . 1 9 8 5 . C r e a t i n e s u c r o s e a g a r , a d i f f e r e n t i a l m e d i u mf o r m y c o t o x i n p r o d u c i n g t e r v e r t i c i l l a t e P e n i c i l l i u m s p e c i e s .L e t t . A p p l . M i c r o b i o l . 1 : 10 9 - 1 13 .6 . F r i s v a d , J . C . 1 9 8 5 . P r o f i l e s o f p r i m a r y a n d s e c o n d a r y m e t a b o -l i t e s o f v a l u e i n c l a s s i f i c a t i o n o f P e n i c i l l i u m v i r i d i c a t u m a n dr e l a t e d s p e c i e s , p . 3 1 1 - 3 2 5 . I n R . A . S a m s o n a n d J . I . P i t t ( e d . ) ,A d v a n c e s i n P e n i c i l l i u m a n d A s p e r i g i l l u s s y s t e m a t i c s . P l e n u mP u b l i s h i n g C o r p . , N ew Y o r k .7 F r i s v a d , J . C . 1 9 8 6 . T a x o n o m i c a p p r o a c h e s t o m y c o t o x i n i d e n -t i f i c a t i o n , p . 4 1 5 - 4 5 7 . I n R . J . C o l e ( e d . ) , M o d e r n m e t h o d s i nt h e a n a l y s i s a n d s t r u c t u r e e l u c i d a t i o n o f m y c o t o x i n s . A c a d e m i cP r e s s , I n c . , N ew Y o r k .8 . F r i s v a d , J . C . , a n d 0 . F i l t e n b o r g . 1 9 8 3 . C l a s s i f i c a t i o n o ft e r v e r t i c i l l a t e p e n i c i l l i a b a s e d on p r o f i l e s o f m y c o t o x i n s a n do t h e r s e c o n d a r y m e t a b o l i t e s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 6 :1 3 0 1 - 1 3 1 0 .9 . H e r m a n s e n , K . , J . C . F r i s v a d , C . E m b o r g , a n d J . H a n s e n . 1 9 8 4 .C y c l o p i a z o n i c a c i d p r o d u c t i o n b y s u b m e r g e d c u l t u r e s o fP e n i c i l l i u m a n d A s p e r g i l l u s s t r a i n s . F E M S M i c r o b i o l . L e t t .2 1 : 2 5 3 - 2 6 1 .1 0 . K a u f m a n , L . , a n d P . G . S t a n d a r d . 1 9 7 8 . I m p r o v e d v e r s i o n o f t h ee x o a n t i g e n t e s t f o r t h e i d e n t i f i c a t i o n o f C o c c i d i o i d e s i m m i t i s a n dH i s t o p l a s m a c a p s u l a t u m c u l t u r e s . J . C l i n . M i c r o b i o l . 8 : 4 2 - 4 5 .1 1 . K l i c h , M . , a n d J . I . P i t t . 1 9 8 5 . T h e t h e o r y a n d p r a c t i c e o fd i s t i n g u i s h i n g s p e c i e s o f t h e A s p e r g i l l u s f l a v u s g r o u p , p .2 1 1 - 2 2 0 . I n R . A . S a m s o n a n d J . I . P i t t ( e d . ) , A d v a n c e s i nP e n i c i l l i u m a n d A s p e r g i l l u s s y s t e m a t i c s . P l e n u m P u b l i s h i n gC o r p . , N ew Y o r k .1 2 . K u r t z m a n , C . P . 1 9 8 5 . C l a s s i f i c a t i o n o f f u n g i t h r o u g h n u c l e i ca c i d r e l a t e d n e s s , p . 2 3 3 - 2 5 3 . I n R . A . S a m s o n a n d J . I . P i t t ( e d . ) ,A d v a n c e s i n P e n i c i l l i u m a n d A s p e r g i l l u s s y s t e m a t i c s . P l e n u mP u b l i s h i n g C o r p . , N ew Y o r k .1 3 . P a l m e r , D . F . , L . K a u f m a n , W. K a p l a n , a n d J . J . C a v a l l a r o .1 9 7 8 . S e r o d i a g n o s i s o f m y c o t i c d i s e a s e s . C h a r l e s C T h o m a s ,P u b l i s h e r , S p r i n g f i e l d , I l l .1 4 . P i t t , J . I . 1 9 7 9 . T h e g e n u s P e n i c i l l i u m a n d i t s t e l e o m o r p h i cs t a t e s E u p e n i c i l l i u m a n d T a l a r o m y c e s . A c a d e m i c P r e s s , I n c . ,N ew Y o r k .

