View
0
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
การทําเอนไซมใหบรสิุทธ์ิ
นลิน วงศขัตติยะเทคโนโลยีชีวภาพ คณะวิทยาศาสตร
มหาวิทยาลัยแมโจ
ทําไมตองทําเอนไซมใหบริสุทธิ์
ทําไมตองทําใหบริสุทธิ์
เพื่อทราบการทํางานของเอนไซม-ทราบเมตาบอลิซึม และวิถีของเอนไซม, จะไดรูปฏิกิริยา ไคเนติกส การควบคุมการทํางาน
หากทราบการทํางานในภาวะปกติแลว เมื่อมีภาวะไมปกติจะไดแกไขและทราบขอมูลไดตรงจุด เชน ภาวะไมมีเอนไซม แลคเตส ยอยนม
สามารถออกแบบยา ที่เปน 3D structure ได
เพิ่มมูลคาใหตัวเอนไซม เปนยา
อื่นๆอีกมากมาย
Vdo Tipranavir
Enzyme/protein purification
สกัดเอนไซมจากไหน?
เซลลพืช เซลลสัตว เซลลจุลินทรีย น้ําเลี้ยงเซลล subcellular fractions (e.g. mitochondria, membranes)
ทําอยางไรใหคงสภาพกิจกรรมของเอนไซมเหมือนเดิม
Physical boundaries of protein stability
pH, Temperature, salt concentration, oxygen sensitivity, storage, mechanical forces
ทําเอนไซมใหบริสุทธิ์มีขั้นตอนอยางไร
สกัดเอนไซมใหออกมาอยูในรูปของของเหลว
ทําเอนไซมใหบริสุทธิ์ดวยขั้นตอนการแยกสารตางๆ
ตรวจสอบความบริสุทธิ์ของเอนไซม
ทําเอนไซมใหอยูในรูปของเหลวไดอยางไรDisruption and homogenization of cells, tissue, etc
ใชเทคนิคตางๆ เชน shearing, grinding, sonication,
French pressure cell disruption
Isolation of organelles; solubilization of membranes
Excreted proteins
เอนไซมจากธรรมชาติอาจจะมีนอย ทําใหเพิ่มขึ้นไดอยางไรRecombinant DNA technology is a very useful tool for
protein purification
for 'overproduction' of proteins using expression vectors
for application of 'tags' to proteins
for excretion of proteins into the culture medium
Protein purification - Aims
Sufficient purity and quantity
Maintained biological activity
Fast and simple
Good economy
Enzyme/protein purificationแลวจะวัดคาอะไรบาง
How is purification measured?
Specific activity
Purification table
Physical methods: SDS-PAGE, gel filtration
Purification table Total amount of enzyme (U):
Activity (U.ml-1) x volume (ml)
Specific activity (U.mg-1):
Activity (U.ml-1) / protein content (mg.ml-1)
Purification fold:
Specific activity of enzyme after a purification step / specific activity before that step
%recovery
Activity x 100/activity at the initial step
Enzyme/protein purificationวิธีทําใหโปรตีนบริสุทธิ์
1. Precipitation methods
2. Separation based on molecular size
3. Separation based on charge
4. Separation based on specific interaction with other biomolecules
5. Separation based on other principles
ตัวอยาง
1. Ammonium sulfate precipitation
2. Gel filtration
3. Ion-exchange chromatography
4. Bio-affinity chromatography
5. Hydrophobic interaction chromatography
การตรวจสอบความบริสุทธิ์ของเอนไซม
Quantitation of total protein
Spectrophotometry method
Chemical method
Lowry method
Bardford method
Assay of enzymatic activity
Substrate reduction
Product production
Ammonium sulfate precipitation
การละลายของโปรตีนจะเปลี่ยนแปลงไปตามความเขมขนของประจุ (ionic strength ซึ่งแปลงาย ๆ วาความเขมขนของประจุ) และความเขมขนของเกลือในสารละลาย โดยการละลายของโปรตีนเพิ่มขึ้นเมื่อใชความเขมขนของเกลือต่ํา ๆ เรียกปรากฏการณนี้วา การเพิ่มการละลายดวยเกลือปริมาณนอย (salting-in) แตเมื่อเพิ่มความเขมขนของประจุหรือเพิ่มความเขมขนของเกลือ การละลายของโปรตีนจะเริ่มลดลง และที่ความเขมขนของประจุสูง ๆ การละลายของโปรตีนจะลดลงจนถึงจุดที่โปรตีนตกตะกอนเกือบสมบูรณในสารละลาย ปรากฏการณนี้เรียกวา การตกตะกอนดวยความเขมขนของเกลือที่ใสลงไปในสารละลาย (salting-out)
โปรตีนกับไอออนของเกลือเขาแยงจับโมเลกุลอิสระของน้ํา กลาวคือ ที่ความเขมขนของเกลือสูง ๆ พันธะโมเลกุลของน้ําจะถูกจับดวยไอออนของเกลือเปนสวนใหญ พันธะโมเลกุลของน้ําจึงไมเพียงพอที่จะจับกับโปรตีน ทําใหโปรตีนจับกันเองมากกวาจับกับโมเลกุลของน้ํา และตกตะกอนในสารละลาย
What do you need to do?
What technique do you want to use?
Ion exchange
Size exclusion
Hydrophobic interaction
Affinity
Ion exchange chromatography
Separates compounds based on their charges
Resin type Cation exchanger Anion exchanger
Net charge of compound of interest
+ -
Charge of resin - +
Size exclusion chromatographyGel filtration (by size)
Size exclusion chromatography/gel filtration
Separates molecules by size
Hydrophobic interaction chromatography
Separates molecules based on their hydrophobicity
Affinity chromatography
The desired molecules bind to the matrix-bound ligand while other components of the mixture that have no affinity for the ligand are washed through the column
Recommended