1 5 . P o l o n e i l i , L . , a n d G . M o r a c e . 1 9 8 4 . R a p i d i m m u n o i d e n t i f i c a t i o no f f u n g i c u l t u r e s , p . 2 0 3 - 2 1 9 . I n A . S a n n a a n d G . M o r a c e ( e d . ) ,N ew h o r i z o n s i n m i c r o b i o l o g y . E l s e v i e r S c i e n c e P u b l i s h e r s ,A m s t e r d a m .1 6 . P o l o n e l l i , L . , D . O r s i n i , M. C a s t a g n o l a , a n d G . M o r a c e. 1 9 8 4 .S e r o l o g i c a l i d e n t i f i c a t i o n o f a f l a t o x i n p o t e n t i a l l y p r o d u c i n gA s p e r g i l l u s s p e c i e s . L ' I g i e n e M o d e r n a 8 1 : 1 1 2 8 - 1 1 3 6 .1 7 . S a m s o n , R . A . 1 9 8 5 . T a x o n o m i c c o n s i d e r a t i o n s o f h a r m f u l a n db e n e f i c i a l m o u l d s i n f o o d , p . 1 5 7 - 1 6 3 . I n T . K u g a , K . T e r a o , M.Y a m a z a k i , M . M i y a j i , a n d T . U n e m o t o ( e d . ) , F i l a m e n t o u sm i c r o o r g a n i s m s : b i o m e d i c a l a s p e c t s . J a p a n e s e S c i e n t i f i c S o c i -e t y P r e s s , T o k y o1 8 . S a m s o n , R . A . , C . E c k a r d t , a n d R . O r t h . 1 9 7 7 . T h e t a x o n o m y o fP e n i c i l l i u m s p e c i e s f r o m f e r m e n t e d c h e e s e s . A n t o n i e v a nL e e u w e n h o e k J . M i c r o b i o l . S e r o l . 4 3 : 3 4 1 - 3 5 0 .1 9 . S a m s o n , R . A . , A . C . S t o l k , a n d R . H a d l o k . 1 9 7 6 . R e v i s i o n o f t h es u b s e c t i o n f a s c i c u l a t a o f P e n i c i l l i u m a n d some a l l i e d s p e c i e s .S t u d . M y c o l . B a a r n 1 1 : 1 - 4 7 .2 0 . S o d e r s t r o m , B . , a n d J . C . F r i s v a d . 1 9 8 4 . S e p a r a t i o n o f c l o s e l yr e l a t e d a s y m m e t r i c p e n i c i l l i a b y p y r o l y s i s g a s c h r o m a t o g r a p h ya n d m y c o t o x i n p r o d u c t i o n . M y c o l o g i a 7 6 : 4 0 8 - 4 1 9 .2 1 . T h o m , C . 1 9 1 0 . C u l t u r a l s t u d i e s o f s p e c i e s o f P e n i c i l l i u m . U . S .D e p t . A g r i c . B u r . A n i m . I n d . B u l l . 1 1 8 : 1 - 1 0 9 .2 2 . V e a u , P . , R . A . S a m s o n , a n d A . B r e t o n . 1 9 8 1 . E t u d e c o m p a r e ed e P e n i c i l l i u m r o q u e f o r t i a n d P . v e r r u c o s u m v a r . c y c l o p i u m .L a i t 6 1 : 3 7 0 - 3 8 0 .

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .